КОМПОЗИЦИИ ВЕКТОРА AAV И СПОСОБЫ ПЕРЕНОСА ГЕНОВ В КЛЕТКИ, ОРГАНЫ И ТКАНИ

Информация о родственных заявках

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки с серийным № 61/600415, зарегистрированной 17 февраля 2012 года, и заявка явным образом полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

Введение

[0002] Генетические нарушения, обусловленные отсутствием или дефектом желаемого гена (потерей функции) или экспрессией нежелательного или дефектного гена или (приобретения функции), приводят к ряду заболеваний. Одним из примеров генетического нарушения потери функции является гемофилия, наследственное нарушение свертываемости крови, обусловленное дефицитом фактора свертывания VIII (FVIII, гемофилия A) или фактора IX (FIX, гемофилия B). Одним из примеров генетического нарушения с приобретением функции является болезнь Хантингтона, заболевание, обусловленное патологическим геном "HTT" (кодирующим белок хантингтин), кодирующий мутантный белок, который накапливается в нейронах и приводит к их постепенному разрушению, в частности в базальных ганглиях и коре головного мозга.

[0003] Существующее в настоящее время лечение гемофилии заключается во внутривенном введении рекомбинантного фактора свертывания крови при необходимости в случае возникновения кровотечения или профилактически. Однако такой терапевтический подход имеет несколько недостатков, таких как необходимость повторных инфузий, стоимость лечения, риск развития иммунных реакций против терапевтического фактора и риск потенциально смертельных кровотечений. Эти ограничения приводят к необходимости разработки видов генной терапии гемофилии. Для этой цели гемофилия является идеальной для терапии на основе переноса генов вследствие того, что 1) терапевтическое окно является очень широким, так как уровни немного выше 1% от нормы уже могут приводить к изменению фенотипа от тяжелого до умеренного, и уровни 100% не ассоциированы с какими-либо побочными эффектами, 2) тканеспецифическая экспрессия терапевтического трансгена не является строго необходимой, и 3) накоплен значительный опыт измерения конечных точек терапевтической эффективности. Кроме того, было продемонстрировано, что экспрессия в печени фактора свертывания крови индуцирует иммунологическую толерантность к самому фактору свертывания крови, снижая вероятность потенциально вредных иммунных ответов против фактора свертывания крови.

[0004] В настоящее время векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) признаны как предпочтительные векторы для переноса генов, так как они обладают лучшим профилем безопасности и эффективности для доставки генов in vivo. Из серотипов AAV, выделенных к настоящему времени, AAV2 и AAV8 использовали для направленной доставки в печень у людей, страдающих тяжелой гемофилией B. Оба вектора работали эффективно, и в случае AAV8 была документально подтверждена длительная экспрессия терапевтического трансгена. Недавние данные, полученные на людях, демонстрировали, что направленная доставка в печень вектора AAV приводит к длительной экспрессии трансгена FIX на терапевтических уровнях.

[0005] Несмотря на то, что эти данные являются обнадеживающими, идентификация серотипов AAV с высоким тропизмом к печени и низкой частотой положительных серологических реакций у людей (естественных хозяев AAV дикого типа) является основополагающей для 1) получения терапевтических уровней экспрессии трансгена в печени при наиболее низкой возможной дозе вектора для снижения риска вызывания иммунных ответов против капсиды AAV, и для того, чтобы 2) альтернативные серотипы AAV с уникальной частотой положительных серологических реакций обеспечивали возможность лечения таких популяций пациентов, для которых по иным причинам перенос гена AAV является неподходящим вследствие существующего гуморального иммунитета к AAV. Изобретение решает эти потребности и обеспечивает дополнительные преимущества.

Сущность изобретения

[0006] Изобретение относится к вектору аденоассоциированного вируса (AAV) серотипа AAV-Rh74 и соответствующим векторам AAV. Такие векторы включают AAV-Rh74, который обеспечивает направленную доставку в гепатоциты печени наряду с другими типами клеток. В качестве вектора для доставки полинуклеотидной последовательности AAV-Rh74 и соответствующие векторы AAV регулируют экспрессию полинуклеотида в клетках. Полинуклеотиды, которые кодируют белки, такие как белки для терапевтических применений, могут экспрессироваться на терапевтических уровнях после введения. Кроме того, перенос полинуклеотида, опосредованный AAV-Rh74 и соответствующим вектором AAV, обеспечивал уровни экспрессии белка, которые являлись значительно выше, чем некоторые другие серотипы, исследуемые в настоящее время в доклинических и клинических условиях (см., например, фигуры 1 и 2). В частности, AAV-Rh74 может направленно доставлять полинуклеотиды в печень с эффективностью, по меньшей мере сравнимой или превосходящей золотой стандарт для трансдукции печени AAV8 у мышей и у собак с гемофилией B. Таким образом, AAV-Rh74 можно использовать для доставки полинуклеотидов, таких как кодирующие ген последовательности, для экспрессии белков, которые обеспечивают желаемое или терапевтическое действие, а также для ингибирования нуклеотидов, которые снижают или ингибируют экспрессию нежелательного или дефектного гена, таким образом обеспечивая лечение ряда заболеваний. Например, AAV-Rh74 можно использовать для доставки терапевтических генов (например, FIX, FVIII) для лечения гемофилии A, B и для доставки генов для широкого спектра других состояний метаболического дефицита или дефицита белков плазмы или для доставки генов для других терапевтических целей, таких как, но не ограничиваясь ими, ген, кодирующий нуклеазы цинкового пальца для проведения редактирования генома в печени и для локальной (в печень) доставки иммуномодулирующих средств, таких как альфа-интерферон, для лечения инфекций вируса гепатита или для лечения практически любого заболевания, для которого необходима трансдукция печени или наличие терапевтического продукта трансгена в кровотоке (которое можно получать направленной доставкой трансгенов для экспрессии в печени).

[0007] Наряду с эффективной доставкой полинуклеотидов AAV-Rh74 и соответствующими векторами в клетки in vitro, ex vivo и in vivo частота встречаемости антител к AAV-Rh74 у людей ниже по сравнению с антителами к AAV2 и отличается от частоты встречаемости антител к AAV8 (таблица 1). Вследствие низкой частоты положительных серологических реакций AAV-Rh74 и соответствующие векторы можно использовать у большего процента людей, для которых по иным причинам перенос генов является неподходящим, например, у людей, которые могут являться серопозитивными по другим серотипам AAV (например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и т.д.). Кроме того, AAV-Rh74 можно эффективно получать в высоких титрах (таблица 2). Таким образом, AAV-Rh74 и соответствующие векторы можно получать в больших количествах для более распространенных клинических заболеваний.

[0008] Изобретению относится к способам доставки или переноса гетерологичной полинуклеотидной последовательности млекопитающему или в клетку млекопитающего. В одном из вариантов осуществления способ включает введение вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), который содержит гетерологичную полинуклеотидную последовательность, млекопитающему или в клетку млекопитающего в подходящих условиях для доставки или переноса гетерологичной полинуклеотидной последовательности млекопитающему или в клетку млекопитающего, таким образом обеспечивая доставку или перенос гетерологичного полинуклеотида. В одном из аспектов способ обеспечивает перенос/доставку гетерологичного полинуклеотида млекопитающему и/или в клетку. В другом аспекте способ обеспечивает перенос/доставку гетерологичного полинуклеотида млекопитающему и/или в клетку и последующую транскрипцию гетерологичного полинуклеотида, таким образом получая транскрипт. В дополнительном аспекте способ обеспечивает перенос/доставку гетерологичного полинуклеотида в клетку, последующую транскрипцию с образованием транскрипта и последующую трансляцию с образованием продукта гена (белка). В частности, например, в последних двух аспектах гетерологичная полинуклеотидная последовательность является функционально связанной с регуляторным элементом экспрессии, обеспечивающим транскрипцию гетерологичной полинуклеотидной последовательности и необязательно последующую трансляцию транскрипта.

Описание чертежей

[0009] На фигуре 1 представлены уровни в плазме фактора IX (FIX) человека у мышей C57BL/6 (n=5 в группе), которым инъецировали в хвостовую вену векторы AAV, экспрессирующие трансген FIX под контролем печеньспецифического промотора. Доза вектора - 2,5¹⁰ геномов вектора на мышь. Уровни продукта трансгена FIX (белок FIX) в плазме измеряли ELISA через 1, 2 и 4 недели после переноса гена. AAV-Rh74 обеспечивал наиболее высокие уровни экспрессии трансгена FIX.

[0010] На фигуре 2 представлены уровни в плазме FIX собак у страдающих гемофилией B собак после доставки 3¹² геномов вектора на килограмм (кг) массы. Векторы AAV вводили внутривенно (в/в) через подкожную вену и проводили мониторинг уровней FIX посредством ELISA. Экспрессия терапевтического трансгена FIX направлялась печеньспецифическим промотором. Векторы AAV8 и AAV-Rh74 действовали примерно одинаково у собак с гемофилией B, и оба превосходили AAV6.

[0011] На фигуре 3 представлены аминокислотные последовательности AAV-Rh74 VP1, VP2 и VP3 и полинуклеотидная (ДНК) последовательность (SEQ ID NO: 1-4) для VP1.

[0012] На фигуре 4 представлено введение векторов AAV8 и AAVrh74, экспрессирующих фактор IX (FIX) человека (под контролем печеньспецифического промотора) макакам-резус, не являющимся человекоподобными приматами, и экспрессия FIX у животных. У животных, получавших векторы AAVrh74-FIX (два последних столбика к правому краю), трансген FIX экспрессировался на более высоких уровнях по сравнению с другими группами животных, которым проводили инъекции в аналогичных дозах.

Подробное описание

[0013] Изобретение основано по меньшей мере частично на данных, указывающих на то, что серотип AAV-Rh74 аденоассоциированного вируса (AAV) обладает высоким тропизмом к гепатоцитам, которые представляют собой клетки печени. В качестве вектора для переноса/доставки полинуклеотида (например, генов, ингибирующей нуклеиновой кислоты и т.д.) в клетки AAV-Rh74 может обеспечивать терапевтические уровни экспрессии в печени после внутривенного введения. Кроме того, опосредованный AAV-Rh74 перенос/доставка гена индуцировал уровни экспрессии белка, которые являлись значительно выше по сравнению с другими серотипами (см., например, фигуры 1 и 2). В частности, AAV-Rh74 направленно воздействует на гены для доставки в печень с эффективностью, по меньшей мере сравнимой или превосходящей золотой стандарт для трансдукции печени AAV8 у мышей и у собак с гемофилией B. Таким образом, AAV-Rh74 можно использовать для переноса/доставки полинуклеотидов, таких как кодирующие последовательности (гены) для белков, которые оказывают желаемое или терапевтическое действие, а также ингибирующей (например, антисмысловой) нуклеиновой кислоты, которая снижает или ингибируют экспрессию нежелательного или дефектного (например, патологического) гена, таким образом обеспечивая лечение ряда заболеваний. Например, AAV-Rh74 можно использовать для переноса/доставки терапевтических генов для лечения гемофилии A, B и переноса/доставки генов для широкого спектра других состояний метаболического дефицита или дефицита белка в плазме или для других терапевтических целей, таких как, но не ограничиваясь ими, гены, кодирующие нуклеазы цинкового пальца, для проведения редактирования генома в печени и для локальной (в печень) доставки иммуномодулирующих средств, таких как альфа-интерферон, для лечения инфекций вируса гепатита и для лечения практически любого заболевания, для которого необходима трансдукция печени или наличие терапевтического продукта трансгена в кровотоке (которое можно получать направленной доставкой трансгенов для экспрессии в печени).

[0014] Как указано в настоящем описании, серотип AAV-Rh74 аденоассоциированного вируса (AAV) и соответствующие векторы AAV обеспечивают доставку полинуклеотидных последовательностей в клетки ex vivo, in vitro и in vivo. Такие полинуклеотидные последовательности могут кодировать белки таким образом, что клетки, в которые доставляют полинуклеотиды, экспрессируют кодируемые белки. Например, AAV-Rh74 и соответствующие векторы AAV могут содержать полинуклеотиды, кодирующие желаемый белок или пептид, или полинуклеотид, который при транскрипции содержит ингибирующую последовательность (например, РНК), например, последовательность, которая направленно воздействует на ген для ингибирования экспрессии. Таким образом, доставка или введение вектора индивидууму (например, млекопитающему) предоставляет не только полинуклеотиды, кодирующие белки и пептиды индивидууму, а также ингибирующие нуклеиновые кислоты, которые направленно воздействуют на гены для ингибирования его экспрессии или функции у индивидуума.

[0015] Таким образом, изобретение относится к серотипу AAV-Rh74 аденоассоциированного вируса (AAV) и соответствующим векторам AAV, включая полинуклеотидные последовательности, кодирующие пептиды и белки, а также полинуклеотидные последовательности, которые непосредственно или при транскрипции содержат ингибирующие нуклеиновые кислоты, которые направленно воздействуют на гены для ингибирования экспрессии или функции. Такие серотипы AAV-Rh74 и соответствующих векторов AAV (например, последовательности VP1, VP2 и/или VP3) отличаются от серотипов AAV, включая, например, AAV1-AAV11 или Rh10 (например, отличаются от последовательностей VP1, VP2 и/или VP3 любого из серотипов AAV1-AAV11 или Rh10).

[0016] Как используют в настоящем описании, термин "серотип" представляет собой определение, используемое для обозначения AAV, содержащего капсид, который является серологически отличным от других серотипов AAV. Серологические отличия определяют на основании отсутствия перекрестной реактивности между антителами к одному AAV по сравнению с другим AAV. Такие отличия перекрестной реактивности, как правило, обусловлены различиями последовательностей/антигенных детерминант капсидного белка (например, обусловлены различиями последовательностей VP1, VP2 и/или VP3 серотипов AAV).

[0017] AAV-Rh74 обладает последовательностями генов/белков, идентичными последовательностям, характерным для AAV-Rh74 (см., например, VP1, VP2, VP3 фигуры 3). Как используют в настоящем описании, "родственный AAV-Rh74 вектор AAV" и его грамматические варианты относятся к одному или более белкам AAV (например, последовательностям VP1, VP2 и/или VP3), которые обладают существенной идентичностью последовательности с одной или более полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, которые содержит AAV-Rh74. Такие векторы AAV, соответствующие AAV-Rh74, таким образом, могут содержать одну или более отличных последовательностей от AAV-Rh74, но могут обладать по существу идентичностью последовательности к одному или более генам и/или обладать одной или более функциональных характеристик AAV-Rh74 (например, таких как тропизм к клетке/ткани). Иллюстративные последовательности AAV-Rh74 включают VP1, VP2 и/или VP3, указанные на фигуре 3. В одном из неограничивающих иллюстративных вариантов осуществления вектор AAV, соответствующий AAV-Rh74, содержит полинуклеотид, полипептид или его подпоследовательность, которая содержит или состоит из последовательности по меньшей мере на 80% или более (например, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% и т.д.), идентичной одной или более последовательностям AAV-Rh74 VP1, VP2 и/или VP3, указанным на фигуре 3.

[0018] Согласно изобретению способы и применения включают последовательности AAV-Rh74 (полипептиды и нуклеотиды) и их подпоследовательности, которые обладают менее 100% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью гена или белка AAV-Rh74 (например, последовательностями VP1, VP2 и/или VP3, указанными на фигуре 3), но являются отличными и не идентичными известным генам или белкам AAV, таким как гены или белки AAV1-AAV11, AAV-Rh10 и т.д. В одном из вариантов осуществления полипептид AAV-Rh74 или его подпоследовательность содержит или состоит из последовательности по меньшей мере на 80% или более идентичной, например, на 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% и т.д., т.е. до 100% идентичной эталонной последовательности AAV-Rh74 или ее подпоследовательности (например, последовательностям VP1, VP2 и/или VP3, указанным на фигуре 3).

[0019] Векторы AAV, включая AAV-Rh74 и соответствующие AAV-Rh74 векторы, можно конструировать рекомбинантными способами, которые известны специалисту в данной области, введения одной или более гетерологичных полинуклеотидных последовательностей, фланкированных функциональными ITR AAV. Встраивание гетерологичного полинуклеотида определяет AAV как рекомбинантный вектор или "вектор rAAV". Такие векторы могут содержать один или более генов AAV дикого типа полностью или частично удаленные, например, ген rep и/или cap, но сохранять по мере необходимости по меньшей мере одну функциональную фланкирующую последовательность ITR для спасения, репликации и упаковки частицы AAV. Таким образом, вектор AAV содержит последовательности, необходимые в цис-положении для репликации и упаковки вируса (например, функциональные ITR).

[0020] Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используют взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения всех форм нуклеиновой кислоты, олигонуклеотидов, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Полинуклеотиды включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую ДНК и сплайсированную или несплайсированную мРНК, рРНК тРНК и ингибирующую ДНК или РНК (РНКи, например, малую или короткую шпилечную (ш)РНК, микроРНК, малую или короткую интерферирующую (ми)РНК, транс-сплайсинг РНК или антисмысловую РНК). Полинуклеотиды включают природные, синтетические и специально измененные или модифицированные полинуклеотиды, а также аналоги и производные. Полинуклеотиды могут быть одинарными, двойными или тройными, линейными или кольцевыми и могут быть любой длины.

[0021] "Гетерологичный" полинуклеотид относится только к полинуклеотиду, встраиваемому в AAV с целью опосредованного AAV переноса/доставки полинуклеотида в клетку. Гетерологичные полинуклеотиды, как правило, отличаются от нуклеиновой кислоты AAV. После трансфекции/доставки в клетку гетерологичные полинуклеотиды, содержащиеся в вирионе rAAV, может экспрессироваться (например, транскрибироваться и транслироваться при необходимости). Альтернативно трансфицированный/доставленный в клетку гетерологичный полинуклеотид, содержащийся в вирионе rAAV, необязательно экспрессируется. Несмотря на то, что термин "гетерологичный" не всегда используют в настоящем описании по отношению к полинуклеотидам, ссылка на полинуклеотид даже при отсутствии определения "гетерологичный" включает гетерологичные полинуклеотиды, несмотря на его опущение.

[0022] "Полипептиды", "белки" и "пептиды", кодируемые "полинуклеотидными последовательностями", включают полноразмерные нативные последовательности, как с природными белками, а также функциональные подпоследовательности, модифицированные формы или варианты последовательности при условии, что подпоследовательность, модифицированная форма или вариант сохраняет некоторую степень функциональности нативного полноразмерного белка. В способах и применениях по изобретению такие полипептиды, белки и пептиды, кодируемые полинуклеотидными последовательностями, могут являться, но не обязательно являются идентичными эндогенному белку, который является дефектным или экспрессия которого является недостаточной или дефицитной у обрабатываемого млекопитающего.

[0023] Серотип AAV-Rh74 аденоассоциированного вируса (AAV) и соответствующие векторы AAV по изобретению можно использовать для стабильного или временного введения/доставки полинуклеотидов в клетки и их потомство. Термин "трансген" используют для обозначения подходящим образом такого гетерологичного полинуклеотида, который ввели в клетку или организм. Трансгены включают любой полинуклеотид, такой как ген, кодирующий полипептид или белок, полинуклеотид, который транскрибируется в ингибирующий полинуклеотид, или полинуклеотид, который не транскрибируется (например, не содержит регуляторный элемент экспрессии, такой как промотор, который направляет транскрипцию). Например, в клетке, содержащей трансген, трансген вводили/трансфицировали путем "трансформации" AAV клетки. Клетка или ее потомство, в которое ввели трансген, обозначают как "трансформированная клетка" или "трансформант". Как правило, трансген содержится в потомстве трансформанта или становится частью организма, который развивается из клетки. Таким образом, "трансформированная" или "трансфицированная" клетка (например, у млекопитающего, такая как клетка или клетка ткани или органа) означает генетическое изменение в клетке после встраивания экзогенной молекулы, например, полинуклеотида или белка (например, трансгена) в клетку. Таким образом, "трансфицированная" или "трансформированная" клетка представляет собой клетку, например, в которую ввели экзогенную молекулу, или ее потомство, в которое ввели экзогенную молекулу. Клетка(и) можно выращивать, и вводимый белок экспрессируется или транскрибируется нуклеиновая кислота.

[0024] Конкретные неограничивающие примеры полинуклеотидов, кодирующих продукты генов (белки), которые являются пригодными по изобретению, включают, но не ограничиваются ими: гены, которые содержат или кодируют CFTR (трансмембранный регуляторный белок кистозного фиброза), фактор коагуляции крови (свертывания) (фактор XIII, фактор IX, фактор X, фактор VIII, фактор VIIa, белок C и т.д.), включая приобретение функции факторов свертывания крови, антитело, специфический для пигментного эпителия сетчатки белок 65 кДа (RPE65), эритропоэтин, LDL-рецептор, липопротеинлипазу, орнитинтранскарбамилазу, β-глобин, α-глобин, спектрин, α-антитрипсин, аденозиндезаминазу (ADA), переносчик металлов (ATP7A или ATP7), сульфамидазу, фермент, участвующий в лизосомной болезни накопления (ARSA), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу, β-25-глюкоцереброзидазу, сфингомиелиназу, лизосомальную гексозаминидазу, дегидрогеназу кетокислот с разветвленной цепью, гормон, фактор роста (например, инсулиноподобные факторы роста 1 и 2, фактор роста тромбоцитов, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, нейротрофический фактор-3 и -4, нейротрофический фактор головного мозга, фактор роста глии, трансформирующий фактор роста α и β и т.д.), цитокин (например, α-интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин 2, интерлейкин 4, интерлейкин 12, гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор, лимфотоксин и т.д.), продукт "суицидального" гена (например, тимидинкиназу вируса простого герпеса, цитозиндезаминазу, дифтерийный токсин, цитохром P450, дезоксицитидинкиназу, фактор некроза опухоли и т.д.), белок устойчивости к лекарственным средствам (например, который обеспечивает устойчивость к лекарственному средству, используемому в терапии злокачественных опухолей), белок-супрессор опухоли (например, p53, Rb, Wt-1, NF1, фон Гиппеля-Линдау (VHL), аденоматозного полипоза толстой кишки (APC)), пептид с иммуномодулирующими свойствами, толерогенный или иммуногенный пептид или белки Tregitope [de Groot et al., Blood, 2008 Oct 15; 112(8):3303] или hCDR1 [Sharabi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006 Jun 6; 103(23):8810-5], инсулин, глюкокиназу, гуанилатциклазу 2D (LCA-GUCY2D), регулирующий транспорт белок Rab 1 (хороидеремия), LCA 5 (LCA-леберцилин), аминотрансферазу орнитин-кетокислоты (гиратная атрофия), ретиносхизис 1 (связанный с X-хромосомой ретиносхизис), USH1C (синдром Ашера 1C), ГТФаза связанная с X-хромосомой пигментная дистрофия сетчатки (XLRP), MERTK (формы AR RP: пигментная дистрофия сетчатки), DFNB1 (тугоухость, ассоциированная с коннексином 26), ACHM 2, 3 и 4 (ахроматопсия), PKD-1 или PKD-2 (поликистозная болезнь почек), TPP1, CLN2, дефицит гена, вызывающий лизосомные болезни накопления (например, сульфатазы, N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансферазы, катепсин A, GM2-AP, NPC1, VPC2, белки-активаторы сфинголипидов и т.д.), одну или более нуклеаз цинкового пальца для редактирования генома или донорные последовательности, используемые в качестве матриц для восстановления для редактирования генома.

[0025] Все известные или неизвестные, принадлежащие млекопитающим и не принадлежащие млекопитающим формы полинуклеотидов, кодирующих продукты генов, включая неограничивающие гены и белки, описываемые в настоящем описании, явным образом включены. Таким образом, изобретение включает гены и белки от немлекопитающих, млекопитающих, отличных от людей, и людей, гены и белки которых функционируют по существу аналогичным образом с генами и белками человека, описываемыми в настоящем описании. Неограничивающий пример ген немлекопитающего представляет собой домен Fok нуклеазы, который является бактериального происхождения. Неограничивающие примеры последовательностей FIX млекопитающих, не являющихся человеком, описаны у Yoshitake et al., 1985, выше; Kurachi et al., 1995, выше; Jallat et al., 1990, выше; Kurachi et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6461-6464; Jaye et al., 1983, Nucl. Acids Res., 11:2325-2335; Anson et al., 1984, EMBO J., 3: 1053-1060; Wu et al., 1990, Gene, 86:275-278; Evans et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10095 (1989), Blood, 74:207-212; Pendurthi et al., 1992, Thromb. Res., 65:177-186; Sakar et al., 1990, Genomics, 1990, 6:133-143 и Katayama et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4990-4994.

[0026] Полинуклеотиды, полипептиды и их подпоследовательности включают модифицированные и вариантные формы. Как используют в настоящем описании, термины "модифицировать" или "вариант" и его грамматические варианты означают, что полинуклеотид, полипептид или его подпоследовательность отличается от эталонной последовательности. Модифицированные последовательности и варианты последовательностей, таким образом, могут обладать по существу аналогичной, большей или меньшей активностью или функцией по сравнению с эталонной последовательностью, но по меньшей мере частично сохраняют активность или функцию эталонной последовательности.

[0027] Таким образом, изобретение также включает природные и неприродные варианты. Такие варианты включают варианты с приобретенной или утраченной функцией. Например, ДНК последовательности FIX дикого типа человека, варианты или мутанты белка которых сохраняют активность или являются терапевтически эффективными или являются сравнимо или даже более терапевтически активными по сравнению с инвариантным FIX человека в способах и применениях по изобретению. В конкретном примере коллаген IV служит для захвата FIX, что означает, что при введении в мышечную ткань млекопитающего некоторая часть FIX является недоступной для участия в коагуляции крови, так как она удерживается в межклеточных пространствах в мышечной ткани. Мутация в последовательности FIX, которая приводит к белку со сниженным связыванием с коллагеном IV (например, потери функции), является мутацией, пригодной в способах по изобретению, например, для лечения гемофилии. Пример такого мутантного гена FIX человека кодирует белок FIX человека с аминокислотой аланин вместо лизина в пятом положении аминокислот от начала зрелого белка.

[0028] Неограничивающие примеры модификаций включают одну или более замен аминокислот (например, 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50 или более остатков), добавлений (например, вставок или 1-3, 3-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50 или более остатков) и делеций (например, подпоследовательностей или фрагментов) эталонной последовательности. В конкретных вариантах осуществления модифицированная последовательность или вариант последовательности сохраняет по меньшей мере часть функции или активности немодифицированной последовательности. Такие модифицированные формы и варианты могут обладать меньшей, аналогичной или большей, но по меньшей мере часть функции или активности эталонной последовательности, например, как описано в настоящем описании.

[0029] Вариант может содержать одну или более отличий или модификаций неконсервативных или консервативных аминокислотных последовательностей или то и другое. "Консервативная замена" представляет собой замену одной аминокислоты на биологически, химически или структурно сходный остаток. «Биологически сходный» означает, что замена не нарушает биологической активности. «Структурно сходный» означает, что аминокислоты содержат боковые цепи сходной длины, такие как аланин, глицин и серин, или сходного размера. «Химическое подобие» означает, что остатки имеют такой же заряд или являются гидрофильными или гидрофобными. Конкретные примеры включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин на другой, или замену одного полярного остатка на другой, такую как замена аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин, серина на треонин и т.п. Конкретные примеры консервативных замен включают замену гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой, замену полярного остатка на другой, такую как замена аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин и т.п. Например, консервативные замены аминокислот, как правило, включают замены в следующих группах: глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин и фенилаланин, тирозин. "Консервативная замена" также включает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной исходной аминокислоты.

[0030] Таким образом, изобретение включает варианты гена и белка (например, полинуклеотидов, кодирующих белки, описываемые в настоящем описании), которые сохраняют один или более видов биологической активности (например, функцию тромбообразования и т.д.). Такие варианты белков или полипептидов включают белки или полипептиды, которые подвергли модификации или которые можно модифицировать технологией рекомбинантных ДНК, таким образом, что белок или полипептид обладает измененными или дополнительными свойствами, например варианты, обеспечивающие повышенную стабильность белка в плазме или повышающие активность белка. Варианты могут отличаться от эталонной последовательности, такой как природные полинуклеотиды, белки или пептиды.

[0031] На уровне нуклеотидной последовательности природный и неприродный вариант гена, как правило, является по меньшей мере приблизительно на 50% идентичным, более предпочтительно приблизительно на 70% идентичным, даже более предпочтительно приблизительно на 80% идентичным (на 90% или более идентичным) по отношению к эталонному гену. На уровне аминокислотной последовательности природный и неприродный вариант белка, как правило, является по меньшей мере приблизительно на 70% идентичным, более предпочтительно приблизительно на 80% идентичным, даже более предпочтительно на 90% или более идентичным по отношению к эталонному белку, хотя допустимыми являются области по существу с отсутствием идентичности в неконсервативных областях (например, менее 70% идентичные, такие как менее 60%, 50% или даже 40%). В других вариантах осуществления последовательности обладают по меньшей мере 60%, 70%, 75% или большей идентичностью (например, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичностью) с эталонной последовательностью. Способы введения замен нуклеотида и аминокислот в полинуклеотиде, белке или полипептиде известны специалисту в данной области (см., например, Sambrook et al. (1989)).

[0032] Термин "идентичность", "гомология" и его грамматические варианты означают, что два или более рассматриваемых структур являются одинаковыми, когда они представляют собой "выровненные" последовательности. Таким образом, в качестве примера, когда две полипептидные последовательности являются идентичными, они содержат одинаковую аминокислотную последовательность, по меньшей мере в пределах рассматриваемой области или участка. В случае когда две полинуклеотидные последовательности являются идентичными, они содержат одинаковую полинуклеотидную последовательность по меньшей мере в рассматриваемой области или участке. Идентичность может выходить за границы определенного участка (области или домена) последовательности. "Участок" или "область" идентичности относится к участку двух или более рассматриваемых структур, которые являются одинаковыми. Таким образом, когда два белка или две последовательности нуклеиновой кислоты являются идентичными более чем в одном или более участках или областей последовательностей, они являются идентичными в этой области. "Выровненная" последовательность относится ко многим последовательностям полинуклеотида или белка (аминокислот), как правило, содержащим поправки для пропущенных или дополнительных оснований или аминокислот (пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью.

[0033] Идентичность может выходить за пределы всей длины последовательности или участка последовательности. В конкретных аспектах длина последовательности с процентной идентичностью составляет 2, 3, 4, 5 или более смежных полинуклеотидов или аминокислот, например, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д. смежных аминокислот. В дополнительных конкретных аспектах длина последовательности, обладающей идентичностью, составляет 20 или более смежных полинуклеотидов или аминокислот, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 и т.д. смежных аминокислот. В дополнительных конкретных аспектах длина последовательности, обладающей идентичностью, составляет 35 или более смежных полинуклеотидов или аминокислот, например, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49, 50 и т.д. смежных аминокислот. В еще одних дополнительных конкретных аспектах длина последовательности, обладающей идентичностью, составляет 50 или более смежных полинуклеотидов или аминокислот, например, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-100, 100-110 и т.д. смежных полинуклеотидов или аминокислот.

[0034] Термины "гомологичные" или "гомология" означают, что два или более рассматриваемых конструкций обладают по меньшей мере частичной идентичностью на всем протяжении данной области или участка. "Участки, области или домены" гомологии или идентичности означают, что участок двух или более рассматриваемых конструкций обладает гомологией или является одинаковым. Таким образом, когда две последовательности являются идентичными на всем протяжении одной или более областей последовательности, они обладают идентичностью в этих областях. "Существенная гомология" означает, что молекула является структурно или функционально консервативной, таким образом, что она обладает, или теоретически рассчитано, что она обладает, по меньшей мере частично, структурой или функцией одной или более структур или функций (например, биологической функцией или активностью) эталонной молекулы или релевантной/соответствующей области или участка эталонной молекулы, к которой она является гомологичной.

[0035] Степень идентичности (гомологии) двух последовательностей можно оценивать с использованием компьютерной программы и математического алгоритма. Такие алгоритмы, которые вычисляют процентную идентичность последовательностей (гомологию), в основном подсчитывают для последовательности пропуска и несоответствия на всем протяжении области или участка сравнения. Например, поисковый алгоритм BLAST (например, BLAST 2.0) (см., например, Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403 (1990), общедоступный посредством NCBI) содержит следующие ниже иллюстративные параметры поиска: несоответствие -2; открытие пропуска 5; продление пропуска 2. Для сравнений полипептидных последовательностей алгоритм BLASTP, как правило, используют в комбинации с оценочной матрицей, такой как PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 или BLOSUM 50. Для количественного определения степени идентичности также используют программы для сравнивания последовательностей FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) и SSEARCH (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol., 132:185 (2000) и Smith et al., J. Mol. Biol., 147:195 (1981)). Также разработаны программы для количественного определения структурного сходства белков с использованием топологического отображения на основе критерия Делоне (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).

[0036] Полинуклеотиды содержат добавления и вставки, например, гетерологичные домены. Добавление (например, гетерологичный домен) может представлять собой ковалентное или нековалентное присоединение любого типа молекулы к композиции. Как правило, добавления и вставки (например, гетерологичный домен) обеспечивают комплементарную или отличную функцию или активность.

[0037] Добавления и вставки содержат химерные и слитые последовательности, которые представляет собой полинуклеотидную или белковую последовательность, содержащую одну или более молекул, как правило, не содержащихся в эталонной нативной (дикого типа) последовательности, ковалентно присоединенных к последовательности. Термины "слитая" или "химерная" и их грамматические варианты при использовании по отношению к молекуле означают, что участки или часть молекулы содержат другую структуру, отличающуюся (гетерологичную) от молекулы, так как они, как правило, не существуют совместно в природе. Другими словами, например, один участок слияния или химеры содержит или состоит из участка, который не существует совместно в природе, и является структурно отличным.

[0038] Как указано в настоящем описании, полинуклеотидные последовательности содержат ингибирующие и антисмысловые последовательности нуклеиновой кислоты. Ингибирующие, антисмысловые, мкРНК, кшРНК и нуклеиновые кислоты РНКи могут модулировать экспрессию гена-мишени. Антисмысловые последовательности включают одноцепочечные, двухцепочечные или трехцепочечные полинуклеотиды и пептидилнуклеиновые кислоты (PNA), которые связываются с транскриптом РНК или ДНК (например, геномной ДНК). Другим конкретным примером являются олигонуклеотиды, получаемые из участка инициации транскрипции гена-мишени, например, в положениях от -10 до +10 от начала участка. Образующие триплекс антисмысловые последовательности могут связываться с двухцепочечной ДНК, таким образом ингибируя транскрипцию гена. "РНКи" заключается в использовании одноцепочечных или двухцепочечных последовательностей РНК для ингибирования экспрессии гена (см., например, Kennerdell et al., Cell, 95:1017 (1998) и Fire et al., Nature, 391:806 (1998)). Таким образом, можно использовать двухцепочечные последовательности РНК из кодирующей области гена-мишени для ингибирования или предотвращения экспрессии/транскрипции гена в соответствии со способами и применениями по изобретению. Антисмысловую последовательность и РНКи можно получать в зависимости от нуклеиновых кислот, кодирующих последовательности гена-мишени (например, HTT), таких как нуклеиновая кислота, кодирующая HTT млекопитающих и человека. Например, одноцепочечная или двухцепочечная нуклеиновая кислота (например, РНК) может направленно воздействовать на транскрипт HTT (например, мРНК).

[0039] Конкретные неограничивающие примеры генов (например, геномной ДНК) или транскрипта патогенного гена (например, РНК или мРНК), на которые можно направленно воздействовать ингибирующими последовательностями нуклеиновой кислоты по изобретению, включают, но не ограничиваются ими: патогенные гены, ассоциированные с заболеваниями, обусловленными повтором полинуклеотидов, такие как ген хантингтин (HTT), ген, ассоциированный с дентаторубрально-паллидолюисовой атрофией (например, атрофин 1, ATN1); андрогенный рецептор на X-хромосоме при спинобульбарной мышечной атрофии, атаксин-1, -2, -3 и -7 человека, потенциалозависимый кальциевый канал Ca_v2,1 P/Q кодируется (CACNA1A), TATA-связывающий белок, атаксин 8 противоположной цепи, также известный как ATXN8OS, изоформу бета-регуляторной субъединицы B серин/треониновой протеинфосфатазы 2A 55 кДа при спинально-церебеллярной атаксии (1, 2, 3, 6, 7, 8, 12, 17 типа), FMR1 (задержка умственного развития при ломкой X-хромосоме 1) при синдроме ломкой X-хромосомы, FMR1 (задержка умственного развития при ломкой X-хромосоме 1) при синдроме тремора/атаксии, ассоциированном с ломкой X-хромосомой, FMR1 (задержка умственного развития при ломкой X-хромосоме 2) или представитель 2 семейства AF4/FMR2 при задержке умственного развития при ломкой XE; миотонинпротеинкиназу (MT-PK) при миотонической дистрофии; фратаксин при атаксии Фридрейха; мутант гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) при боковом амиотрофическом склерозе; ген, вовлеченный в патогенез болезни Паркинсона и/или болезни Альцгеймера; полипопротеин B (APOB) и пропротеинконвертазу субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), гиперхолестеринемию; Tat ВИЧ, трансактиватор вируса иммунодефицита человека транскрипции гена при инфекции ВИЧ; TAR ВИЧ, ген элементов ответа трансактиватора вируса иммунодефицита человека при инфекции ВИЧ; хемокиновый рецептор C-C (CCR5) при инфекции ВИЧ; нуклеокапсидный белок вируса саркомы Рауса (RSV) при инфекции RSV, печеньспецифические микроРНК (miR-122) при инфекции вируса гепатита C; p53, острое повреждение почек или отсроченная функция трансплантата почки или острую почечную недостаточность при повреждении почек; протеинкиназу N3 (PKN3) при рецидивирующих или метастатических солидных злокачественных новообразованиях на поздней стадии; LMP2, LMP2 также известную как протеасомная субъединица бета-типа 9 (PSMB 9), метастатическая меланома; LMP7, также известную как протеасомная субъединица бета-типа 8 (PSMB 8), метастатическая меланома; MECL1, также известную как протеасомная субъединица бета-типа 10 (PSMB 10), метастатическая меланома; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) в солидных опухолях; белок веретена деления кинезин в солидных опухолях, супрессор апоптоза B-клеточной CLL/лимфомы (BCL-2) при хроническом миелолейкозе; рибонуклеотидредуктазу M2 (RRM2) в солидных опухолях; фурин в солидных опухолях; полоподобную киназу 1 (PLK1) в опухолях печени, диацилглицеринацилтрансферазу 1 (DGAT1) при инфекции гепатита C, бета-катенин при семейном аденоматозном полипозе; бета-2-адренергический рецептор, глаукома; RTP801/Redd1, также известный как белок транскрипта 4, индуцируемого повреждением ДНК, при диабетическом макулярном отеке (DME) или связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; рецептор фактор роста эндотелия сосудов I (VEGFR1) при связанной с возрастом дегенерации желтого пятна или хориоидальной неоваскуляризации, каспазу 2 при не связанной с артериитом ишемической оптической нейропатии; мутантный белок кератин 6A N17K при врожденной пахионихии; геном/последовательности генов вируса гриппа A при инфекции гриппа; геном/последовательности гена коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) при инфекции SARS; геном/последовательности генов респираторно-синцитиального вируса при инфекции респираторно-синцитиального вируса; геном/последовательность гена филовируса Эбола при инфекции вирусом Эбола; геном/последовательности генов вируса гепатита B и C при инфекции гепатита B и C; геном/последовательности генов вируса простого герпеса (HSV) при инфекции HSV, геном/последовательности генов вирусов Коксаки B3 при инфекции вирусами Коксаки B3; сайленсинг патогенного аллеля гена (аллельспецифический сайленсинг), такого как торзин A (TOR1A), при первичной дистонии, пан-класс I и HLA-аллельспецифический при трансплантате, или мутантный ген родопсина (RHO) при аутосомной доминантной наследственной пигментной дистрофии сетчатки (adRP).

[0040] Как используют в настоящем описании, термин "рекомбинантный" в качестве определения AAV, такого как рекомбинантный AAV-Rh74 и соответствующие векторы AAV, а также определения последовательностей, таких как рекомбинантные полинуклеотиды и полипептиды, означает, что композиции подвергали манипуляции (например, конструировали) таким способом, который, как правило, не встречается в природе. Конкретный пример рекомбинантного AAV представляет собой такой, где полинуклеотид, который, как правило, не содержится в AAV дикого типа, содержится в частице и/или геноме AAV. Например, конкретный пример рекомбинантного полинуклеотида представляет собой такой, где полинуклеотид (например, ген), кодирующий белок, клонируют в вектор с 5ʹ-, 3ʹ- и/или интронными областями или без них, где ген, как правило, ассоциирован с геномом AAV. Хотя термин "рекомбинантный" не всегда используют в настоящем описании по отношению к AAV, такому как AAV-Rh74 и соответствующие векторы AAV, а также к последовательностям, таким как полинуклеотиды и полипептиды, рекомбинантные формы AAV, AAV-Rh74 и соответствующих векторов AAV и последовательностей, кодирующих полинуклеотиды и полипептиды, являются явным образом включенными, несмотря на какое-либо такое опущение.

[0041] Полинуклеотидные последовательности по изобретению можно встраивать в вектор. Термин "вектор" относится к плазмиде, вирусу (например, AAV) или другому носителю, который можно подвергать манипуляции для вставки или встраивания полинуклеотида. Такие векторы можно использовать для манипуляции с генами (например, "клонирующие векторы") для введения/переноса полинуклеотидов в клетки и для транскрипции или трансляции встроенного полинуклеотида в клетках. Вектор, как правило, содержит по меньшей мере участок начала репликации для размножения в клетке и регуляторный элемент экспрессии (например, промотор). Регуляторные элементы, включая регуляторные элементы экспрессии, как указано в настоящем описании, содержащиеся в векторе, вводят для облегчения правильной транскрипции и при необходимости трансляции (например, сплайсинг-сигнала для интронов, поддержания правильной рамки считывания гена для обеспечения возможности трансляция мРНК и стоп-кодонов внутри рамки считывания и т.д.).

[0042] Векторы, включая AAV-Rh74 и соответствующие векторы AAV по изобретению, могут содержать один или более "регуляторных элементов экспрессии". Как правило, регуляторные элементы экспрессии представляют собой последовательность(и) нуклеиновой кислоты, такую как промоторы и энхансеры, которые влияют на экспрессию функционально связанного полинуклеотида. Такие элементы, как правило, действуют в цис-положении, но могут действовать в транс-положении.

[0043] Регуляцию экспрессии можно проводить на уровне транскрипции, трансляции, сплайсинга, стабильности транскрипта и т.д. Как правило, регуляторный элемент экспрессии, который модулирует транскрипцию, располагается вблизи 5ʹ-конца транскрибируемого полинуклеотида (например, "против хода транскрипции"). Регуляторные элементы экспрессии также могут располагаться на 3ʹ-конце транскрибируемой последовательности (например, "по ходу транскрипции") или в транскрипте (например, в интроне). Регуляторные элементы экспрессии могут располагаться на расстоянии от транскрибируемой последовательности (например, от 100 до 500, от 500 до 1000, от 2000 до 5000, от 5000 до 10000 или более нуклеотидов от полинуклеотида), даже на значительных расстояниях. Однако вследствие ограничений длины полинуклеотида для AAV-Rh74 и соответствующих векторов AAV такие регуляторные элементы экспрессии, как правило, располагаются в пределах от 1 до 1000 нуклеотидов от полинуклеотида.

[0044] Функционально экспрессия функционально связанного полинуклеотида по меньшей мере частично регулируется элементом (например, промотором) таким образом, что элемент модулирует транскрипцию полинуклеотида и при необходимости трансляцию транскрипта. Конкретный пример регуляторного элемента экспрессии представляет собой промотор, который, как правило, располагается на 5ʹ-конце транскрибируемой последовательности. Другой пример регуляторного элемента экспрессии представляет собой энхансер, который может располагаться на 5ʹ-, 3ʹ-конце транскрибируемой последовательности или в транскрибируемой последовательности.

[0045] Регуляторные элементы экспрессии и промоторы включают такие, которые активны в конкретном типе ткани или клеток, обозначаемые в настоящем описании как "тканеспецифические регуляторные элементы экспрессии/промоторы". Тканеспецифические регуляторные элементы экспрессии, как правило, являются активными в конкретной клетке или ткани (например, печени, головном мозге, центральной нервной системе, спинном мозге, глазе, сетчатке или легком). Регуляторные элементы экспрессии, как правило, являются активными в таких клетках, тканях или органах, так как их распознают белки-активаторы транскрипции или другие регуляторы транскрипции, которые являются уникальными для конкретного типа клетки, ткани или органа.

[0046] Регуляторные элементы экспрессии также включают повсеместные или смешанные промоторы/энхансеры, которые способны направлять экспрессию полинуклеотида во многих различных типах клеток. Такие элементы включают, но не ограничиваются ими, предранний промоторные/энхансерные последовательности цитомегаловируса (CMV), промоторные/энхансерные последовательности вируса саркомы Рауса (RSV) и другие вирусные промоторы/энхансеры, активные в различных типах клеток млекопитающих, или синтетические элементы, которые не встречаются в природе.

[0047] Регуляторные элементы экспрессии также могут обеспечивать экспрессию таким образом, который является регулируемым, т.е. сигнал или стимул повышает или снижает экспрессию функционально связанного полинуклеотида. Регуляторный элемент, который повышает экспрессию функционально связанного полинуклеотида в ответ на сигнал или стимулы, также обозначают как "индуцибельный элемент" (например, индуцируется сигналом). Конкретные примеры включают, но не ограничиваются ими, гормон (например, стероид) индуцибельный промотор. Регуляторный элемент, который снижает экспрессию функционально связанного полинуклеотида в ответ на сигнал или стимулы, обозначает как "репрессибельный элемент" (например, сигнал снижает экспрессию таким образом, что, когда сигнал устраняют или он отсутствует, экспрессия повышается). Как правило, величина повышения или снижения, обеспечиваемая такими элементами, пропорциональна величине присутствующего сигнала или стимула; чем больше величина сигнала или стимула, тем больше повышение или снижение экспрессии.

[0048] Как используют в настоящем описании, термин "функциональная связь" или "функционально связанный" относится к физическому или функциональному смежному положению компонентов, так описываемых, чтобы позволять им функционировать предназначенным им способом. В примере регуляторного элемента экспрессии в функциональной связи с полинуклеотидом взаимосвязь является такой, что регуляторный элемент модулирует экспрессию нуклеиновых кислот. Более конкретно, например, две функционально связанные последовательности ДНК означают, что две ДНК находятся (цис или транс) в такой взаимосвязи, что по меньшей мере одна из последовательностей ДНК способна оказывать физиологическое влияние на другую последовательность.

[0049] Векторы, включая AAV-Rh74 и соответствующие векторы AAV по изобретению, могут содержать еще дополнительные элементы нуклеиновых кислот. Такие элементы включают без ограничения одну или более копий последовательности ITR AAV, промоторный/энхансерный элемент, сигнал терминации транскрипции, 5ʹ- или 3ʹ-нетранслируемые области (например, последовательности полиаденилирования), которые фланкируют полинуклеотидную последовательность или весь или участок интрона I. Такие элементы также необязательно содержат сигнал терминации транскрипции. Конкретный неограничивающий пример сигнала терминации транскрипции представляет собой сигнал терминации транскрипции SV40.

[0050] Введение элемента интрона может усиливать экспрессию по сравнению с экспрессией в отсутствие элемента интрона (Kurachi et al., 1995, выше). Для векторов AAV, как правило, допустимы вставки ДНК в определенном диапазоне размеров, который, как правило, составляет приблизительно от 4 т. п. н. до приблизительно 5,2 т. п. н. или немного больше. Таким образом, для более коротких последовательностей необходимым может являться введение дополнительной нуклеиновой кислоты во встраиваемый фрагмент для получения необходимой длины, которая является приемлемой для вектора AAV. Интроны и фрагменты интронов (например, участок интрона I FIX) соответствуют этому требованию, при этом также усиливая экспрессию. Таким образом, изобретение не ограничено введением последовательностей интрона I в вектор AAV и включает введение других интронов или других последовательностей ДНК вместо участков интрона I. Таким образом, можно использовать другие 5ʹ- и 3ʹ-нетранслируемые области нуклеиновой кислоты вместо тех, которые перечислены для FIX человека, в частности, когда в AAV-Rh74 и соответствующих векторах AAV по изобретению используют полинуклеотиды, кодирующие белки, отличные от FIX человека.

[0051] "Участок интрона I", как используют в настоящем описании, означает область интрона I с длиной нуклеотида приблизительно от 0,1 т. п. н. приблизительно до 1,7 т. п. н., область которого усиливает экспрессию FIX, как правило, приблизительно в 1,5 раза или более в матрице плазмиды или вирусного вектора по сравнению с экспрессией FIX в отсутствие участка интрона I. Более предпочтительный участок представляет собой участок 1,3 т. п. н. интрона 1.

[0052] Полинуклеотиды и полипептиды, включая модифицированные формы, можно получать различными стандартными способами клонирования, технологией рекомбинантных ДНК, посредством экспрессии клетки или трансляции in vitro и способами химического синтеза. Чистоту полинуклеотидов можно определять секвенированием, электрофорезом в геле и т.п. Например, нуклеиновые кислоты можно выделять способами гибридизации или способами скрининга базы данных на основе компьютерных программ. Такие способы включают: (1) гибридизацию геномной ДНК или библиотек кДНК с зондами для направления гомологичных нуклеотидных последовательностей; (2) скрининг антител для детекции полипептидов, обладающих общими структурными свойствами, например, с использованием экспрессионной библиотеки; (3) полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием геномной ДНК или кДНК с использованием праймеров, способных отжигаться на представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты; (4) автоматизированный поиск родственных последовательностей в базах данных последовательностей и (5) дифференциальный скрининг вычтенных библиотек нуклеиновых кислот.

[0053] Полинуклеотиды и полипептиды, включая модифицированные формы, также можно получать посредством химического синтеза известными в данной области способами, например, с использованием устройств для автоматического синтеза (см., например, Applied Biosystems, Foster City, CA). Пептиды можно синтезировать полностью или частично химическими способами (см., например, Caruthers (1980). Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980) и Banga A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA). Пептидный синтез можно проводить с использованием различных твердофазных техник (см., например, Roberge, Science 269:202 (1995), Merrifield, Methods Enzymol., 289:3(1997)), и автоматический синтез можно проводить, например, с использованием пептидного синтезатора ABI 431A (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями производителя.

[0054] Термин "выделенная", когда используется в качестве определения композиции, означает, что композиции получает вручную или выделяют полностью или по меньшей мере частично из их природного окружения in vivo. Как правило, выделенные композиции по существу не содержат одного или более веществ, с которыми они обычно являются ассоциированными в природе, например, одним или более белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, клеточных мембран. Термин "выделенный" не исключает альтернативные физические формы композиции, такие как слияния/химеры, мультимеры/олигомеры, модификации (например, фосфорилирование, гликозилирование, липидизация) или дериватизированные формы или формы, экспрессируемые в клетках-хозяевах, получаемых с участием человека.

[0055] Изобретение относится к способам лечения и применения, которые включают терапевтические способы и применения. Способы и применения по изобретению широко примененимы к заболеваниям, поддающимся лечению посредством введения гена, кодирующего белок, или увеличения или стимуляции экспрессии гена или функции, например, добавления или замены гена. Способы и применения по изобретению также широко применимы к заболеваниям, поддающимся лечению посредством снижения или уменьшения экспрессии гена или функции, например, нокаута гена или снижения экспрессии гена.

[0056] Неограничивающие конкретные примеры заболеваний, поддающихся лечению по изобретению, включают такие, которые указаны в настоящем описании, а также заболевание легких (например, кистозный фиброз), нарушение коагуляции крови или свертывания крови (например, гемофилию A или гемофилию B с ингибиторами или без них), талассемию, заболевание крови (например, анемия), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз (ALS), эпилепсия, лизосомные болезни накопления, болезни накопления меди или железа (например, болезнь Менкеса или болезнь Вильсона), недостаточность лизосомной кислой липазы, неврологические или нейродегенеративные нарушения, злокачественная опухоль, диабет 1 типа или диабет 2 типа, болезнь Гоше, болезнь Гурлера, недостаточность аденозиндезаминазы, метаболический дефект (например, болезнь накопления гликогена), дегенеративное заболевание сетчатки (такое как недостаточность RPE65, хороидеремия и другие заболевания глаз) и заболевание солидного органа (например, головного мозга, печени, почки, сердца).

[0057] Таким образом, в одном из вариантов осуществления способ по изобретению включает: (a) предоставление вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV), где указанный вектор содержит гетерологичный полинуклеотид, кодирующий белок, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность является функционально связанной с регуляторным элементом экспрессии, обеспечивающим транскрипцию указанной полинуклеотидной последовательности, и (b) введение количества вектора AAV млекопитающему, где указанный белок экспрессируется у млекопитающего. В конкретных аспектах экспрессия белка оказывает терапевтическое действие у млекопитающего.

[0058] Способы по изобретению включают способы лечения, которые приводят к любому терапевтическому или положительному действию. В различных вариантах осуществления способов способы по изобретению дополнительно включают ингибирование, снижение или уменьшение одного или более неблагоприятных (например, физических) симптомов, нарушений, расстройств, заболеваний или осложнений, вызываемых или ассоциированных с заболеванием, таким как уменьшение времени свертывания крови, сниженная вводимая доза дополнительного белка фактора свертывания крови.

[0059] Терапевтическое или положительное воздействие лечения, таким образом, представляет собой любое объективное или субъективное измеряемое или детектируемое улучшение или преимущество, обеспечиваемое конкретному индивидууму. Терапевтическое или положительное действие может представлять собой, но не обязательно является им, полное устранение всех или любого конкретного неблагоприятного симптома, нарушения, расстройства или осложнения заболевания. Таким образом, удовлетворительные клинические конечные точки получают, когда наблюдают постепенное улучшение или частичное уменьшение неблагоприятного симптома, нарушения, расстройства или осложнения, вызываемого или ассоциированного с заболеванием, или ингибирование, снижение, уменьшение, подавление, предотвращение, ограничение или контроль ухудшения или прогрессирования одного или более неблагоприятных симптомов, нарушений, расстройств или осложнений, вызываемых или ассоциированных с заболеванием в течение короткого или длительного периода времени (в течение часов, суток, недель, месяцев и т.д.).

[0060] Композиции, способы и применения по изобретению можно обеспечивать в достаточном или эффективном количестве нуждающемуся в этом индивидууму. "Эффективное количество" или "достаточное количество" относится к количеству, которое обеспечивает в однократных или многократных дозах, отдельно или в комбинации с одной или более других композиций (терапевтических средств, таких как лекарственное средство), видов лечения, протоколов или схем лечения средствами, детектируемый ответ периода времени любой продолжительности (длительного или краткосрочного), ожидаемый или желательный исход или благоприятное действие индивидууму любой измеряемой или детектируемой степени или в течение периода времени любой продолжительности (например, в течение минут, часов, суток, месяцы, лет или до выздоровления).

[0061] Доза вектора AAV для получения терапевтического эффекта, например, доза в геномах вектора/на килограмм массы тела (гв/кг), изменяется в зависимости от некоторых факторов, включая, но не ограничиваясь ими, путь введения, уровень экспрессии гетерологичного полинуклеотида, необходимого для получения терапевтического эффекта, конкретное заболевание, подлежащее лечению, любой иммунный ответ хозяина на вектор AAV, иммунный ответ хозяина на гетерологичный полинуклеотид или продукт экспрессии (белок) и стабильность экспрессируемого белка. Специалист в данной области может легко определять диапазон доз вириона AAV для лечения пациента, страдающего конкретным заболеванием или нарушением, в зависимости от указанных выше факторов, а также других факторов. Как правило, для получения терапевтического эффекта дозы находятся в диапазоне по меньшей мере от 1×10⁸ или более, например, 1×10⁹, 1×10¹⁰, 1×10¹¹, 1×10¹², 1×10¹³ или 1×10¹⁴ или более, геномов вектора на килограмм (гв/кг) массы индивидуума.

[0062] Используя гемофилию в качестве примера, в общем случае полагают, что для получения терапевтического эффекта для изменения тяжелого фенотипа заболевания на умеренный фенотип необходимой является концентрация фактора свертывания крови, которая составляет более 1% от концентрации фактора, выявляемой у нормальных индивидуумов. Тяжелый фенотип характеризуется повреждением суставов и опасными для жизни кровотечениями. Для перевода умеренного фенотипа заболевания в слабовыраженный фенотип, полагают, что необходима концентрация фактора свертывания крови более 5% от нормальной. Касательно лечения такого страдающего гемофилией индивидуума для получения желаемого терапевтического эффекта характерная доза составляет по меньшей мере 1×10¹⁰ геномов вектора (гв) на килограмм (гв/кг) массы индивидуума или приблизительно от 1×10¹⁰ до 1×10¹¹ гв/кг массы индивидуума, или приблизительно от 1×10¹¹ до 1×10¹² гв/кг массы индивидуума, или приблизительно от 1×10¹² до 1×10¹³ гв/кг массы индивидуума.

[0063] Дозы "эффективного количества" или "достаточного количества" для лечения (например, для улучшения состояния или для обеспечения терапевтического действия или улучшения), как правило, являются эффективными для обеспечения ответа на один, многие или все неблагоприятные симптомы, последствия или осложнения заболевания, один или более неблагоприятных симптомов, нарушений, расстройств, патологий или осложнений, например, вызываемых или ассоциированных с заболеванием, до измеряемой величины, хотя снижение, уменьшение, ингибирование, подавление, ограничение или контроль прогрессирования или усугубления заболевания представляет собой удовлетворительный результат.

[0064] Эффективное количество или достаточное количество можно обеспечивать, но не обязательно, при однократном введении, может потребоваться множество введений, и можно, но не обязательно, вводить его отдельно или в комбинации с другими композициями (например, средством), лечением, протоколом или схемой лечения. Например, количество можно пропорционально повышать, на что указывает потребность индивидуума, тип, статус и тяжесть подлежащего лечению заболевания или побочные эффекты (при их наличии) лечения. Кроме того, эффективное количество или достаточное количество необязательно является эффективным или достаточным, если оно дано в однократных или многократных дозах без второй композиции (например, другого лекарственного средства или средства), лечения, протокола или схемы лечения, так как для того чтобы считаться эффективным или достаточным у данного индивидуума могут быть включены дополнительные дозы, количества или продолжительность введения, указанная выше и вне такого периода, таких доз или дополнительных композиций (например, лекарственных средств или средств), видов лечения, протоколов или схем лечения. Количества, считаемые эффективными, также включают количества, которые приводят к снижению применения другого лечения, схемы лечения или протокола, такого как введение рекомбинантного белка фактора свертывания крови для лечения нарушения свертывания крови (например, гемофилии A или B).

[0065] Эффективное количество или достаточное количество должно являться эффективным у каждого и любого индивидуума, подлежащего лечению, как и у большинства подлежащих лечению индивидуумов в данной группе или популяции. Эффективное количество или достаточное количество означает эффективность или достаточность у конкретного индивидуума, а не в группе или общей популяции. Как является характерным для таких способов, у некоторых индивидуумов выявляют большую или меньшую реакцию или отсутствие реакции на данный способ лечения или применения. Таким образом, подходящие количества зависят от подлежащего лечению состояния, желаемого терапевтического эффекта, а также отдельного индивидуума (например, биодоступности у индивидуума, пола, возраста и т.д.).

[0066] Термин "улучшение состояния" означает детектируемое или измеряемое улучшение заболевания или его симптома у индивидуума или сопутствующего клеточного ответа. Детектируемое или измеряемое улучшение включает субъективное или объективное уменьшение, снижение, ингибирование, подавление, ограничение или контроль возникновения, частоты, тяжести, прогрессирования или продолжительности заболевания или осложнения, вызываемого или ассоциированного с заболеванием, или улучшение симптома или первопричины, или последствия заболевания, или купирование заболевания.

[0067] Таким образом, благоприятный исход лечения может приводить к "терапевтическому эффекту" или "благоприятному действию" снижению, уменьшению, ингибированию, подавлению, ограничению, контролю или предотвращению возникновения, частоты, тяжести, прогрессирования или продолжительности заболевания или одного или более неблагоприятных симптомов или первопричин или последствий заболевания у индивидуума. Таким образом, благоприятными считаются способы лечения и применения, влияющие на одну или более первопричин заболевания или неблагоприятных симптомов. Снижение или уменьшение ухудшения, такое как стабилизация заболевания, или его неблагоприятного симптома также представляет собой благоприятный исход лечения.

[0068] Таким образом, терапевтическое действие или улучшение необязательно представляет собой полное устранение заболевания или любого одного, большинства или всех неблагоприятных симптомов, осложнений, последствий или первопричин, ассоциированных с заболеванием. Таким образом, удовлетворительные конечные точки получают, когда наблюдают постепенное улучшение состояния заболевания индивидуума или частичное снижение, уменьшение, ингибирование, подавление, ограничение, контроль или предотвращение возникновения, частоты, тяжести, прогрессирования или продолжительности или ингибирование или купирование заболевания (например, стабилизация одного или более симптомов или осложнений) в течение короткого или длительного периода времени (в течение часов, суток, недель, месяцев и т.д.). Эффективность способа или применения, такого как лечение, которое обеспечивает потенциальное терапевтическое действие или улучшение состояния заболевания, можно оценивать различными способами.

[0069] Способы и применения по изобретению можно комбинировать с любым соединением, средством, лекарственным средством, лечением или другой схемой лечения или протоколом, обладающим желаемым терапевтическим, благоприятным, дополнительным, синергическим или комплементарным действием или эффектом. Иллюстративные комбинированные композиции и виды лечения включают вторые активные средства, такие как биологические препараты (белки), средства и лекарственные средства. Такие биологические препараты (белки), средства, лекарственные средства, виды лечения и терапии можно вводить или проводить до, по существу одновременно или после любого другого способа или применения по изобретению, например, терапевтического способа лечения индивидуума от тромбоэмболической болезни.

[0070] Соединение, средство, лекарственное средство, лечение или другие схемы лечения или протоколы можно вводить в виде комбинированной композиции или вводить раздельно, в частности одновременно или сериями или последовательно (до или после) вектора AAV по изобретению. Таким образом, изобретение относится к комбинациям, в которых способ или применение по изобретению находится в комбинации с любым соединением, средством, лекарственным средством, схемой лечения, протоколом лечения, процессом, лечебным средством или композицией, указанными в настоящем описании или известными специалисту в данной области. Соединение, средство, лекарственное средство, схема лечения, протокол лечения, процесс, лечебное средство или композицию можно вводить или проводить до, по существу одновременно или после введения вектора AAV по изобретению индивидууму. Таким образом, конкретные неограничивающие примеры вариантов осуществления комбинаций включают указанные выше или другое соединение, средство, лекарственное средство, схему лечения, протокол лечения, процесс, лечебное средство или композицию.

[0071] Способы и применения по изобретению также включают, в частности, способы и применения, которые приводят к уменьшению необходимости или применения другого соединения, средства, лекарственного средства, схемы лечения, протокола лечения, процесса или лечебного средства. Например, в отношении тромбоэмболической болезни способ или применение по изобретению оказывает терапевтическое действие, если данному индивидууму необходима менее частая или сниженная доза или отмена введения рекомбинантного белка фактора свертывания крови для пополнения недостающего или дефектного (аномального или мутантного) эндогенного фактора свертывания крови у индивидуума. Таким образом, изобретение относится к способам и применениям для снижения необходимости или применения другого лечения или терапии.

[0072] Термин "индивидуум" относится к животному, как правило млекопитающему, такому как люди, не являющимся человеком приматам (обезьянам, гиббонам, гориллам, шимпанзе, орангутангам, макакам), домашнему животному (собакам и кошкам), сельскохозяйственному животному (домашней птице, такой как куры и утки, лошади, коровы, козы, овцы, свиньи) и экспериментальным животным (мышь, крыса, кролик, морская свинка). Индивидуумы включают модели заболеваний на животных, например, модели тромбоэмболической болезни на мышах и других животных и другие, известные специалистам в данной области.

[0073] Индивидуумы, подходящие для лечения по изобретению, включают индивидуумов, страдающих или подвергающихся риску продукции недостаточного количества или страдающих недостаточностью функционального продукта гена (белка), или у которых продуцируется аберрантный, частично функциональный или нефункциональный продукт гена (белок), который может приводить к заболеванию. Индивидуумы, подходящие для лечения по изобретению, также включают индивидуумов, страдающих или подвергающихся риску продукции аберрантного или дефектного (мутантного) продукта гена (белка), который приводит к заболеванию, таким образом, что снижение количеств, экспрессии или функции аберрантного или дефектного (мутантного) продукта гена (белка) приводит к лечению заболевания или уменьшению одного или более симптомов или улучшению состояния заболевания. Таким образом, целевые индивидуумы включают индивидуумов, которые имеют такие дефекты независимо от типа заболевания, периода времени или степени начала, прогрессирования, тяжести, частоты или типа или продолжительности симптомов.

[0074] Индивидуумы, подходящие для лечения по изобретению, также включают индивидуумов, страдающих или подвергающихся риску индукции антител против AAV. Векторы AAV можно вводить или доставлять таким индивидуумам несколькими способами. Например, можно доставлять пустой капсид AAV (т.е. AAV, не содержащий гетерологичный полинуклеотид), чтобы он связывался с антителами против AAV, таким образом обеспечивая возможность трансформации клеток индивидуумам вектором AAV, несущим гетерологичный полинуклеотид. Количества пустого капсида AAV для введения можно калибровать в зависимости от количества антител против AAV, индуцируемых у конкретного индивидуума. Альтернативно или в дополнение вектор AAV можно доставлять посредством прямой внутримышечной инъекции (например, в одно или более медленно сокращающихся волокон мышцы). В другом альтернативном варианте можно использовать катетер, вводимый в бедренную артерию, для доставки векторов AAV в печень через печеночную артерию. Также можно применять безоперационные средства, такие как эндоскопическая ретроградная панкреатохолангиография (ERCP), для доставки векторов AAV непосредственно в печень, таким образом, минуя кровоток и антитела против AAV. Для доставки векторов AAV индивидууму с предсуществующими антителами против AAV также можно использовать в качестве ворот другие проточные системы, такие как протоки подчелюстной железы.

[0075] "Профилактика" и ее грамматические варианты означают способ, в котором приведение в контакт, введение или доставка in vivo индивидууму проводят до заболевания. Введение или доставку in vivo индивидууму можно проводить до развития неблагоприятного симптома, состояния, осложнения и т.д., вызываемого или ассоциированного с заболеванием. Например, можно использовать скрининг (например, генетический) для идентификации таких индивидуумов, как кандидаты для способов и применений по изобретению, но заболевание может не манифестировать у индивидуума. Таким образом, такие индивидуумы включают индивидуумов, у которых выявили положительный результат при скрининге в отношении недостаточного количества или недостаточности функционального продукта гена (белка) или у которых продуцируется аберрантный, частично функциональный или нефункциональный продукт гена (белок), который может приводить к заболеванию, и индивидуумов, у которых выявили положительный результат при скрининге в отношении аберрантного или дефектного (мутантного) продукта гена (белка), который приводит к заболеванию, даже если у таких индивидуумов не проявляются симптомы заболевания.

[0076] Способы и применения по изобретению включают доставку и системное, местное или локальное введение или любым путем, например, посредством инъекции, инфузии, перорально (например, приема внутрь или ингаляции) или местно (например, трансдермально). Такой вид доставки и введения включает внутривенное, внутримышечное, интраперитонеальное, интрадермальнное, подкожное, внутриполостное, внутричерепное, трансдермальное (местное), парентеральное, например, трансмукозальное или ректальное. Иллюстративные пути введения и доставки включают внутривенный (в/в), интраперитонеальный (и/п), внутриартериальный, внутримышечный, парентеральный, подкожный, внутриплевральный, местный, дермальный, интрадермальный, трансдермальный, парентеральный, например, трансмукозальный, внутричерепной, интраспинальный, пероральный (алиментарный), мукозальный, респираторный, интраназальный, интубвционный, внутрилегочный, внутрилегочную инстилляцию, буккальный, сублингвальный, внутрисосудистый, интратекальный, внутриполостной, ионофоретический, внутриглазной, офтальмологический, газной, внутрижелезистый, внутриорганный, внутрилимфатический.

[0077] Дозы для доставки и введения могут зависеть от существующих в настоящее время протоколов, эмпирически определяемых с использованием моделей заболевания на животных или необязательно в клинических испытаниях на человеке. Начальная исследуемая доза может быть основана на исследованиях на животных, указанных в настоящем описании, например, на мыши или собаке.

[0078] Дозы могут изменяться и зависят от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим, типа, начала заболевания, прогрессирования, тяжести, частоты, продолжительности или вероятности заболевания, на которое направлено лечение, желательной клинической конечной точки, предшествующих или сопутствующих видов лечения, общего состояния здоровья, возраста, пола, расы или иммунокомпетентности индивидуума и других факторов, которые будут понятны специалисту в данной области. Дозируемое количество, число, частота или продолжительность можно пропорционально повышать или понижать, на что указывают любые неблагоприятные побочные эффекты, осложнения или другие факторы риска лечения или терапии и статус индивидуума. Специалисту в данной области будут понятны факторы, которые могут влиять на дозирование и период времени, необходимый для предоставления количества, достаточного для обеспечения терапевтического или профилактического действия.

[0079] Способы и применения по изобретению, как описано в настоящем описании, можно проводить через 1-2, 2-4, 4-12, 12-24 или 24-72 часов после того, как индивидуума идентифицировали как страдающего заболеванием, на которое направлено лечение; индивидуум проявляет один или более симптомов заболевания, или его подвергли скринингу и идентифицировали как положительного, как указано в настоящем описании, даже если индивидуум не проявляет один или более симптомов заболевания. Кроме того, способы и применения по изобретению можно проводить через 1-7, 7-14, 14-21, 21-48 или более суток, месяцев или лет после того, как индивидуума идентифицировали как страдающего заболеванием, на которое направлено лечение; индивидуум проявляет один или более симптомов заболевания или его подвергли скринингу и идентифицировали как положительного, как указано в настоящем описании.

[0080] Векторы AAV и другие композиции, средства, лекарственные средства, биологические препараты (белки) можно вводить в фармацевтические композиции, например, фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Такие фармацевтические композиции являются пригодными, в частности, для введения и доставки индивидууму in vivo или ex vivo.

[0081] Как используют в настоящем описании, термин "фармацевтически приемлемый" и "физиологически приемлемый" означает биологически приемлемый состав, газообразный, жидкий или твердый или их смесь, которая является подходящей для одного или более путей введения, доставки in vivo или приведения в контакт. Такие составы включают растворители (водные или неводные), растворы (водные или неводные), эмульсии (например, масло-в-воде или вода-в-масле), суспензии, сиропы, эликсиры, дисперсионные и суспензионные среды, покрытия, изотонические и способствующие или замедляющие всасывание средства, совместимые с фармацевтическим введением или приведением в контакт или доставкой in vivo. Водные и неводные растворители, растворы и суспензии могут включать суспендирующие средства и загущающие средства. Такие фармацевтически приемлемые носители включают таблетки (с покрытием или без покрытия), капсулы (твердые или мягкие), микрогранулы, порошок, гранулы и кристаллы. В композиции также можно вводить дополнительные активные соединения (например, консерванты, антибактериальные, противовирусные и противогрибковые средства).

[0082] Фармацевтические композиции можно формулировать, чтобы они являлись совместимыми с конкретным путем введения или доставкой, как указано в настоящем описании или известно специалисту в данной области. Таким образом, фармацевтические композиции содержат носители, разбавители или эксципиенты, подходящие для введения различными путями.

[0083] Составы, подходящие для парентерального введения, содержат водные и неводные растворы, суспензии или эмульсии активного соединения, препараты которого, как правило, являются стерильными и могут быть изотоническими по отношению к крови предполагаемого реципиента. Неограничивающие иллюстративные примеры включают воду, физиологический раствор, декстрозу, фруктозу, этанол, животные жиры, растительные или синтетические масла.

[0084] Для трансмукозального или трансдермального введения (например, местное контактирование) в фармацевтическую композицию можно вводить смачивающие средства. Смачивающие средства хорошо известны в данной области и включают, например, для трансмукозального введения детергенты, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты. Для трансдермального введения активные ингредиенты можно формулировать в аэрозоли, спреи, мази, бальзамы, гели или кремы, как в основном известно в данной области. Для контактирования с кожей фармацевтические композиции, как правило, включают мази, кремы, лосьоны, пасты, гели, спреи, аэрозоли или масла. Носители, которые можно использовать, включают вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли, спирты, трансдермальные энхансеры и их сочетания.

[0085] В состав также можно добавлять совместные растворители и адъюванты. Неограничивающие примеры совместных растворителей содержат гидроксильные группы или другие полярные группы, например, спирты, такие как изопропиловый спирт, гликоли, такие как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, простой гликолевый эфир, глицерин, полиоксиэтиленовые спирты и сложные эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот. Адъюванты включают, например, поверхностно-активные вещества, такие как, соевый лецитин и олеиновая кислота, сложные эфиры сорбитана, такие как триолеатсорбитана, и поливинилпирролидон.

[0086] Фармацевтические составы и системы доставки, подходящие для композиций и способов по изобретению, известны в данной области (см., например, Remington: The Science и Practice of Pharmacy (2003) 20^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) 18^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12^th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11^th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, и Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315).

[0087] "Стандартная лекарственная форма", как используют в настоящем описании, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для индивидуума, подлежащего лечению, где каждая единица содержит предопределенное количество необязательно в ассоциации с фармацевтическим носителем (эксципиентом, разбавителем, носителем или наполнителем), которое рассчитывают так, что при введении в одной или более дозах оно оказывает желаемое действие (например, профилактический или терапевтический эффект). Стандартные лекарственные формы могут находиться, например, в ампулах и флаконах, которые могут содержать жидкую композицию или композицию в высушенном сублимацией или лиофилизированном состоянии; можно добавлять стерильный жидкий носитель, например, до введения или доставки in vivo. Отдельные стандартные лекарственные формы могут содержаться в многодозовых наборах или контейнерах. Фармацевтические составы можно упаковывать в однократную или многократную стандартную лекарственную форму для облегчения введения и однородности дозирования.

[0088] Изобретение относится к наборам с упаковочным материалом и одним или более его компонентами. Набор, как правило, содержит этикетку или вкладыш в упаковку, содержащий описание компонентов или инструкции по применению in vitro, in vivo или ex vivo его компонентов. Набор может содержать комплект таких компонентов, например, вектор AAV и необязательно второе активное соединение, такое как другое соединение, средство, лекарственное средство или композиция.

[0089] Термин "упаковочный материал" относится к физической структуре, содержащей компоненты набора. Упаковочный материал может сохранять компоненты стерильными и может быть выполнен из вещества, широко используемого для таких целей (например, бумаги, гофрированной фибры, стекла, пластика, фольги, ампулы, флакона, пробирки и т.д.).

[0090] Этикетки или вкладыши могут содержать идентифицирующую информацию одного или более компонентов, количества доз, клинического фармакологически активного ингредиента(ов), включая механизм действия, фармакокинетику и фармакодинамику. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию, идентифицирующую производителя, номер партии, местоположение производителя и дату, сроки годности. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию, идентифицирующую производителя, номер партии, местоположение производителя и дату. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию о заболевании, для которого можно использовать компонент набора. Этикетки или вкладыши могут содержать инструкции для клинициста или индивидуума по использованию одного или более компонентов набора в способе, применении или протоколе лечения или схеме лечения. Инструкции могут содержать величины доз, частоту или продолжительность и инструкции по практическому осуществлению любого из способов, применений, протоколов лечения или профилактической или терапевтических схемы, описываемых в настоящем описании.

[0091] Этикетки или вкладыши могут содержать информацию о любом благоприятном действии, которое может оказывать компонент, таком как профилактическое или терапевтическое действие. Этикетки или вкладыши могут содержать информацию о возможных неблагоприятных побочных эффектах, осложнениях или реакциях, такую как предупреждения для индивидуума или клинициста касательно ситуаций, когда применение конкретной композиции является неподходящим. Неблагоприятные побочные эффекты или осложнения также могут возникать, когда индивидуум принимал, будет принимать или в настоящее время принимает одно или более других лекарственных средств, которые могут являться несовместимыми с композициями, или индивидуум подвергался, будет подвергаться или в настоящее время подвергается другому протоколу лечения или схеме лечения, которая является несовместимой с композициями, и, таким образом, инструкции могут содержать информацию касательно таких типов несовместимости.

[0092] Этикетки или вкладыши содержит "печатный материал", например, бумагу или картон, или отдельный или прикрепленный к компоненту, набор или упаковочный материал (например, коробку), или прикрепленный к ампуле, пробирке или флакону, содержащему компонент набора. Этикетки или вкладыши могут дополнительно содержать машиночитаемый носитель, такой как отпечатанная этикетка со штриховым кодом, диск, оптический диск, такой как CD- или DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, магнитная лента или среда для электрического хранения информации, такая как RAM и ROM или их гибриды, такие как среда магнитного/оптического хранения информации, флеш-среды или типы карт памяти.

[0093] Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, как общепринято понимает специалист в данной области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать способы и вещества, аналогичные или эквивалентные, способам и веществам, описываемым в настоящем описании, подходящие способы и вещества описаны в настоящем описании.

[0094] Все заявки, публикации, патенты и другие ссылочные материалы, итерирования GenBank и цитирования ATCC, цитируемые в настоящем описании, полностью включены посредством ссылки. В случае противоречия описание, включая определения, является определяющим.

[0095] Все признаки, описываемые в настоящем описании, можно комбинировать в любой комбинации. Каждый признак, описываемый в описании, можно заменять альтернативным признаком, служащим аналогичной, эквивалентной или сходной цели. Таким образом, если явно не указано иное, описываемые признаки (например, структуры соединения) представляют собой пример рода эквивалентных или сходных признаков.

[0096] Как используют в настоящем описании, формы единственного числа включают референты множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на "полинуклеотид" включает совокупность таких полинуклеотидов, таких как совокупность генов.

[0097] Как используют в настоящем описании, все численные значения или диапазоны числовых значений включают целые числа в таких диапазонах и дроби величин или целых чисел в диапазонах, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, в качестве иллюстрации ссылка по меньшей мере на 90% идентичность включает 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98%, 99% и т.д., а также 91,1%, 91,2%, 91,3%, 91,4%, 91,5% и т.д., 92,1%, 92,2%, 92,3%, 92,4%, 92,5% и т.д., и т.п.

[0098] Ссылка на число более (большее) или менее включает любое число больше или меньше ссылочного числа соответственно. Таким образом, например, ссылка на менее 1000 включает 999, 998, 997 и т.д. - все вплоть до числа один (1), и менее 100 включает 99, 98, 97 и т.д. - все вплоть до числа один (1).

[0099] Как используют в настоящем описании, все числовые значения или диапазоны включают дроби значений и целые числа в таких диапазонах и дробях целых чисел в таких диапазонах, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, в качестве иллюстрации ссылка на диапазон числовых значений, таких как диапазон процентов 90-100%, включает 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97% и т.д., а также 91,1%, 91,2%, 91,3%, 91,4%, 91,5% и т.д., 92,1%, 92,2%, 92,3%, 92,4%, 92,5% и т.д., и т.п. Таким образом, ссылка на диапазон 1-50 включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д., а также 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 и т.д., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 и т.д., и т.п.

[0100] Ссылка на серии диапазонов включает диапазоны, которые объединяют значения границ различных диапазонов в сериях. Таким образом, в качестве иллюстрации ссылка на серии диапазонов 2-72 часов, 2-48 часов, 4-24 часов, 4-18 часов и 6-12 часов включает диапазоны 2-6 часов, 2, 12 часов, 2-18 часов, 2-24 часов и т.д. и 4-27 часов, 4-48 часов, 4-6 часов и т.д.

[0101] Изобретение в основном описано в настоящем описании с использованием утвердительного языка для описания различных вариантов осуществления и аспектов. Изобретение также конкретно включает варианты осуществления, в которых конкретный объект изобретения полностью или частично исключается, такой как вещества или материалы, этапы и условия способа, протоколы или способы. Например, в определенных вариантах осуществления или аспектах изобретения исключают вещество и/или этапы способа. Таким образом, даже если изобретение, как правило, не выражено в настоящем описании в отношении того, что изобретение не включает аспекты, которые явным образом не исключены в изобретении, тем не менее, описываются в настоящем описании.

[0102] Описан ряд вариантов осуществления изобретения. Однако специалист в данной области может проводить различные изменения и модификации изобретения для адаптации к различным применениям и условиям, не выходя за рамки сущности и объема изобретения. Таким образом, следующие ниже примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения объема заявляемого изобретения.

Примеры

Пример 1

Этот пример содержит описание различных веществ и способов.

[0103] Мыши. Самцы мышей C57BL/6J (WT) в возрасте 8-10 недель, n=5 в экспериментальной группе. Собака представляет собой собаку HB из колонии University of North Carolina Chapel Hill, несущую мутацию с изменением смысла в гене FIX (Evans et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10095 (1989)).

[0104] Конструкции вектора AAV. Исследования in vivo на мышах проводили с использованием конструкции, экспрессирующей FIX человека под контролем печеньспецифического промотора ApoE-hAAT. В исследовании на собаках использовали практически одинаковый промотор и трансген FIX собаки.

[0105] Способ переноса генов. Все векторы доставляли внутривенно. Мышам через хвостовую вену (вводили объем 200 микролитров на мышь, вектор разбавляли в PBS). Собакам вектор доставляли через подкожную вену.

[0106] Определение экспрессии FIX. Для измерения уровней FIX использовали ELISA. Для мышей пара антител против FIX человека ELISA (захватывающее и вторичное) являлись от Affinity Biologicals. Для собак использовали также пару антител от Affinity Biologicals, как описано у Haurigot et al. (Mol. Ther., 18:1318 (2010)).

[0107] Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием неспаренного двухстороннего t-критерия. Значения p<0,05 считали статистически значимыми.

[0108] Измерения антитела против AAV. Для измерений антитела использовали анализ нейтрализации in vitro, описанный у Manno et al., (Nat. Med., 12:342 (2006)) и Mingozzi et al. (Nat. Med., 13:419 (2007)). В кратком изложении в анализе использовали две конструкции вектора AAV: одноцепочечный вектор, экспрессирующий β-галактозидазу под контролем промотора CMV (ssAAV-LacZ), или самокомплементарный вектор, экспрессирующий репортерный ген Renilla, AAV-Rh74-CBA-Renilla, под контролем промотора β-актина курицы (CBA). Для повышения эффективности трансдукции векторов AAV in vitro 2V6,11 клетки (ATCC) использовали, который экспрессировал ген E4 аденовируса под контролем индуцибельного промотора. Клетки высевали на 96-луночный планшет в плотности 1,25×10⁴ клетки/лунку и добавляли в среду понастерон A (Invitrogen) в разбавлении 1:1000 для индукции экспрессии E4. На сутки анализа серийные полулогарифмические разбавления инактивированной нагреванием тестируемой сыворотки смешивали со средой, содержащей вирус. Для вектора ssAAV-LacZ используемая в анализе концентрация вируса составляла ~1×10¹⁰ гв/мл для AAV2 и ~5,5×10¹⁰ гв/мл для AAV5, 6 или 8. Для вектора scAAV-Luc концентрация вируса в анализе находилась в диапазоне от ~50 до 150 раз ниже. Остаточную активность репортерного трансгена измеряли колориметрическим анализом (ssAAV-LacZ) или с использованием люминометра (scAAV-Luc).

[0109] Измеряли общий IgG или подклассы Ig против капсида AAV с использованием анализа с захватом; планшеты ELISA покрывали 5×10¹⁰ капсидных частиц/мл пустых капсидов AAV. Планшеты блокировали 2% BSA, 0,05% Tween 20 в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре и помещали серийные разведения образцов в лунки и инкубировали в течение ночи при 4°C. В качестве детектируемых антител использовали конъюгированное с биотином антитело против IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или IgM человека (Sigma); для детекции субстрата добавляли стрептавидин-HRP. Концентрацию Ig определяли против стандартных кривых, получаемых с серийными разведениями очищенных IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или IgM человека (Sigma).

[0110] Продукция AAV. Способ получения вектора подробно описан у Ayuso et al. (Gene Ther., 17:503 (2010)).

Пример 2

Этот пример содержит описание исследований переноса животным (мышам) гена FIX человека и экспрессии FIX после переноса гена.

[0111] Мышам C57BL/6 (n=5 в группе) инъецировали через хвостовую вену векторы AAV, несущие ген фактора IX (FIX) (2,5¹⁰ геномов вектора на мышь) под контролем печеньспецифического промотора. Уровни продукта трансгена (белка) FIX человека в плазме у мышей определяли ELISA через 1, 2 и 4 недели после переноса гена, и они проиллюстрированы на фигуре 1. Для AAV-Rh74 демонстрировали самый высокий уровень экспрессии трансгена у животных.

Пример 3

Этот пример содержит описание исследования на животных и данные, демонстрирующие эффективную опосредованную AAV-Rh74 доставку FIX на терапевтических уровнях у собак с гемофилией.

[0112] В кратком изложении собакам с гемофилией B проводили внутривенную (в/в) инфузию через подкожную вену 3×10¹² геномов вектора на кг массы. Экспрессия терапевтического трансгена FIX регулировалась печеньспецифическим промотором. Уровни векторов и FIX наблюдали посредством ELISA. Уровни FIX в плазме собаки представлены на фигуре 2. AAV-Rh74 и AAV8 действовали практически одинаково у собак с гемофилией B, и оба превосходили AAV6.

Пример 4

Этот пример содержит описание исследований, демонстрирующих наличие нейтрализующих антител (NAb) против AAV у людей.

[0113] Данные в таблице 1 демонстрируют нейтрализующие антитела (NAb) против AAV, измеряемые у людей анализом in vitro. Индивидуумов с титром NAb 1:1 определяли как интактные или с низким титром антител против AAV и подходящих для переноса гена для серотипа AAV (выделено серым). Для AAV-Rh74 демонстрировали наименьшее распространение Nab против AAV по сравнению с AAV-2 и AAV-8.

Пример 5

Этот пример содержит описание данных, демонстрирующих продукцию количеств различных серотипов AAV, включая AAV-Rh74.

[0114] Данные в таблице 2 демонстрируют выход продукции различных серотипов AAV. Представлены объем партии вируса во вращающихся флаконах, общий выход вектора и выход на флакон. Все серотипы упаковывали в одну и ту же экспрессирующую кассету. AAV-Rh74 обладал выходом, сравнимым или выше, чем у других оцениваемых серотипов, а именно AAV-8, AAV-dj и AAV-2.

Пример 6

Этот пример содержит описание данных, демонстрирующих, что вектор AAVrh74, экспрессирующий фактор IX (FIX) человека под контролем печеньспецифического промотора, вводимый макакам-резус, приводил к продукции определенного количества FIX у животных и при более высоких уровнях по сравнению с вектором AAV8, вводимым в таком же количестве.

[0115] В кратком описании животным вводили AAV8 или AAVrh74 в дозе 2×10¹² геномов вектора (гв)/кг массы. Векторы формулировали в физиологическом растворе или в смеси вектора и пустого капсида AAV (обозначаемого EC).

[0116] Фигура 4 представляет собой гистограмму усредненного значения (недели от 2 до 8) и стандартной ошибки или среднего значения FIX человека, измеряемого ELISA, которым специфически детектируют FIX человека в плазме макаки-резус. Животные, получавшие вектор AAVrh74-FIX, продемонстрированы в двух последних столбиках с правого края. Данные демонстрируют, что у животных, получавших векторы AAVrh74 (последние два столбика с правого края), экспрессировался трансген FIX на более высоких уровнях по сравнению с другими группами животных, которым инъецировали аналогичную дозу (черные и серые столбики). Усредненные уровни сравнивали с использованием непарного двустороннего t-критерия Стьюдента.