Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Область применения: патологическая анатомия, эндокринология, хирургия, изобретение может использоваться для дифференциальная диагностика заболеваний щитовидной железы (ЩЖ).

Пероксидаза ЩЖ-тиреопероксидаза (ТПО) является ключевым ферментом в синтезе тиреоидных гормонов. Она синтезируется в гранулярной эндоплазматической сети и затем упакованном в экзоцитозные пузырьки виде накапливается в апикальной части тироцитов.

Считают, что ТПО встроена в апикальную мембрану фолликулярных тироцитов ЩЖ и катализирует перекисное окисление йода с последующим йодированием тирозина в составе тиреоглобулина. Таким образом, ТПО катализирует как минимум две реакции в процессе синтеза гормонов ШЖ: йодирование тирозиновых остатков тиреоглобулина и слияние йодотирозинов в процессе синтеза тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3). Надо считать уникальным то, что готовые гормоны в составе тиреоглобулина накапливаются во внеклеточной среде, а далее, по мере необходимости, поступают в циркуляцию путем эндоцитоза.

Из приведенных данных следует, что интенсивность синтеза тиреоидных гормонов в фолликулярных тироцитах находится в прямой зависимости от активности ТПО. Из этого положения напрашивается вывод, что по уровню активности ТПО можно судить о функциональном состоянии ЩЖ.

Он важен, прежде всего, по той причине, что патоморфологическое заключение при исследовании послеоперационного материала не предполагает установление функционального состояния органа.

В настоящее время для определения функционального состояния ЩЖ используются следующие методы, которые описаны в Инструкциях по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения. «Утверждена» Приказом Росздравнадзора от «18» ноября 2011 г. №7492 - Пр/11.

- Инструкция по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения свободного тироксина в сыворотке крови человека. («ТироидИФА-свободный Т4»).

- Инструкция по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения свободного трийодтиронина в сыворотке крови человека («ТироидИФА-свободный Т3»).

- Инструкция по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения тиреотропного гормона в сыворотке крови человека («ТироидИФА-ТТГ»).

- Инструкция по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения аутоантител к тиреоидной пероксидазе в сыворотке крови человека («ТироидИФА-атТПО»).

Используемые на практике методы определения содержания тиреоидных гормонов и аутоантител к аутоантигенам в крови имеют следующие недостатки.

1. Необходимость использования дорогостоящих реактивов.

2. Длительность времени при получении ответа. Оно связано с тем, что гормоны определяют не у каждого пациента в отдельности, а группу больных, накапливая их до определенного количества, понятно с потерей времени.

3. Только при первичном обращении больных результаты могут быть достоверными. В преобладающем большинстве случаев обращаются больные, находящиеся на учете и нуждающиеся в повторном обследовании. При исследовании гормонов у этой группы больных, которые чаще всего принимают соответствующие препараты, достоверность результатов анализа сомнительна в том плане, что способность тиреоцитов к повышенной продукции гормонов сохраняется. В частности, больные с диффузным токсическим зобом (ДТЗ), принимающие тиреостатические препараты, в большинстве своем находятся в состоянии медикаментозного эутиреоза и соответственно содержание гормонов в пределах нормы, а клинические признаки в какой-то мере сохраняются.

В качестве прототипа нами взят способ, описанный в Инструкция по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения свободного тироксина в сыворотке крови человека («ТироидИФА-свободный Т4»).

К недостаткам прототипа можно отнести следующее:

- необходимость использования дорогостоящих реактивов;

- длительность времени выполнения анализа.

Целью изобретения является обеспечение достоверности полученных результатов при проведении дифференциальной диагностики заболеваний ЩЖ путем гистохимического исследования активности ключевого фермента при синтезе тиреоидных гормонов - ТПО.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем.

1. Сущность проведения дифференциальной диагностики диффузного токсического зоба заключается в следующем.

При постановке реакции на ТПО реакция проводится следующим образом: из взятого свежего (послеоперационный) материал готовят срезы, полученные срезы толщиной 15-20 мк переносятся на предметные стекла и хранятся 2 часа с целью высушивания. Предметные стекла со срезами покрывают 0.3% раствором молибдата аммония на 5 минут. После слива предыдущего раствора на стекла покрывают инкубационной средой на 15 минут. Инкубационная среда готовится следующим образом: в бюксик наносится 1 мл насыщенного раствора бензидина и добавляют 1 каплю 0.3% раствора перекиси водорода (раствор рассчитан на 3-4 стекла). По истечении времени инкубации стекла с инкубационной средой переносят на столик микроскопа с фотоприставкой и сразу же делают съемки. Оптимальное увеличение, при котором удается четко видеть окрашенные структуры - 400. При использовании предлагаемого способа в местах локализации фермента на голубоватом фоне цитоплазмы фолликулярных тироцитов образуются темно-синие гранулы. В обзорных микропрепаратах (фиг. 1, а) имеются признаки макро- и микрофолликулярного зоба, который сочетается с наличием аденоматозных зон (фиг. 1, а). Это позволяет ставить диагноз - диффузный токсический зоб.

2. Сущность проведения дифференциальной диагностики многоузлового токсического зоба заключается в следующем.

Характерно обилие аденоматозных очагов, т.е. формирующихся новых фолликулов, большинство которых без видимого просвета. Активность фермента в тиреоцитах умеренная и высокая. Просматриваются лишь единичные, полностью сформированные фолликулы; содержание окрашенных продуктов реакции в стенке также высокое (фиг. 1, б). Можно ставить диагноз многоузлового токсического зоба.

3. При фолликулярной аденоме, состояние эутиреоза характерно наличие многочисленных аденоматозных очагов. Однако, в отличии от предыдущего случая, количество сформированных фолликулов больше. В стенке фолликулов активность фермента умеренная или высокая. Четко очерчены межфолликулярные соединительнотканные прослойки; в их структурах отсутствуют окрашенные продукты гистохимической реакции (фиг. 2, а).

4. Аденокарцинома.

В гистохимических препаратах сплошь аденоматозные и паренхиматозные очаги, в основном без просвета. Активность фермента в них очень высокая. Лишь единичные фолликулы имеют просвет. Эпителий в их стенке неравномерно многослойный с умеренной и высокой активностью ТПО. Нередко аденоматозные и паренхиматозные очаги сливаются, образуя сплошные окрашенные участки.

В межфолликулярных соединительнотканных прослойках продукты гистохимической реакции отсутствуют (фиг. 2, б).

Примеры конкретного выполнения способа.

1. Больной Р. Поступил в отделение эндокринной хирургии РКБ 25.10.15 г. с диагнозом «Диффузный токсический зоб IV ст.» Жалобы на опухолевидное образование на передней поверхности шеи, затрудненное дыхание при физической нагрузке, тахикардию, раздражительность, плаксивость, головную боль, слабость, потливость.

Содержание тиреоидных гормонов в крови: Т4 св. - <5,15 пмоль/л,

ТТГ - 0,039 мЕД/л.

Клинический диагноз: Диффузный токсический зоб IV ст. Проведена операция – субфасциальная тиреоидэктомия.

Гистозаключение: Базедофицированный микро-макрофолликулярный диффузный токсический зоб.

Реакция на ТПО. В цитоплазме фолликулярных тироцитов активность фермента высокая. В полость фолликулов вдаются эпителиальные выпячивания в виде сосочков с просветленной средней частью. В межфолликулярных пространствах аденоматозные очаги с высокой активностью фермента.

Гистохимическое заключение: Диффузный токсический зоб тяжелой степени. Состояние тиреотоксикоза.

2. Больной С. поступил в отделение эндокринной хирургии РКБ 16.11.15 г. с диагнозом «Многоузловой токсический зоб III ст. Медикаментозный эутиреоз.» Жалобы на опухолевидное образование на передней поверхности шеи, затрудненное дыхание при физической нагрузке, быстрой ходьбе, тахикардию, раздражительность, плаксивость, головную боль, слабость.

Содержание тиреоидных гормонов в крови: Т3 св. - 3,7 пмоль/л, Т4 св. - 10,0 пмоль/л, ТТГ - 11,3 мМЕ/л, AT к ТПО - 625 МЕ/мл.

Клинический диагноз: Многоузловой токсический зоб III ст. тяжести. Медикаментозный эутиреоз. Проведена операция – субфасциальная тиреоидэктомия.

Гистозаключение: На фоне коллоидного зоба узлы фолликулярной аденомы с очаговой лимфоцитарной инфильтрацией.

Реакция на ТПО: В поле зрения многочисленные аденоматозные очаги (пролиферирующиеся тироциты) с высокой активностью фермента; просматриваются лишь единичные сформированные фолликулы с просветом.

Гистохимическое заключение: Узловой токсический зоб тяжелой степени. Состояние тиреотоксикоза.

3. Больная Ш. поступила в отделение эндокринной хирургии РКБ 10.9.15 г. с диагнозом «Диффузно-узловой эутиреоидный зоб III ст.» Жалобы на опухолевидное образование на передней поверхности шеи, головные боли, дискомфорт в шее.

Содержание тиреоидных гормонов в крови: Т4 об. - 21,8 нмоль/л, Т3 об. - 13,7 нг/мл, ТТГ - 0,1 мкМЕ/мл.

Клинический диагноз: Многоузловой эутиреоидный зоб III ст.

Гистозаключение: Макро-микрофолликулярный коллоидный зоб с полями фибротизации и формированием узловатых комплексов.

Реакция на ТПО: Многочисленные аденоматозные очаги с умеренной и высокой активность фермента. Часть очагов содержат сформированные мелкие фолликулы. В их стенке активность ТПО также умеренная или высокая. Четко очерчены межфолликулярные соединительнотканные прослойки без окрашенных продуктов реакции.

Гистохимическое заключение: Фолликулярная аденома. Состояние эутиреоза.

4. Больной И. поступил в лабораторно-диагностический центр «Астрамед» 22.12.15 г. с диагнозом «Многоузловой токсический зоб II ст. Медикаментозный эутиреоз.» Жалобы на опухолевидное образование на передней поверхности шеи, головные боли, тахикардию, слабость, потливость.

Содержание тиреоидных гормонов в крови: Т4 св. - 42,3 пмоль/л, ТТГ - <0,004 нМЕ/л.

Клинический диагноз: Многоузловой токсический зоб II ст.

Гистозаключение: Полиморфная аденома щитовидной железы с участками папиллярного и фолликулярного строения и признаками малигнизации и гиперфункции эпителия.

Реакция на ТПО: Аденоматозные и паренхиматозные очаги с очень высокой активностью. В стенке сформированных аденоматозных фолликулов неравномерный многослойный эпителий умеренной, местами высокой активностью фермента. Многие аденоматозные и паренхиматозные очаги слиты между собой.

Гистохимическое заключение: Аденокарцинома. Состояние тиреотоксикоза.

Признаки изобретения, отличительные от прототипа.

По предлагаемому способу проводят гистохимическое исследование послеоперационного материала ЩЖ путем определения активности ТПО, что позволяет дополнить гистологическое заключение патоморфологов функциональным.

Положительный эффект от использования изобретения.

1. Используются недорогие отечественные реактивы.

2. С момента получения послеоперационного материала до постановки гистохимической реакции и получения ответа проходит 2-3 часа (в прототипе от нескольких дней до нескольких недель).

3. Гистохимическая картина ЩЖ, выявляемая путем определения активности основного фермента синтеза тиреоидных гормонов - ТПО, не подвержена влиянию лечебных тиреостатических препаратов и отражает истинное состояние функциональной активности фолликулярных тиреоцитов и их потенциальные возможности (в прототипе, в случаях повышенной функциональной активности ЩЖ, тиреостатические препараты тормозят выход гормонов в циркуляцию и создают картину искусственного медикаментозного эутиреоза.

4. Способ позволит врачам проводить дифференциальную диагностику заболеваний щитовидной железы, позволит поставить окончательный клинический диагноз и проводить дальнейшие послеоперационные лечебные мероприятия.

Технический результат.

Предлагаемый способ гистоэнзиматической дифференциальной диагностики заболеваний ЩЖ путем определения активности ТПО позволит патологоанатомам дополнить морфологическое заключение функциональным. Это поможет хирургам и терапевтам при постановке окончательного клинического диагноза и проведении адекватного послеоперационного лечения.

Информация, принятая во внимание

- Инструкция по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения свободного тироксина в сыворотке крови человека («ТироидИФА-свободный Т4»).

«Утверждена» Приказом Росздравнадзора от «18» ноября 2011 г. №7492 - Пр/11 – прототип.

- Инструкция по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения свободного трийодтиронина в сыворотке крови человека («ТироидИФА-свободный Т3»).

- Инструкция по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения тиреотропного гормона в сыворотке крови человека («ТироидИФА-ТТГ»).

- Инструкция по применению набора реагентов для количественного иммуноферментного определения аутоантител к тиреоиднойпероксидазе в сыворотке крови человека («ТироидИФА-атТПО»).