Способ определения риска развития кальцинатов при поликистозной болезни почек у детей

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, урологии, и может быть использовано при прогнозировании осложнений при поликистозной болезни почек, повышающих тяжесть течения болезни, в частности к прогнозированию образования кальцинатов в кистах почек у детей.

Поликистозная болезнь почек представляет собой генетическое заболевание, проявляющееся кистозным перерождением паренхимы почек, одним из частых проявлений которой является аутосомно-доминантная поликистозная болезнь почек.

Актуальность проблемы заключается в том, что в структуре причин терминальной хронической почечной недостаточности (ХПН) у взрослых пациентов поликистозная болезнь почек занимает четвертое место и составляет с среднем 6-10%.

Появление множественных кист в раннем возрасте рассматривается как прогностически неблагоприятный фактор в связи с более высокими темпами прогрессирования заболевания. При этом распространенность мочекаменной болезни среди пациентов с множественными кистами в 5-10 раз больше, чем в общей популяции, а распространенность мочекаменной болезни, в частности, при аутосомно-доминантной поликистозной болезни почек в детском и подростковом возрасте достигает 20-36%, а к 40 годам уже 60%.

К серьезным осложнениям, которые возникают у детей с поликистозной болезнью почек на фоне развившегося нефрокальциноза и уролитиаза, относятся инфекции мочевых путей, тубулоинтерстициальный нефрит, гидронефроз, нефросклероз, что в конечном итоге не только значительно ухудшает качество жизни, но и приводит к более стремительному прогрессированию хронической болезни почек и ХПН.

Основной эффект цитрата - хелатирование ионов кальция в моче, которое происходит при молярном соотношении 4:1, при этом цитрат создает сильные, но растворимые комплексы с кальцием, посредством этого эффективно уменьшая концентрацию свободных ионов Ca⁺⁺ в моче. Снижение Ca⁺⁺ в моче уменьшает скорость кристаллизации оксалата и фосфата кальция.

Среди причин гипоцитратурии наиболее частыми являются употребление тиазидных диуретиков, ингибиторов карбоангидразы, дефицит магния, ацидоз, а также нарушения трансмембранного транспорта цитратов, снижение функции митохондрий, однако в большинстве случаев причины низкого уровня цитратов в настоящее время не ясны.

Определение цитратов, как и определение большинства биохимических показателей обмена веществ человека, прошло определенную эволюцию методов, от ручного титрования с визуальным контролем самих цитратов и его производных до капиллярного электрофореза и различных видов хроматографии, включая высокоэффективную жидкостную.

В большинстве работ рассматривается только возможность определения количественного или полуколичественного количества уровня цитратов мочи у пациентов без определения возможных рисков развития осложнений и прогрессирования заболеваний, таких как нефрокальциноз и уролитиаз [Дутов В.В. Растворение камней почек: кому? когда? как? Медицинский совет. 2016. №9. С. 84-90; Яровой С.К., Москалева Н.Г., Максудов P.P. Лекарственная терапия метаболических поражений костного скелета при мочекаменной болезни. Экспериментальная и клиническая урология. 2014. №2. С. 88-93; Голощапов Е.Т., Глазунова Е.В., Савенкова Т.А. Профилактика камнеобразования при двустороннем рецидивирующем нефролитиазе. Нефрология. 2008. Т. 12. №3. С. 89-94; Коган М.И., Хасигов А.В., Белоусов И.И. Особенности минеральных метаболических изменений крови и мочи у больных коралловидным нефролитиазом южного региона России. Медицинский вестник Башкортостана. 2012. Т. 7. №1. С. 56-59; Кустов А.В., Стрельников А.И., Айрапетян А.О., Морыганов М.А., Журавлева Н.И. Диагностика метаболических нарушений и метафилактика рецидивного кальций-оксалатного уролитиаза. Урология. 2015. №5. С. 86-88].

При этом в диагностике обычно использовались методики, разработанные в первой половине 20-го века, когда для определения цитратов не требовалось сложного аппаратурного обеспечения. Однако они включали в себя многочисленные манипуляции с большим количеством реактивов, включая прекурсоры, таких как серная кислота, калия перманганат, хлороформ, органические растворители, такие как метанол и петролейный эфир, стадии центрифугирования и фильтрации промежуточных продуктов, промывки преципитата. Ряд рабочих растворов требовал приготовления Ex-tempora. Многостадийность и трудоемкость не способствовали обеспечению высокой чувствительности проводимого исследования.

На результаты, получаемые этими методами, заметно влияли качество реактивов и качество приготовления рабочих реагентов. Кроме того, они были чувствительны к сопутствующим веществам, содержащимся в исследуемых образцах, что ограничивало их специфичность [Аляев Ю.Г., Кузьмичева Г.М., Рапопорт Л.М., Руденко В.И. Современные аспекты цитратной терапии у больных мочекаменной болезнью. Врачебное сословие. 2004; 4: 20-24; Голованова О.А. Патогенное минералообразование в организме человека. Известия Томского политехнического университета. 2009; 315 (3): 51-56].

Однако в уровне техники сведения об определении риска развития и прогнозирования течения нефрокальциноза и уролитиаза у пациентов с различной нефрологической патологией, в том числе и у пациентов с нефрокальцинозом при поликистозной болезни почек, отсутствуют.

Таким образов в настоящее время отсутствуют литературные данные, где бы решалась задача прогнозирования (определения) высокого риска развития кальцинатов у детей.

Проблема, решаемая настоящим изобретением, состоит в выявлении объективного показателя высокого риска развития кальцинатов при поликистозной болезни почек у детей.

Технический результат состоит в надежном прогнозировании развития кальцинатов при поликистозной болезни почек путем исследования биохимических компонентов мочи, что позволяет вовремя начать соответствующую терапию, включающую назначение цитратсодержащих препаратов.

Нами выявлен объективный прогностический показатель, позволяющий по уровню цитратов и содержанию креатинина в моче определять высокий риск развития кальцинатов при поликистозной болезни почек.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для определения риска развития кальцинатов при поликистозной болезни почек в моче определяют суточную экскрецию цитратов и содержание креатинина. Вычисляют цитрат-креатининовый индекс по формуле:

N=Ц/К,

где

N - цитрат-креатининовый индекс;

Ц - суточная экскреция цитратов, ммоль/л;

К - содержание креатинина в моче, ммоль/л.

При N меньше 0,3 риск развития кальцинатов в кистах почек определяют как высокий.

Суточная экскреция цитратов в моче может быть определена ферментативным методом.

Способ осуществляется следующим образом.

Суточную мочу для исследования собирают и хранят в прохладном месте (холодильник), определяют ее суточное количество и используют аликвоту мочи после ее освобождения от клеточного детрита, клеток крови, кристаллов центрифугированием.

Для определения экскреции цитратов в моче, собранной за сутки у детей с различными формами и тяжестью течения поликистозной болезни почек, могут быть использованы отечественные наборы для определения цитратов в биологических жидкостях «Фотоцитраты».

Методики определения креатинина в мочи известны специалистам.

Определение креатинина проводят с помощью фотометрического колориметрического теста для кинетических измерений (HUMAN, Германия). Принцип метода основан на том, что в щелочном растворе креатинин образует комплекс оранжево-красного цвета с пикриновой кислотой, абсорбция комплекса пропорциональна концентрации креатинина в образце. Реагенты: 1) раствор едкого натрия (1,6 ммоль/л) разводят дистиллированной водой в соотношении 1:4; 2) готовят рабочий раствор из пикриновой кислоты (26 ммоль/л) и полученного раствора едкого натра в соотношении 1:1 - рабочий раствор. Добавляют к 100 мкл образца (стандарта) 1000 мкл рабочего раствора и измеряют абсорбцию через 30 секунд (А1) и через 2 минуты (А2) при длине волны 492 нм А2-А1=ΔА образца (стандарта). Концентрацию креатинина в моче определяют по формуле:

ΔАобразца/ΔАстандарта×88,402=ммоль/л.

Ферментативный метод определения цитратов состоит в следующем.

Определение цитратов проводят с помощью набора «Фотоцитраты» (ООО «ИМПАКТ») для определения цитратов в моче ферментативным методом. Принцип метода основан на том, что ферментативный гидролиз лимонной кислоты в присутствии фермента цитратлиазы протекает до образования щавелевоуксусной кислоты, с последующим декарбоксилированием ее до пировиноградной кислоты и восстановлением образовавшихся кислот под действием восстановленного НАДН в присутствии ферментов L-малатдегидрогеназы (МДГ) и L-лактатдегидрогеназы (ЛДГ) до L-яблочной и L-молочной кислот. При этом НАДН превращается в окисленную форму НАД+. Уменьшение концентрации НАДН в исследуемом растворе пропорционально концентрации лимонной кислоты или ее соли. Изменение оптической плотности измеряют при длине волны 340 нм.

В состав набора входят реагенты:

1) Буфер глицилглицин, ОД моль/л, pH 7,8.

2) Суспензия ферментов - МДГ=600 ед./мл, ЛДГ+1400 ед/мл.

3) НАДН 0,1 ммоль/мл.

4) Фермент цитратлиаза 40 ед/мл.

5) Калибратор (раствор лимонной кислоты 1,04 ммоль/л).

Для анализа используют 0,1 мл суточной мочи. К образцу добавляют 1,0 мл реагента 1; 0,02 мл реагента 2; 0,05 мл реагента 3; 0,1 мл дистиллированной воды. Через 2 минуты измеряют оптическую плотность (А1). Добавляют 0,1 мл реагента 4 и измеряют оптическую плотность через 3 минуты (А2). Для расчета используют разности оптических плотностей холостой, калибровочной пробы и образца.

C=ΔАобразца/ΔАкалибр. пробы×1,04×F=ммоль/л,

где: F - фактор разбавления пробы,

1,04 – концентрация лимонной кислоты в калибраторе, ммоль/л.

Количество цитратов в суточной моче: C (ммоль/л)×суточный объем мочи.

Полученные результаты биохимического исследования используются для подсчета общего количества цитратов, выделяемых с мочой за сутки, а также в пересчете на ммоль креатинина (цитрат/креатининовый индекс ммоль цитрата/ммоль креатинина).

Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.

Клинические примеры.

Клинический пример 1.

Мальчик А., 16 лет, наблюдается в отделении нефрологии НИКИ педиатрии им. Академика Ю.Е. Вельтищева с диагнозом Аутосомно-доминантная поликистозная болезнь (кисты почек, печени). ХБП II ст.

Из анамнеза известно: наследственность отягощена по поликистозу по отцовской линии (поликистоз почек у брата и двух сестер отца), отец не обследован. Мальчик от первой беременности, срочных родов массой 3190, ростом 52 см. Развитие по возрасту. При обследовании у хирурга по поводу лимфостаз органов мошонки и левой нижней конечности при УЗИ выявлен поликистоз почек. Наблюдается в отделении нефрологии с 2014 года. Постоянно принимает Энап по 7,5 мг в сутки. При осмотре состояние при поступлении средней тяжести. Самочувствие хорошее. Кожа чистая. Зев неяркий. Дыхание везикулярное. Тоны сердца ритмичные, отчетливые. АД 125/65 мм рт.ст. Живот мягкий, безболезненный. Мочеотделение свободное. Вес 55 кг, рост 166 см. При обследовании клинический анализ крови и мочи без особенностей (PH мочи 5,0-6,0). Основные показатели биохимического анализа крови в пределах референтных значений, электролиты в норме, креатинин 101 мкмоль/л, расчетная скорость клубочковой фильтрации (рСКФ) 91 мл в мин на 1,73 поверхности тела. В биохимическом анализе мочи экскреция оксалатов, уратов, кальция и фосфора в пределах нормы, в том числе и пересчете на креатинин мочи. ЭКГ - Синусовый ритм с тенденцией к тахикардии, ЧСС 84-107 уд. в мин. Вертикальное положение ЭОС. Нарушение внутрижелудочковой проводимости.

При УЗИ почек и внутренних органов поликистозная болезнь (множественные кисты печени, почек). В паренхиме обеих почек - множественные: 1) кисты, простые и многокамерные, максимальными размерами: справа - 1,4×1,8 см, слева - 2,6×3,1 см, в крупных кистах - мелкодисперсная взвесь, в паренхиме и единичных кистах - кальцинаты до 0,5 см; 2) парные линейные сигналы повышенной эхогенности (стенки мелких кист). Диффузные изменения паренхимы почек. Увеличение левой почки.

При исследовании цитратов мочи получен результат 0,34 ммоль/л при норме (0,6-1,67), креатинин мочи 8,1 ммоль/л, цитрат-креатининовый индекс 0,04.

Таким образом, у ребенка с аутосомно-доминантной поликистозной болезнью почек имели место множественные кальцинаты в кистах почек и изолированное снижение уровня цитрата мочи, при этом цитрат-креатининовый индекс был 0,04, что является высоким риском по образованию и прогрессированию развития кальцинатов в кистах почек и может приводить к увеличению кальцинатов в кистах почек и обуславливает раннее включение в терапию заболевания цитратсодержащих препаратов.

Клинический пример 2.

Мальчик Д., 2 года. Ребенок наблюдается в отделении нефрологии с аутосомно-доминантной поликистозной болезнью почек (АДПБП). Ребенок из семьи с отягощенным семейным анамнезом по АДПБП - у матери (впервые выявлена при УЗИ почек в возрасте 11 лет), у дедушки по л/матери. От 1 беременности, протекавшей с гестозом в 1/3, от 1 физиологических родов на 38 неделе. Кисты в почках выявлены при УЗИ в период антенатального развития. В возрасте 2 лет в анализах мочи выявлена микропротеинурия до 0,2 г/л непостоянного характера. Поступил для первичного нефрологического обследования и уточнения дальнейшей тактики ведения. При поступлении: рост - 92 см (75 перцентили), вес - 13 кг (50 перцентиль) - развитие гармоничное. Самочувствие удовлетворительное. Кожа и видимые слизистые чистые, выраженная венозная сеть в области переносицы. Дыхание через нос свободное. Зев - не гиперемирован, гипертрофия миндалин. Аускультативно - в легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны сердца звучные, ритмичные. АД 90/60 мм рт.ст. ЧСС 82 уд. в мин. Живот мягкий, безболезненный. Печень пальпируется у края реберной дуги. Отеков нет. Диурез достаточный. Симптом Пастернацкого отрицательный. Мочеиспускание не нарушено. Дизурических явлений нет.

При обследовании клинический анализ крови и мочи без особенностей (PH мочи 5,5-6,5). Основные показатели биохимического анализа крови в пределах референтных значений, электролиты в норме, креатинин 45 мкмоль/л. В биохимическом анализе мочи экскреция оксалатов, уратов, кальция и фосфора в пределах нормы, в том числе и пересчете на креатинин мочи. ЭКГ - небольшая дельта волна во II III avF отв. Заключение: умеренная синусовая аритмия, ЧСС=111-92 уд. в 1 мин. Нормальное положение ЭОС. Стоя - без существенной динамики.

При УЗИ почек: почки расположены в типичном месте. Подвижность почек в пределах нормы. Контур неровный. Размеры правая 6,6×4,1×2,9 см; объем 41,9 см ³; левая 7,0×4,4×3,0 см; объем 48,0 см ³. Соотношение объема почек и массы тела 0,69% норма (0,4-0,6)% (соотношение недостоверно из-за дефицита массы тела). Паренхима недостаточно четко дифференцирована, утолщена, эхогенность повышена (выше эхогенности печени); при ЦДК - кровоток до капсулы почек, справа - аберрантная артерия к верхнему полюсу почки, слева - аберрантная артерия к верхнему полюсу почки. В паренхиме почек: множественные кисты, максимальными размерами: справа - 1,0×1,1 см, слева - 0,6×0,8 см; парные линейные сигналы повышенной эхогенности (стенки мелких кист). Центральный эхокомплекс недостаточно четко структурирован. Лоханки не расширены, слева верхняя группа чашечек - 0,3 см.

При исследовании цитратов мочи получен результат 0,68 ммоль/л (0,6-1,67), креатинин мочи 3,2 ммоль/л, цитрат-креатининовый индекс 0,21. Снижение уровня цитрат-креатининового индекса менее 0,3 позволило отнести ребенка к высокой группе риска по развитию нефрокальциноза, что было подтверждено при динамическом наблюдении.

При наблюдении в катамнезе через 1 год при контрольном обследовании УЗИ почек у ребенка отмечались пристеночные кальцинаты (до 0,2 см) и единичные мелкие парные линейные эхосигналы повышенной эхогенности. Пирамидки повышенной эхогенности, неоднородны за счет множественных точечных гиперэхогенных включений до 0,3 см. Таким образом, у ребенка с поликистозной болезнью почек с нормальным уровнем цитратов мочи, но цитрат-креатининовым индексом менее N<0.3 отмечается появление единичных кальцитов в кистах, что определяет высокий риск развития нефрокальциноза и раннее включение в терапию заболевания цитратсодержащих препаратов.

Клинический пример 3.

Мальчик М., 4 года, наблюдается в отделении нефрологии НИКИ педиатрии им. Академика Ю.Е. Вельтищева с диагнозом АДПБП, ХБП 1 ст.

Из анамнеза известно: ребенок из семьи с отягощенным семейным анамнезом по АДПБП. Ребенок от 2 беременности, протекавшей с угрозой прерывания беременности, от 1 физиологических родов на 37 неделе. Кисты в почках выявлены на первом скрининге в возрасте 1-го года. Кожа и видимые слизистые чистые, выраженная венозная сеть в области переносицы. Дыхание через нос свободное. Зев - не гиперемирован, гипертрофия миндалин. Аускультативно - в легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны сердца звучные, ритмичные. ЧСС 90 уд. в мин. Живот мягкий, безболезненный. Печень пальпируется у края реберной дуги. Отеков нет. Диурез достаточный. Симптом Пастернацкого отрицательный. Мочеиспускание не нарушено. Дизурических явлений нет.

При обследовании клинический анализ крови и мочи без особенностей (PH мочи 6,0-6,5). Основные показатели биохимического анализа крови в пределах референтных значений, электролиты в норме, креатинин 44 мкмоль/л. В биохимическом анализе мочи экскреция оксалатов, уратов, кальция и фосфора в пределах нормы, в том числе и пересчете на креатинин мочи.

При УЗИ почек УЗ-картина поликистоза почек по аутосомно-доминантному типу. Диффузные изменения паренхимы почек. Паренхима недостаточно четко дифференцирована, утолщена, эхогенность повышена (выше эхогенности печени); при ЦДК - кровоток до капсулы почек, справа - аберрантная артерия к верхнему полюсу почки, слева - аберрантная артерия к верхнему полюсу почки. В паренхиме почек: множественные кисты, максимальными размерами: справа - 1,0×1,1 см, слева - 0,6×0,8 см; парные линейные сигналы повышенной эхогенности (стенки мелких кист).

При исследовании цитратов мочи получен результат 1,3 ммоль/л (0,6-1,67), креатинин мочи 1,5 ммоль/л, цитрат-креатининовый индекс 0,8. У ребенка с нормальным уровнем цитратов мочи и цитрат-креатининовым индексом 0,8 отмечается отсутствие кальцинатов в кистах почек. Нормальное значение цитрат-креатининового индекса определяет низкий риск развития кальцинатов, что отмечается при дальнейшем динамическом наблюдении. При катамнезе через год состояние без отрицательной динамики.

Предлагаемый способ был использован у 20 детей с поликистозной болезнью почек в возрасте от 3 до 17 лет (9,31±4,46 лет), в том числе 7 девочек (35%) и 13 мальчиков (65%). При УЗИ почек у них отсутствовали данные о наличии кальцитов, обострения инфекций мочевой системы в течение 3-х последних месяцев, отсутствовали признаки декомпенсированной эндокринной, метаболической печеночной, сердечно-сосудистой, гематологической, почечной патологии.

В результате исследования, проведенного в соответствии с предлагаемым способом, у 85% детей был определен высокий риск развития кальцинатов в кистах почек, что было затем подтверждено по данным УЗИ.

Специфичность метода составляет 85%, а чувствительность - 84%.