Гидробромид 4'-(2,3-дигидро-9Н-имидазо[1,2-а]бензимидазол-9-ил-метил)бифенил-2-карбонитрил, проявляющий свойства активатора АМФ-активируемой протеинкиназы (АМРК)

Изобретение относится к новым производным в ряду производных 2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола, а именно к неописанному ранее гидробромиду 4'-(2,3-Дигидро-9Н-имидазо[1,2-а]бензимидазол-9-ил-метил)бифенил-2-карбонитрил формулы I

влияющими на углеводный и липидный метаболизм, и проявляющими свойства активатора АМФ-активируемой протеинкиназы (АМРК) и может быть использовано в лечении сахарного диабета 2 типа (СД2).

Сахарный диабет 2-ого типа (СД2) - заболевание, затрагивающее более 180 миллионов человек во всем мире - характеризуется резистентностью к инсулину, недостаточной утилизацией глюкозы и увеличением глюконеогенеза. В результате развивается гипергликемия и гиперлипидемия, которые, в свою очередь, вызывают диабетические осложнения, такие как потеря зрения, почечная и сердечная недостаточность.

Применение существующих антидиабетических препаратов осложнено риском развития гипогликемии, увеличением массы тела и неблагоприятными эффектами со стороны желудочно-кишечного тракта (тошнота, рвота, диарея, кишечные колики, метеоризм). Монотерапия эффективна лишь непродолжительное время и в дальнейшем не способна поддерживать стабильный уровень глюкозы, что обусловливает необходимость применения комбинированной пероральной сахароснижающей терапии уже на ранних этапах заболевания [1].

Большинство современных антидиабетических лекарственных средств (например, сенсибилизаторы и секретагоги инсулина, инкретиномиметики) снижают уровень глюкозы за счет улучшения периферической чувствительности к инсулину и/или увеличения секреции инсулина. Метформин является единственным препаратом, основным механизмом действия которого является косвенное снижение эндогенного образования глюкозы [2].

Метформин увеличивает инсулин-опосредованное усвоение глюкозы в мышцах и снижает выработку глюкозы в печени. Также влияет на метаболизм липидов, снижая уровень триглицеридов и свободных жирных кислот в плазме, крови. Основной мишенью, через которую реализуются эффекты метформина, считается АМФ-активируемая протеинкиназа (АМРК) [3].

АМРК играет ключевую роль в регуляции энергетического гомеостаза клетки. АМРК существует в виде гетеротримерного комплекса, состоящего из каталитической субъединицы α и регуляторных β и γ субъединиц. Связывание AMP с γ субъединицей аллостерически активирует комплекс, облегчая фосфорилирование Thrl72 вышестоящими киназами LKB1 и СаМККβ. АМРК активируется в ответ на стрессы, истощающие клеточный пул АТФ (низкий уровень глюкозы, гипоксия и ишемия) и через ряд сигнальных путей в ответ на воздействие адипонектина, лептина и некоторых других факторов [4].

Являясь сенсором клеточной энергии, реагирующим на повышение соотношения АМФ/АТФ, активация АМРК позитивно регулирует пути, способствующие пополнению клеточного запаса АТФ, в том числе, активируется окисление жирных кислот и аутофагия. АМРК негативно регулирует АТФ-потребляющие биосинтетические процессы, включая глюконеогенез, липидный и белковый синтез. АМРК воздействует на данные процессы путем непосредственного фосфорилирования ряда ферментов, участвующих в этих процессах, а также через транскрипционный контроль метаболизма путем фосфорилирования транскрипционных факторов, ко-активаторов и ко-репрессоров.

Благодаря ключевой роли в регуляции метаболизма глюкозы и липидов, АМРК рассматривается как перспективная терапевтическая мишень для лечения СД 2, ожирения, метаболического синдрома и опухолевых заболеваний. Также показано, что АМРК является важным модулятором процесса старения, что реализуется через взаимодействие с mTOR (мишень рапамицина у млекопитающих) и сиртуинами [5].

При СД 2 основными инсулинорезистентностными органами являются печень, мышцы и жировая ткань. В печени АМРК контролирует гомеостаз глюкозы главным образом через ингибирование экспрессии генов глюконеогенеза. Кроме того, активация АМРК увеличивает фосфорилирование GSK3β (киназы гликогенсинтазы типа 3β), и, таким образом, снижает транскрипционную активность CRE (цАМФ-зависимых элементов ДНК) и экспрессию гена РЕРСК-С в печени, подавляя глюконеогенез. АМРК также уменьшает печеночный липогенез. Активация АМРК миоцитов увеличивает окисление жирных кислот за счет уменьшения концентрации малонил-КоА-редуктазы путем ингибирования АСС и активации MCD. Повышенное окисление жирных кислот в митохондриях препятствует депонированию липидов и повышает чувствительность мышц к инсулину. Хроническая активация мышечной АМРК стимулирует окисление липидов и образование АТФ путем активации транскрипции митохондриальных ферментов β-окисления жирных кислот через ко-активатор PPAR (PGC-lα).

На инсулинрезистентных крысах, получавших высокожировую диету, показано, что после однократного введения AICAR (экспериментального активатора АМРК) в течение 24 повышается чувствительность к инсулину мышечной ткани, печени и организма в целом. Хроническая активация АМРК увеличивает уровни GLUT4, глюкокиназы и содержание гликогена в скелетных мышцах [6].

Таким образом, фармакологическая активация АМРК в печени и мышцах обладает широким спектром метаболических эффектов с высоким антидиабетогенным потенциалом. Также, активаторы АМРК могут рассматриваться в качестве противоопухолевых и геропротективных средств [7,8]. В настоящее время ведется активная разработка лекарственных средств данного класса, однако ни одно из них не дошло до стадии клинических испытаний [9].

Известны производные 2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола проявляющие антисеротониновую, антиаритмическую, антиоксидантную, антиагрегантную антитромботическую, гемореологическую активность, а также влияющие на уровень глюкозы крови [10-13].

Наиболее близким по выполнению является 9-(бифенил-4-ил-метил)-2,3-дигидро-9H-имидазо[1,2-а]бензимидазол, содержащий в молекуле фрагмент бифенила и проявляющий противопаразитарную активность в отношении простейших Leishmania donovani и Trypanosoma cruzi [14].

Техническим результатом изобретения является новое соединение в ряду производных 2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола, проявляющее новое для данного ряда свойство - активатора АМРК.

Технический результат достигается соединением формулы I.

Способ получения соединение I заключается в алкилировании 2,3-дигидро-имидазо[1,2-а]бензимидазола 2-циано-4'-бромметилбифенилом по нижеприведенной схеме.

Пример синтеза соединения I, а также данные исследований биологической активности гидробромида соединения I приведены ниже.

Пример 1. Получение гидробромида 4'-(2,3-дигидро-9Н-имидазо[1,2-а]бензимидазол-9-ил-метил)бифенил-2-карбонитрил.

Стадия 1. 2-циано-4'-бромметилбифенил получен по модифицированной методике [15]. Раствор 0.97 г (5 ммол) 2-циано-4'-метилбифенила, 0.89 г (5 ммол) бромсукцинимида и 84 мг (0.3 ммол) бензоилпероксида в 20 мл четыреххлористого углерода кипятят с обратным холодильником в течение 3-4 час. Затем реакционную массу фильтруют, отделяя сукцинимид, охлаждают, растворитель упаривают. Сырой продукт 2-циано-4'-бромметилбифенила сушат на воздухе и далее используют без дополнительной очистки.

Стадия 2. Гидробромид 4'-(2,3-дигидро-9Н-имидазо[1,2-а]бензимидазол-9-ил-метил)-бифенил-2-карбонитрил (I). Смесь 0.43 г (2.7 ммоль) 2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола и 0.73 г (2.7 ммоль) 2-циано-4'-бромметилбифенила в 2 мл ДМФА, очищенного от аминов, кипятят в течение 6 ч. Потемневшую реакционную смесь охлаждают и инкубируют в течение двух дней при температуре 5°-6°С. Осадок соединения (I) отфильтровывают, промывают ацетоном. Выход 0.7 г (60%), т.пл. 246°-247°С (этанол). ИК-спектр, v_max, см^-1: 2226, 1675, 1606, 1551. Найдено, %: С 63.94; Н 4.35; Вr 18.41; N 12.87. C₂₃H₁₈N₄ НВr. Вычислено, %: С 64.05; Н 4.44; Вr 18.53; N 12.99. ¹Н-ЯМР-спектр, δ, м.д., J (Гц): 4.36-4.43 (м, 4Н, СН₂СН₂); 5.48 (с, 2Н, N-CH₂); 7.24 и 7.36 (оба т, J=7.6, 6,7-Н, оба по 1H); 7.48-7.63 (м, 8Н, Н_Аr); 7.76-7.81 (т, J=7.8, 1H, Н_Аr); 7.92-7.96 (д, J=7.6, 1Н, Н_Ar); 9.83 (ш.с., 1H, N⁺H).

Пример 2. Определение активности АМРК

Использовались следующие материалы и оборудование: АМРК (A1/B1/G1) Kinase Enzyme System (Promega #V1921, США); ADP-Glo™ Kinase Assay (Promega #V9101, США). Планшет 96-луночный белый (Thermo Scientific NUNC #165306, США).

Термошейкер для планшетов PST-60HL (Biosan, Латвия). Микропланшетный ридер Infinite М200 PRO (Тесаn, Австрия).

Реакционная смесь содержала 50 нг АМРК (A1/B1/G1), 100 мкМ АТФ, 100 мкМ АМФ, 0.2 мг/мл SAMStide (HMRSAMSGLHLVKRR), полученного из мышиной ацетил-коэнзим А карбоксилазы а (аминокислоты 73-85) в конечном объеме 25 мкл. Реакционный буферный раствор: 40 мМ Трис (рН 7.5), 20 мМ MgCl₂, 0.1 мг/мл БСА, 50 мМ ДТТ. Инкубация: 60 мин. при 25°С. Детекция: измерение люминесценции, время интегрирования 500 мс. Исследуемые вещества вносились в реакционную смесь в реакционном буферном растворе, содержащем 1,25% ДМСО и исследовались в конечной концентрации 100 мкМ в двух повторениях в соответствии с СОП и руководством производителя реактивов [16]. Активность фермента рассчитывалась по отношению к отрицательному контролю - 100 мкМ АМФ, вызывающему максимальное АМФ-индуцированное активирование согласно предварительным исследованиям. В качестве вещества сравнения использован амино-4-имидазол карбоксамида рибозид (AICAR, Sigma, США) [17], известный как экспериментальный активатор АМРК.

Результаты проведенных испытаний по определению влияния заявленного соединения на активность АМРК представлены в таблице 1 и на Фиг. 1. Из данных, приведенных в Таблице 1 и на Фиг. 1 видно, что заявленное соединение статистически значимо активирует АМРК. Так, в концентрации 100 мкМ оно способно увеличивать активность фермента более чем на 162% относительно базового уровня. Параметр ЕС₅₀ при этом составляет 109,2 мкМ. Представленный результат по параметру увеличения уровня активности фермента АМРК превосходит стандартное вещество сравнения AICAR.

^* Статистически значимо отличается от отрицательного контроля по непарному критерию Манна-Уитни (р<0,05).

Как видно, соединение I проявляет новое для ряда 2,3-дигидроимидазо[1,2-a] бензимидазола свойство активатора АМФ-активируемой протеинкиназы (АМРК). При этом свойство находится на уровне используемого экспериментального активатора АМРК.

Источники информации

1. Mohler M.L. и др. Recent and emerging anti-diabetes targets // Med. Res. Rev. 2009. T. 29. №1. C. 125-195.

2. Hundal R.S., Krssak M., Dufour S. Mechanism by which metformin reduces gluocse production in type 2 diabetes // Diabetes. 2000. №49. C. 2063-9.

3. Zhou G. и др. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action // J. Clin. Invest. 2001. T. 108. №8. С. 1167-1174.

4. Hardie D.G. AMPK: Positive and negative regulation, and its role in whole-body energy homeostasis // Curr. Opin. Cell Biol. 2015. T. 33. C. 1-7.

5. Zhang B.B., Zhou G., Li C. AMPK: An Emerging Drug Target for Diabetes and the Metabolic Syndrome // Cell Metab. 2009. T. 9. №5. C. 407-116.

6. Yu X. и др. Leptinomimetic effects of the AMP kinase activator AICAR in leptin-resistant rats: Prevention of diabetes and ectopic lipid deposition // Diabetologia. 2004. T. 47. №11. C. 2012-2021.

7. Goodman M. AMPK Activators as a Drug for Diabetes, Cancer and Cardiovascular Disease // Pharm. Regul. Aff. Open Access. 2014. - T. 3.- №2.- C. 2-7.

8. Wang W., Guan K.L. AMP-activated protein kinase and cancer // Acta Physiol. 2009. T. 196. №1. C. 55-63.

9. Giordanetto F., Karis D. Direct AMP-activated protein kinase activators: a review of evidence from the patent literature. // Expert Opin. Ther. Pat. 2012. T. 22. №12. C. 1467-1477.

10. Анисимова В.А., Спасов A.A., Толпыгин И.Е. и др. Синтез и фармакологическая активность 1-диалкил(алкил)аминоэтил-2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазолов //Хим.-фарм. журн.-2010.- Т.44.-№5.-С. 8-12.

11. Анисимова В.А., Толпыгин И.Е., Спасов А.А. и др. Синтез и фармакологическая активность ароилметилзамещенных трициклических бензимидазольных систем, содержащих гидроксигруппы в ароильном радикале // Хим.-фарм. журн. 2007. - Т.41.-№-3. С. 9-13.

12. Анисимова В.А., Спасов А.А., Косолапое В.А. и др. Синтез и фармакологическая активность амидов 2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазолил-N-уксусных кислот // Хим.-фарм. журн. 2012.- Т.46.- №11.- С. 15-20.

13. Анисимова В.А., Спасов А.А., Толпыгин И.Е. и др. Синтез и биологическая активность N-ацилметил-замещенных 9Н-2,3-дигидроимидазоИ 10Н-2,3,4,10-тетра-гидропиримидо[1,2-а]бензимидазолов и продуктов их восстановления // Хим.-фарм. журн.- 2006. - Т.40.-№5. - С. 27-33.

14. Sangmi Oh, Sungbum Kim, Sunju Kong et all. Synthesis and biological evaluation of 2,3-dihydroimidazo[l,2-a]benzimidazole derivatives against Leishmania donovani and Trypanosoma cruzi // European Journal of Medicinal Chemistry (2014); DOI: 10.1016/j.ejmech.2014.07.038.

15. Carini D.J., Duncia J.V., Aldrich P.E., et. all. J. Med. Chem. 1991, 34, 2525.

16. Promega. Technical Manual TM313 ADP-Glo™ Kinase Assay // 2015. C. 1-21.

17. Corton J.M. и др. 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside. A specific method for activating AMP-activated protein kinase in intact cells? // Eur. J. Biochem. 1995. T. 229. №2. C. 558-565.