Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава жидкой биологической среды и материал, полученный этим способом

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способу получения биологического мультиэлементного референтного материала для производства стандартных образцов (CO) состава крови или мочи, содержащих, по меньшей мере, два токсичных металла, выбранных из ряда ртуть, кадмий, свинец, а также к материалу, полученному предлагаемым способом, и может быть использована в токсикологии, медицине, ветеринарии при определении содержания указанных токсичных металлов в крови или в моче.

В изобретении используется следующая терминология.

Биоматериал - часть органов, тканей, клеточных или субклеточных структур организма.

Референтный материал - «в качестве материала (вещества) стандартного образца может быть использован референтный материал, т.е. материал (вещество), достаточно однородный и стабильный по отношению к одному или нескольким определенным свойствам, применяемый в соответствии с назначением в измерительном процессе». [P.50.2.056-2007.ГСИ. Образцы материалов и веществ стандартные. Термины и определения; ISO VIM: 1993].

Стандартный образец (состава) - (термин указан с учетом его определений, приведенных в ГОСТ 8.315-97, а также в международных нормативных документах) образец вещества или материала, химический состав или физические свойства которых:

- типичны для конкретной группы веществ или материалов;

- определены с необходимой точностью;

- отличаются высоким постоянством;

- удостоверены сертификатом.

Токсичный - ядовитый, вызывающий негативные изменения в структурах и/или функциях молекулярных, надмолекулярных, клеточных образований, тканях, органах и организме в целом.

Токсичные металлы (далее - ТМ) - условная группа металлов, не несущих биологической функции в организме, но склонных к бионакоплению, токсичные даже в небольших количествах [Загрязнение Арктики 2002. Программа по мониторингу и оценке окружающей среды Арктики. АМАП. Осло. - 2002-110 c.], к которым относят свинец, ртуть, кадмий, мышьяк, таллий, ванадий, никель, хром, уран и иногда другие металлы.

Затравка - введение токсичного металла тем или иным способом в организм животного.

Мультиэлементный референтный материал - референтный материал, содержащий несколько ТМ.

Матрица химического состава вещества [материала] (объекта аналитического контроля): Компонент или совокупность компонентов, образующих данное вещество или материал объекта аналитического контроля и являющихся его основой [ГОСТ P 52361-2005].

Для определения содержания ТМ в различного вида материалах используются методы анализа, в частности, такие как нейтронно-активационный, атомно-эмиссионный с дугой постоянного тока, атомно-эмиссионный с индуктивно-связанной плазмой, масс-спектрометрический с индуктивно-связанной плазмой, атомно-абсорбционный с электротермической атомизацией, атомно-абсорбционный с атомизацией в пламени, инверсионный вольтамперометрический, которые требуют применения соответствующих материалов сравнения - стандартных образцов, содержащих анализируемый ТМ в определенных количествах.

Известны стандартные образцы, изготовленные на основе водных растворов солей ТМ [см., например, Государственный Стандартный Образец (далее ГСО) Ртуть 7879-2001, ГСО Кадмий 7874-2000; ГСО Свинец 7877-2000].

Данные стандартные образцы рассчитаны на проверку работоспособности аналитического оборудования, его калибровку и могут обеспечить надежность результатов анализа в тех случаях, когда исследуемый материал также представляет собой водный раствор ТМ или близок к таковому по своим свойствам.

Однако указанные стандартные образцы малопригодны для анализа биоматериалов, которые далеки по свойствам от водных растворов и имеют сложную матричную структуру. Крайне важным для получения точных результатов анализа является обеспечение максимально возможного подобия матрицы стандартного образца и исследуемого материала, за счет чего достигается сходство условий (химические связи, валентности, молекулярные структуры и пр.), в которых находится ТМ в стандартном образце и в исследуемом материале.

Так, известны биологические референтные материалы (CO состава крови, содержащей свинец, номер в госреестре ГСО 9104-2008, номер свидетельства 3677; CO состава крови, содержащей ртуть, номер в госреестре ГСО 9653-2010, номер свидетельства 1579), получаемые из крови животного или человека, в которую после отбора добавляют водорастворимые соли ТМ.

Однако введенный в рассматриваемый референтный материал ТМ не проходит естественную ассимиляцию живым организмом, в связи с чем не достигается полнота форм ТМ, а также адекватность матрицы стандартных и исследуемых образцов.

В качестве ближайших аналогов заявляемых способа и материала выбраны способ получения биологического референтного материала и референтный материал, описанные в RU 2567046.

Рассматриваемый способ включает дозированное парентеральное введение в организм животного трех ТМ - кадмия, ртути и свинца путем инъекций раствора, содержащего водорастворимые соли указанных ТМ, отбор жидкой биологической среды, в частности крови животного после анализа на содержание в ней каждого из указанных ТМ, а также замораживание отобранной крови и ее лиофилизацию. Рассматриваемый референтный материал представляет собой бурый кристаллический порошок органо-минеральной матрицы (лиофилизат крови) с внедренным в указанную матрицу ртутью, кадмием и свинцом.

Получаемые референтные материалы состава крови имеют матрицу, близкую к матрице исследуемых образцов крови, поскольку ТМ внедрены в референтный материал в результате естественной ассимиляции организмом животного. При этом достигается естественное многообразие форм внедренных в матрицу референтного материала ТМ, в частности ртути, в которых ТМ может находиться в живом организме.

Достоинством данного способа является также возможность получения мультиэлементного референтного материала, содержащего три указанные ТМ, который пригоден для приготовления применяемых для приготовления применяемых при проведении наиболее востребованного в современной токсикологии анализа жидкой биологической среды стандартных образцов на содержание ртути, кадмия и свинца.

Однако согласно рассматриваемому способу на базе одной затравки может быть получен мультиэлементный референтный материал только одного состава, а для приготовления ряда мультиэлементных референтных материалов с разным содержанием ТМ нужно производить каждый раз новую затравку животных.

Это значительно увеличивает трудозатраты и длительность процесса получения мультиэлементных референтных материалов с разным содержанием ТМ.

Проблемой, решаемой при реализации заявляемых изобретений, является снижение трудозатрат и длительности процесса получения мультиэлементных референтных материалов с разным требуемым содержанием ТМ. а также получение мультиэлементного референтных материалов заявляемым способом.

Сущность изобретения в отношении заявляемого способа заключается в том, что способ получения биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава жидкой биологической среды включает введение в организм животного токсичного металла в виде его водорастворимой соли и отбор жидкой биологической среды животного после анализа на содержание в ней токсичного металла. При этом согласно изобретению в организм животного вводят токсичный металл, выбранный из ряда ртуть, кадмий, свинец, разные токсичные металлы вводят разным группам животных с количеством животных в группе одно или более, в качестве жидкой биологической среды отбирают кровь или мочу, при этом отбирают жидкую биологическую среду, по меньшей мере, от двух групп животных, смешивают отобранную жидкую биологическую среду с получением композитной жидкой биологической среды, содержащей, по меньшей мере, два токсичных металла, а затем осуществляют замораживание полученной композитной жидкой биологической среды, с последующей ее лиофилизацией.

Сущность изобретения в отношении биологического мультиэлементного референтного материала заключается в том, что он получен заявляемым способом.

В заявляемом способе ТМ, используемые для приготовления мультиэлементного референтного материала, оказываются внедренными в его матрицу в результате естественных метаболических процессов, происходящих в организме животных, что обеспечивает высокую степень адекватности матрицы референтного материала и исследуемых образцов крови или мочи. При этом достигается естественное многообразие форм ТМ, внедренных в матрицу референтного материала, в частности, ртути, которая может быть в виде органических и неорганических соединений, а также в металлической дисперсной форме.

Достоинством заявляемого способа является то, что он позволяет получить мультиэлементный референтный материал, содержащий, по меньшей мере, два ТМ из ряда ртуть, кадмии, свинец, в требуемых концентрациях, который пригоден для приготовления стандартных образцов, применяемых при проведении наиболее востребованного в современной токсикологии анализа жидкой биологической среды на содержание двух или трех указанных ТМ.

Принципиально важным в способе является то, что для получения мультиэлементного референтного материала используют композитную кровь или мочу, полученную смешением крови или мочи, отобранной от двух или трех групп животных, затравленных в каждой группе одним из ТМ, входящим в состав мультиэлементного референтного материала.

При этом согласно заявляемому способу смешением крови или мочи, отобранной от указанных двух или трех групп животных, получают референтный материал, содержащий, соответственно, два или три ТМ из указанного выше ряда ТМ.

Содержание конкретного ТМ в крови или моче животного зависит от дозы и длительности периода его затравки указанным ТМ, которую осуществляют путем парентерального или алиментарного введения в организм животного водорастворимой соли указанного ТМ, и определяется путем анализа отбираемой пробы крови или мочи.

При этом, смешивая кровь или мочу животных разных групп с конкретным содержанием в них одного из ТМ в разном объемном соотношении, можно получить ряд мультиэлементных референтных материалов с различным требуемым содержанием в них двух или трех ТМ на базе одной затравки животных каждой группы.

То есть получение мультиэлементных референтных материалов различного состава с использованием заявляемого способа достигается простым технологическим приемом и не требует применения нескольких циклов затравки. При этом обеспечивается высокая точность достижения требуемых концентраций ТМ в референтном материале.

Таким образом, техническим результатом изобретения в отношении способа является снижение трудозатрат и длительности процесса получения мультиэлементных референтных материалов с требуемым разным содержанием ТМ.

При этом заявляемый способ позволяет обеспечить требуемое содержание ТМ в референтном материале с высокой точностью.

Заявляемый биологический мультиэлементный референтный материал для приготовления стандартных образцов состава крови или мочи представляет собой в первом случае кристаллический порошок бурового цвета, а во втором случае - рыхлую серую массу, с внедренными в матрицу указанных материалов двумя или тремя ТМ и характеризуется тем, что он получен в соответствии с заявляемым способом.

Заявляемый референтный материал может иметь различное содержание ТМ, которое регулируется путем смешения крови или мочи животных разных групп с конкретным содержанием в них одного из ТМ в выбранном объемном соотношении. Тем самым оказывается возможным изготавливать на базе заявляемого референтного материала стандартные образцы состава крови или мочи с требуемыми концентрациями указанных трех ТМ.

Таким образом, техническим результатом, достигаемым при реализации заявляемого изобретения в отношении материала, является получение мультиэлементного референтного материала, содержащего, по меньшей мере, два ТМ из ряда ртуть, кадмий, свинец, предназначенного для приготовления стандартных образцов состава крови или мочи, содержащих указанные ТМ.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Формируют две или три группы животных по числу ТМ, которые входят в состав получаемого референтного материала. Количество животных в группе составляет одну особь или более. В качестве животных - доноров для получения референтного материала в соответствии с заявляемым способом могут быть использованы такие животные, как крысы, кролики, козы и др.

Проводят подготовку животных к процессу получения биологического референтного материала, выдерживая животных в карантине в течение времени, необходимого для его адаптации к условиям содержания.

Осуществляют дозированную затравку животных каждой группы одним из ТМ, выбранных из ряда ртуть, кадмий, свинец. Затравку осуществляют путем алиментарного или парентерального введения в организм животного водорастворимой соли одного из указанных ТМ.

В качестве водорастворимых солей ртути, кадмия, свинца могут быть использованы, в частности, ацетаты или нитраты указанных ТМ, характеризующиеся достаточно высокой стойкостью и растворимостью в воде.

Анализируют кровь или мочу животных в каждой группе на содержание в ней одного из ТМ.

Осуществляют отбор крови или мочи животных в каждой группе по достижении в крови или моче концентрации ТМ, превышающей концентрацию данного ТМ в референтном материале с учетом последующего уменьшения концентрации каждого из ТМ в суммарном объеме композитной крови или мочи.

Согласно осуществляемому способу можно также осуществлять отбор и крови, и мочи от животных в каждой группе.

Смешивают кровь или мочу, отобранную от каждой группы животных с известными концентрациями в них ТМ, выбирая объемное соотношение указанных порций, исходя из содержания каждого из ТМ в композитной крови или моче, соответствующего требуемому их содержанию в получаемом референтном материале.

Объемное соотношение порций крови или мочи можно, в частности, определить с использованием следующих соотношений, которые приводятся в расчете на три металла.

или

,

где V_i - объем композитной крови или мочи, содержащей три металла - «a», «b» и «d» в концентрациях a_i, b_i, d_i.

A, B, D - концентрации тех же элементов в исходной крови или моче,

V_a=V_i*a_i,/A - объем исходной крови или мочи с металлом «а»,

V_b=V_i*b_i/B - объем исходной крови или мочи с металлом «b».

V_d=V_i*d_i/D - объем исходной крови или мочи с металлом «d»,

при этом a≤A, b≤B, d≤D.

Полученную композитную кровь или мочу расфасовывают, замораживают и лиофилизуют.

В результате осуществления способа получают биологический референтный материал, представляющий собой лиофилизат композитной крови или мочи животных в виде сухого продукта с требуемым содержанием ТМ, выбранных из вышеуказанного ряда.

Материал хранят и транспортируют в укупоренной стеклянной таре при температуре +5±2°C.

Ниже приведены примеры осуществления изобретений.

Пример 1.

Получали биологический мультиэлементный референтный материала для приготовления стандартных образцов состава крови, содержащих ртуть, кадмий, свинец.

Были сформированы три группы крыс массой 180-210 г по 5 особей в каждой.

В каждой группе осуществляли энтеральную затравку крыс путем введения в организм животных ацетатной соли одного из ТМ в течение 30 суток с питьевой водой.

При этом животным первой группы вводили ацетат ртути в суточной дозе 0,5 мг/кг, животным второй группы вводили ацетат кадмия в суточной дозе 1,5 мг/кг, животным третьей группы вводили ацетат свинца в суточной дозе 15 мг/кг.

По окончании затравочного периода анализировали кровь животных каждой из трех групп с целью определения в ней содержания соответствующего ТМ и осуществляли отбор крови от указанных групп животных.

Содержание свинца и кадмия в крови определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии на спектрометре МГА-915, а также методом масс-спектрометрии индуктивно-связанной плазмы (ИСП-МС) на анализаторе ELEMENT-2, концентрацию ртути исследовали на анализаторах РА-915, «Юлия-2». Во всех случаях было произведено не менее четырех измерений определяемого показателя (n=4).

В результате было получено три вида крови, содержащей, соответственно, ртуть в концентрации 60,0±9,3 мкг/дм³ (далее кровь первого вида), кадмий в концентрации 16,3±2,1 мкг/дм³ (далее кровь второго вида), свинец в концентрации 456±18,8 мкг/дм³ (далее кровь третьего вида).

Для получения композитной крови смешивали кровь трех указанных видов во флаконе объемом 5 см³. При этом были получены два варианта (вариант 1 и вариант 2) композитной крови с разным содержанием в ней ТМ путем смешивания разных объемов указанных трех видов крови. Для расчетов использовали соотношения (1) и (2).

Вариант 1 композитной крови был получен путем смешивания 2,50 см³ крови первого вида, 1,25 см³ крови второго вида и 1,25 см³ крови третьего вида (соотношение объемов крови первого, второго и третьего вида в объемных долях составило соответственно 0,50:0,25:0.25).

Расчетная концентрация ртути, кадмия, свинца в композитной крови по варианту 1 составила соответственно 30 мкг/дм³, 4,1 мкг/дм³ и 114 мкг/дм³.

Полученная композитная кровь по варианту 1 была проанализирована на содержание ртути, кадмия и свинца. Концентрация указанных ТМ в указанной композитной крови составила соответственно 28,5±3,50 мкг/дм³, 3,9±0,48 мкг/дм³, 110±9,1 мкг/дм³.

Композитную кровь по варианту 1 расфасовывали по 5 см³, замораживали и подвергали лиофильной сушке.

Был получен вариант 1 референтного материала - кристаллический порошок бурого цвета.

Для контроля содержания ТМ в данном референтном материале полученный порошок был растворен в 5 см³ дистиллированной воды с получением восстановленной крови. Указанная восстановленная кровь была проанализирована на содержание в ней ртути, кадмия, свинца, которое составило соответственно 27,9±3,80 мкг/дм³, 4,1±0,44 мкг/дм³, 123±11,4 мкг/дм³.

Данные контроля показали близость концентраций ТМ в варианте 1 референтного материала к их расчетным значениям.

Вариант 2 композитной крови был получен путем смешивания 1,00 см³ крови первого вида, 1,5 см³ крови второго вида и 2,50 см³ крови третьего вида, (соотношение объемов крови первого, второго и третьего вида в объемных долях составило соответственно 0,2:0,30:0,5).

Расчетная концентрация ртути, кадмия, свинца в композитной крови по варианту 2 составила соответственно 12 мкг/дм³, 4,9 мкг/дм³ и 228 мкг/дм³.

Полученная композитная кровь по варианту 2 была проанализирована на содержание ртути, кадмия и свинца. Концентрация указанных ТМ в указанной композитной крови составила соответственно 13,4±1,90 мкг/дм³, 5,2±0,67 мкг/дм³, 239±20,0 мкг/дм³.

Композитную кровь по варианту 2 расфасовывали по 5 см³, замораживали и подвергали лиофильной сушке.

Был получен вариант 2 референтного материала - кристаллический порошок бурого цвета.

Для контроля содержания ТМ в данном референтном материале полученный порошок был растворен в 5 см³ дистиллированной воды с получением восстановленной крови. Указанная восстановленная кровь была проанализирована на содержание в ней ртути, кадмия, свинца, которое составило соответственно 13,0±0,5 мкг/дм³, 5,2±0,41 мкг/дм³, 232±21,0 мкг/дм³.

Данные контроля показали близость концентраций ТМ в варианте 2 референтного материала к их расчетным значениям.

Пример 2.

Получали биологический мультиэлементный референтный материала для приготовления стандартных образцов состава мочи, содержащих свинец, кадмий и ртуть.

Были сформированы три группы крыс массой 180-210 г по 5 особей в каждой.

В каждой группе осуществляли парентеральную (внутримышечно) затравку крыс путем введения в организм животных ацетатной соли одного из ТМ в течение первых трех суток десятидневного эксперимента.

При этом животным первой группы вводили ацетат ртути в суточной дозе 3,0 мг/кг, животным второй группы вводили ацетат кадмия в суточной дозе 0,5 мг/кг, животным третьей группы вводили ацетат свинца в суточной дозе 45 мг/кг.

По окончании затравочного периода на 10-й день анализировали мочу животных каждой из трех групп с целью определения в ней содержания соответствующего ТМ и осуществляли отбор мочи от указанных групп животных.

Содержание свинца в моче определяли методами инверсионной вольтамперометрии на анализаторах АВА-2 и АВА-3, содержание кадмия определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии на спектрометре МГА-915, а также методом ИСП-МС на анализаторе ELEMENT-2, концентрацию ртути исследовали на анализаторах РА-915, «Юлия-2». Во всех случаях было произведено не менее четырех измерений определяемого показателя (n=4).

В результате было получено три вида мочи, содержащей, соответственно, ртуть в концентрации 124,0±3,2 мкг/дм³ (далее моча первого вида), кадмий в концентрации 124,0±3,2 мкг/дм³ (далее моча второго вида), свинец в концентрации 319±3,8 мкг/дм³ (далее моча третьего вида).

Для получения композитной мочи смешивали мочу трех указанных видов во флаконе объемом 5 см³. При этом были получены два варианта (вариант 1 и вариант 2) композитной мочи с разным содержанием в ней ТМ путем смешивания разных объемов указанных трех видов мочи. Для расчетов использовали соотношения (1) и (2).

Вариант 1 композитной мочи был получен путем смешивания 1,25 см³ мочи первого вида, 2,50 см³ мочи второго вида и 1,25 см³ мочи третьего вида (соотношение объемов мочи первого, второго и третьего вида в объемных долях составило соответственно 0,25:0,50:0,25).

Расчетная концентрация ртути, кадмия, свинца в композитной моче по варианту 1 составила соответственно 31,0 мкг/дм³, 5,06 мкг/дм³ и 79,8 мкг/дм³.

Полученная композитная моча по варианту 1 была проанализирована на содержание ртути, кадмия и свинца. Концентрация указанных ТМ в указанной композитной моче составила соответственно 32,9±2,60 мкг/дм³, 5,46±0,44 мкг/дм³, 75,6±5,1 мкг/дм³.

Композитную мочу по варианту 1 расфасовывали по 5 см³, замораживали и подвергали лиофильной сушке.

Был получен вариант 1 референтного материала мочи, который представлял собой рыхлую сероватую массу.

Для контроля содержания ТМ в данном референтном материале полученный сухой продукт был растворен в 5 см³ дистиллированной воды с получением восстановленной мочи. Указанная восстановленная моча была проанализирована на содержание в ней ртути, кадмия, свинца, которое составило соответственно 31,2±2,50 мкг/дм³, 4,78±0,98 мкг/дм³, 76,8±1,3 мкг/дм³.

Данные контроля показали близость концентраций ТМ в варианте 1 референтного материала к их расчетным значениям.

Вариант 2 композитной мочи был получен путем смешивания 0,25 см³ мочи первого вида, 4,00 см³ мочи второго вида и 0,75 см³ мочи третьего вида (соотношение объемов мочи первого, второго и третьего вида в объемных долях составило соответственно 0,05:0,80:0,15).

Расчетная концентрация ртути, кадмия, свинца в композитной моче по варианту 2 составила соответственно 6,2 мкг/дм³, 8,1 мкг/дм³ и 47.9 мкг/дм³.

Полученная композитная моча по варианту 2 была проанализирована на содержание ртути, кадмия и свинца. Концентрация указанных ТМ в указанной композитной моче составила соответственно 5,9±0,47 мкг/дм³, 8,21±1,95 мкг/дм³, 47,86±5,4 мкг/дм³.

Композитную мочу по варианту 2 расфасовывали по 5 см³, замораживали и подвергали лиофильной сушке.

Был получен вариант 2 референтного материала мочи, который представлял собой рыхлую сероватую массу.

Для контроля содержания ТМ в данном референтном материале полученный сухой продукт был растворен в 5 см³ дистиллированной воды с получением восстановленной мочи. Указанная восстановленная моча была проанализирована на содержание в ней ртути, кадмия, свинца, которое составило соответственно 4,6±0,35 мкг/дм³, 7,86±2,04 мкг/дм³, 51,2±1,7 мкг/дм³.

Данные контроля показали близость концентраций ТМ в варианте 2 референтного материала к их расчетным значениям.

Примеры 1 и 2 показывают, что на базе единой затравки животных могут быть получены биологические мультиэлементные референтные материалы с разным содержанием в них ТМ.