Способ обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики африканской чумы свиней (АЧС) как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.

Африканская чума свиней (АЧС) является наиболее опасной болезнью для свиней, способной привести к катастрофическим последствиям для свиноводства любой страны. Клинические признаки и патологоанатомические изменения имеют значительное сходство с симптомами, которые наблюдают при классической чуме свиней, поэтому при лабораторных исследованиях эти болезни всегда необходимо дифференцировать.

Известно использование для диагностики африканской чумы свиней олигонуклеотидных праймеров с электрофоретическим учетом результатов амплификации. При таком методе постановки реакции отсутствует возможность количественного определения нуклеиновой кислоты инфекционных агентов в исследуемом материале. Также при наличии стадии электрофореза возрастает риск контаминации лаборатории продуктами ПЦР. При использовании ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов есть возможность количественного определения нуклеиновых кислот с регистрацией и интерпретацией полученных результатов в режиме реального времени, что позволяет увеличить достоверность диагностики (Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г., Рюмин Д.В. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) // Вестник последипломного медицинского образования. - 2001. - №3. - С. 7-10).

Известны научные публикации, в которых описано применение ПЦР для выявления и идентификации вируса африканской чумы свиней в биологических образцах (J of Virol. Meth. - 2003 - №107. - P. 53-61; J of Virol. Meth. - 2006 - №136. - P. 200-209; J of Virol. Meth. - 2011 - №178. - P. 161-170; J of Trans-boundary and Emerg. Des. - 2013 - №60. - P. 48-58), а также известен ряд патентов (RU №2125089 C1, RU №2360971 C1, US 20140004504 № A1, CN №101921878 A, CN №103320536 A, CN 103757134 В). В перечисленных публикациях и патентах описаны различные форматы ПЦР, которые применяются для диагностики АЧС, в том числе с детекцией в агарозном геле и с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.

Наиболее близким по технике выполнения и формату ПЦР является техническое решение (см. патент РФ №2595373, кл. C12Q 1/68, 2016), в котором обнаружение ДНК вируса осуществляют методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, путем выделения ДНК с использованием образцов: для контроля качества выделения вируса, контроля специфики реакции и набора синтетических праймеров и флуоресцирующего зонда для выявления ДНК вируса, взятых в равных соотношениях, проведение амплификации, включающей денатурацию при 95°С, циклирование: денатурация - отжиг - элонгация и оценка результата по кривым накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналов.

Недостаток известного способа заключается в том, что не может быть использован для выявления фрагмента гена vp72 вируса африканской чумы свиней из-за неспецифичности праймеров и зонда для африканской чумы, фрагмента гена vp72 вируса африканской чумы.

Техническим результатом является повышение точности обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней методом ПНР в реальном времени за счет конструирования набора, содержащего пару специфичных олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зонд, а также подбора условий для проведения ПЦР с ними, обеспечивающего минимальный риск контаминации в лаборатории при проведении анализа, а также исключающего субъективность при оценке результатов ПЦР.

Технический результат достигается тем, что в способе обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, содержащем выделение ДНК с использованием контрольных образцов: для контроля качества выделения вируса, контроля специфики реакции; амплификацию ДНК с использованием синтетических праймеров и флуоресцирующего зонда, включающую денатурацию при 95°С, циклирование: денатурация - отжиг - элонгация; и оценку результата по кривым накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных каналов, согласно изобретению используют рекомбинантную плазмиду с фрагментом гена vp72 вируса африканской чумы свиней в качестве контроля качества выделения вируса, рекомбинантную плазмиду с фрагментом гена здоровых тканей свиньи в качестве контроля специфики реакции, а синтетические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцирующий зонд взяты в соотношении 1:1:0,5, комплементарные консервативной области генома вируса африканской чумы свиней района гена vp72 и имеют следующий нуклеотидный состав:

SEQ NO 1 :5'-CTG-CTC-ATG-GTA-TCA-ATC-3' - прямой праймер,

SEQ NO 2 :5'-GAT-ACC-ACA-AGA-TCG-CCG-3' - обратный праймер,

SEQ NO 3 :5'-FAM-CCA-CGG-GAG-GAA-TAC-CAA-CCC-AGT-G-BHQ1-3' - флуоресцирующий зонд, где BHQ1 означает присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FAM - флуоресцентный краситель, присоединенный к нуклеотиду С, при этом амплификацию проводят при следующем режиме: денатурация при 95°С в течение 90 с, затем циклирование с детекцией, включающей денатурацию при 95°С в течение 15 с, отжиг - 60°С - 30 с и элонгацию - 72°С в течение 4 с, причем цикл: денатурация - отжиг - элонгация повторяется 40 раз, затем накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналам: FAM для специфического сигнала; HEX для сигнала внутреннего контроля; CY5 для сигнала экзогенного внутреннего контроля, при этом если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 36 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 36 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлены графики из отчета работы прибора Rotor-Gene 6000 при использовании Real-time PCR:

на фиг. 1 представлен график канала FAM - искомая ДНК АЧС для отрицательного образца;

на фиг. 2 представлен график канала Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК свиньи - отрицательный образец;

на фиг. 3 представлен график канала HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - отрицательный образец;

на фиг. 4 представлен график канала FAM - искомая ДНК АЧС для положительного образца;

на фиг. 5 представлен график канала Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК свиньи - положительный образец;

на фиг. 6 представлен график канала HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - положительный образец; на фиг. 7 представлен график канала FAM - искомая ДНК АЧС для сомнительного образца;

на фиг. 8 представлен график канала Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК свиньи - сомнительный образец;

на фиг. 9 представлен график канала HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - сомнительный образец.

Способ обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени осуществляется следующим образом.

Для контроля стадии выделения ДНК вируса африканской чумы свиней используют рекомбинантную плазмиду с фрагментом гена vp72 вируса африканской чумы свиней в качестве контроля качества выделения вируса, а рекомбинантную плазмиду с фрагментом гена здоровых тканей свиньи в качестве контроля специфики реакции. Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank, и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента. Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцирующий зонд, комплементарные консервативной области генома вируса африканской чумы свиней района гена vp72, взяты в соотношении 1:1:0,5 и имеют следующий нуклеотидный состав:

SEQ NO 1 :5'-CTG-CTC-ATG-GTA-TCA-ATC-3' (прямой праймер),

SEQ NO 2 :5'-GAT-ACC-ACA-AGA-TCG-CCG-3' (обратный праймер),

SEQ NO 3: 5'-FAM-CCA-CGG-GAG-GAA-TAC-CAA-CCC-AGT-G-BHQ1-3' (флуоресцирующий зонд), где BHQ1 означает присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FAM - флуоресцентный краситель, присоединенный к нуклеотиду С.

Постановка реакции отличается тем, что амплификационная смесь уже готова для использования в следующем режиме (для Rotor-Gene 6000):

1. Удержание температуры 95°С - 90 с

2. Циклирование с детекцией 95°С - 15 с

60°С - 30 с - Детекция (отжиг с считыванием)

72°С - 40 с - элонгация

Цикл повторяют 40 раз.

Для разработки способа диагностики генома вируса африканской чумы свиней осуществлялись в несколько этапов.

1. Анализ структуры генома вируса африканской чумы свиней.

2. Конструирование праймеров и зонда.

3. Подбор оптимальной пары праймеров и зонда.

4. Моделирование состава реакционной смеси способа диагностики с использованием разработанной пары праймеров и зонда.

5. Отработка условий способа диагностики АЧС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.

6. Определение чувствительности способа диагностики АЧС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.

7. Определение специфичности способа диагностики АЧС с использованием разработанной пары праймеров и зонда.

При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.

Разработанные олигонуклеотиды имеют оптимальные размер (24-25 пл.) и GC состав (45,8 и 48%), температуру отжига праймеров 55°С, температуру отжига зонда до 72°С.

Состав реакционной смеси подбирали таким образом, чтобы концентрация ионов MgCl₂ была в пределах 2,0-2,5 мМ, что обеспечивает оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы, концентрация дНТФ - не более 2,5 мМ, концентрация каждого праймера - 1,5 пмоль/мкл, зонда - 0,75 пмоль/мкл и объем пробы - 10 мкл.

Отработку условий ПЦР с использованием разработанных олигонуклеотидов осуществляли на амплификаторе Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty Ltd., Австралия).

Температурно-временной режим проведения ПЦР представлен в таблице.

Оценка результата по кривым накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналов проводилась по графикам из отчета работы прибора Rotor-Gene 6000 при использовании Real-time PCR.

Для отрицательного образца

Фиг. 1. Канал FAM - искомая ДНК АЧС (фиолетовый цвет). Из исследуемых образцов не вышел. Регистрируется только сигнал контрольного образца (красный цвет).

Фиг. 2. Канал Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК АЧС (фиолетовый цвет) - выходят позже графика положительного контрольного образца (красный цвет), что говорит о незначительном ингибировании реакции.

Фиг. 3. Канал HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС (фиолетовый цвет). График экзогенного внутреннего контроля выделения и графики исследуемых образцов совпадают, что говорит, что реакция прошла успешно.

Для положительного образца

Фиг. 4. Канал FAM - искомая ДНК АЧС (синий цвет) - флуоресцентно сигнал начал накапливаться до 36 цикла, его можно считать положительным, Отрицательный контрольный образец не вышел - контаминации контроля нет.

Фиг.5. Канал Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК АЧС (синий цвет) - накопление флуоресцентного сигнала достаточно, чтобы считать реакцию положительной. Черный график - отрицательный контрольный образец. Флуоресцирует благодаря наличию экзогенного контрольного образца, вносимого в пробирку на стадии выделения. Красный график - положительный контрольный образец.

Фиг. 6. Канал HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - накопление флуоресцентного сигнала достаточно, чтобы считать реакцию положительной. Черный график - отрицательный контрольный образец. Флуоресцирует благодаря наличию экзогенного контрольного образца, вносимого в пробирку на стадии выделения. Красный график – положительный.

Для сомнительного образца

Фиг. 7. Канал FAM - искомая ДНК АЧС (синий цвет) - по графику видно, что и отрицательный контрольный образец, и исследуемый образец вышли до 36 цикла, это говорит о возможной контаминации.

Фиг. 8. Канал Су5 - внутренний контрольный образец специфики - ДНК АЧС (синий цвет) - накопление флуоресцентного сигнала достаточно, чтобы считать реакцию положительной. Фиолетовый график - отрицательный контрольный образец. Флуоресцирует благодаря наличию экзогенного контрольного образца, вносимого в пробирку на стадии выделения. Красный график - положительный контрольный образец.

Фиг. 9. Канал HEX - внутренний контрольный образец выделения - синтетическая ДНК АЧС - накопление флуоресцентного сигнала достаточно, чтобы считать реакцию положительной. Фиолетовый график - отрицательный контрольный образец. Флуоресцирует благодаря наличию экзогенного контрольного образца, вносимого в пробирку на стадии выделения. Красный график - положительный контрольный образец.

При учете результата threshold (порог) устанавливали вручную на уровне 10% от максимального уровня флуоресценции в последнем цикле амплификации. Уровень threshold составил не более 0,02. Значения показателя «Ct» были на уровне 24-25. В положительных образцах кривая флуоресценции пересекает линию threshold и, в зависимости от интенсивности сигнала, возвышается над линией более или менее. В отрицательных образцах и отрицательном контроле флуоресценции не наблюдается, что отражается прямой детекции на уровне или ниже линии threshold.

Пример конкретного осуществления способа обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Пример 1. Для анализа методом ПЦР были взяты 2 пробы тканей селезенки от свиней, признанных больными африканской чумой свиней на основании ПЦР-исследований набором производства ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров. В процессе ПЦР в пробах были получены кривые флуоресценции, пересекающие линию threshold, при отсутствии таковой в отрицательном контроле. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов.

Пример 2. Применение реакции амплификации для выявления ДНК вируса африканской чумы свиней, с использованием разработанных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда.

Для анализа методом ПЦР были взяты 6 проб тканей селезенки свиней. В процессе ПЦР во всех пробах были получены кривые флуоресценции, пересекающие линию threshold, при отсутствии таковой в отрицательном контроле. Значения показателя «Ct» составило от 32 до 36. Это свидетельствует о воспроизводимости результатов проведенных опытов.

Предложенный способ диагностики позволяет количественно выявлять на ранних стадиях высококонсервативную область гена VP72 вируса африканской чумы свиней. Применение олигонуклеотидного зонда позволяет повысить чувствительность и специфичность способа, исключить субъективность при оценке результатов. Использование предлагаемой модификации ПЦР позволяет значительно снизить возможность контаминации образцов, помещения, оборудования и реактивов, а также сократить сроки проведения анализа, что важно как для владельцев животных, так и для ветеринарных специалистов.

Предложенный способ диагностики апробирован с положительными результатами и регулярной воспроизводимостью этих результатов в 2016 году на 8 пробах тканей селезенки свиней, признанных больными африканской чумой свиней на основании ПЦР-исследований набором производства ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров.

Работу проводили на базе ФГБОУ ВО «Краснодарский ГАУ».