Результат интеллектуальной деятельности: МОДУЛЯЦИЯ ИММУННОЙ ФУНКЦИИ ДИЕТИЧЕСКИМ ЛАКТОФЕРРИНОМ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Приоритет

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 61/709242, поданной 3 октября 2012, раскрытие которой в полном объеме включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Уровень техники

У младенцев, находящихся на искусственном вскармливании, имеется более высокая частота инфекционных заболеваний и других связанных с иммунитетом заболеваний, в том числе таких, как аллергия и аутоиммунные заболевания, чем у младенцев, находящихся на естественном вскармливании. На первом году жизни, после учета искажающих факторов, в течение не менее трех месяцев имело место 2033 дополнительных визитов в клинику, 212 дополнительных суток госпитализации и было выписано 609 дополнительных рецептов за счет заболеваний нижних дыхательных путей, отита среднего уха и желудочно-кишечных заболеваний на 1000 младенцев, никогда не находившихся на естественном вскармливании, по сравнению с 1000 младенцев, находившихся исключительно на естественном вскармливании. Эти дополнительные медицинские услуги обошлись страховой системе здравоохранения от $331 до $475 на одного младенца, никогда не находившегося на естественном вскармливании в течение первого года жизни. Таким образом, существует потребность в снижении уровня инфекционных заболеваний и усилении развития иммунитета у младенцев, находящихся на искусственном вскармливании.

Сущность изобретения

Один вариант осуществления изобретения относится к способу повышения функции иммунных клеток у новорожденного млекопитающего, которое не потребляло молозиво или грудное молоко. Способ включает введение новорожденному млекопитающему молочной смеси, содержащей примерно от 1,0 до примерно 10 г/л лактоферрина крупного рогатого скота. Молочная смесь может содержать примерно от 1,0 до примерно 3,6 г/л или примерно от 3,6 до примерно 5,0 г/л лактоферрина крупного рогатого скота. Новорожденное млекопитающее может иметь незрелую иммунную систему, может иметь постоянно ослабленный иммунитет, может иметь временно ослабленный иммунитет, может быть полностью доношенным или недоношенным. Новорожденное млекопитающее может являться рожденным только 1 час назад, может являться рожденным примерно 5 часов тому назад или может являться рожденным примерно 1 год тому назад. Новорожденное млекопитающее может иметь первичный или вторичный иммунодефицит, такой как дефицит В-клеток, дефицит Т-клеток, комбинированный дефицит B-клеток и Т-клеток, дефицит природных клеток-киллеров, дефицит фагоцитарных клеток, дефицит системы комплемента, недостаточность питания, новорожденное млекопитающее может находиться на иммуносупрессивных препаратах, страдать раком, хронической инфекцией, сахарным диабетом, печеночной недостаточностью, гепатитом, лимфангиэктазией, апластической анемией, синдромом «трансплантат против хозяина», серповидно-клеточной анемией, подвергаться лучевой терапии, спленэктомии, может быть заражено цитомегаловирусом, вирусом Эпштейна-Барра, вирусом кори, вирусом ветряной оспы, страдать нефротическим синдромом, почечной недостаточностью, уремией или СПИДом. Новорожденное млекопитающее может быть человеком, имеющим концентрацию IgG менее чем примерно 7 г/л. Мать новорожденного младенца может иметь плацентарные нарушения, гипергаммаглобулинемию, ВИЧ-инфекцию, плацентарную малярию, гуморальный иммунодефицит или другую инфекцию или заболевание, которые вызывают снижение переноса IgG через плаценту. Повышение функции иммунных клеток может выражаться в увеличении концентрации общего сывороточного иммуноглобулина или увеличении секреции цитокинов из иммунных клеток или их комбинации. Увеличение секреции цитокинов может представлять повышение уровня IL-6, IL-10, IFN-гамма, IL-4, TNF-альфа, IL12p40 или их комбинацию. Новорожденным млекопитающим может быть человек, свинья, собака, лошадь или кошка.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу повышения функции иммунных клеток у новорожденного млекопитающего, которое потребляло молозиво или грудное молоко в течение периода времени, не превышающего 1 неделю после рождения, включающему введение новорожденному млекопитающему молочной смеси, содержащей примерно от 1,0 до примерно 10 г/л лактоферрина крупного рогатого скота.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу повышения функции иммунных клеток у новорожденного млекопитающего, которое потребляло молозиво в общей сложности в количестве, не превышающем примерно 2 мл, или грудное молоко в общей сложности в количестве, не превышающем примерно 10 мл, или молозиво в общей сложности в количестве, не превышающем примерно 2 мл, и грудное молоко в общей сложности в количестве, не превышающем примерно 10 мл, включающему введение новорожденному млекопитающему молочной смеси, содержащей примерно от 1,0 до примерно 10 г/л лактоферрина крупного рогатого скота.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 показано влияние 1,0 г/л лактоферрина (LF1) или 3,6 г/л лактоферрина (LF3) на концентрации IgG в сыворотке крови.

На фигурах 2А-С показано влияние диетического лактоферрина на продукцию IL-6 стимулированными и нестимулированными клетками брыжеечных лимфатических узлов.

На фигурах 3А-В показано влияние диетического лактоферрина на продукцию IL-10 стимулированными и нестимулированными клетками брыжеечных лимфатических узлов.

На фигурах 4A-B показано влияние диетического лактоферрина на продукцию IFN-гамма стимулированными и нестимулированными клетками брыжеечных лимфатических узлов.

На фигуре 5 показано влияние диетического лактоферрина на продукцию IL-4 стимулированными и нестимулированными клетками брыжеечных лимфатических узлов.

На фигурах 6А-В показано влияние диетического лактоферрина на продукцию IL-10 стимулированными и нестимулированными клетками брыжеечных лимфатических узлов.

На фигурах 7А-В показано влияние диетического лактоферрина на продукцию IFN-гамма стимулированными и нестимулированными клетками селезенки.

На фигуре 8 показано влияние диетического лактоферрина на продукцию IL-4 стимулированными клетками селезенки.

На фигуре 9 показано влияние диетического лактоферрина на продукцию TNF-альфа стимулированными клетками селезенки.

На фигуре 10 показано влияние диетического лактоферрина на продукцию IL12p40 стимулированными и нестимулированными клетками селезенки.

Подробное описание изобретения

В настоящем описании грамматические формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное. Термин «примерно» при использовании по отношению к числовому значению означает, что числовое значение может отличаться плюс или минус 5% от числового значения.

Изобретение относится к способам повышения функции иммунных клеток у младенцев и, в частности, младенцев, которые по существу не получали молозиво или грудное молоко, недоношенных младенцев, имеющих ослабленный иммунитет, больных, имеющих незрелую иммунную систему, или их комбинации. Способ включает обеспечение диетического лактоферрина в молочной смеси для младенцев.

Младенцем может быть любое млекопитающее, включая, например, человека, свинью, собаку, лошадь или кошку. Младенцы могут быть рожденными только 1, 5, 10, 24, 36, 48, 60, 72 или более часов назад, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 или более недель назад, или 1 год назад (или любое значение возраста от только рожденного до примерно 1 года). Младенец может быть рожденным только примерно 1, 5, 10, 24, 36, 48, 60, 72 или более часов назад, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 или более недель назад, или 1 год назад (или любой диапазон возраста от только рожденного до примерно 1 года).

В одном варианте осуществления младенец все время не получает молозиво, или грудное молоко его матери, или из любого другого источника. Необязательно младенец не получал молозиво через 1, 2, 3, 4, 5, 10 или 12 часов после рождения. Необязательно младенец не получал грудное молоко через 1, 2, 3, 4, 5, 6 суток или 1, 2, 3 или 4 недели после рождения. В другом варианте осуществления младенец потреблял молозиво в общей сложности (за весь период жизни младенца) в количестве менее чем примерно 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30 или 50 мл, или грудное молоко в количестве менее чем примерно 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или 300 мл, или молозиво в количестве менее чем примерно 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30 или 50 мл и грудное молоко в количестве менее чем примерно 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или 300 мл. Необязательно младенец не получал грудное молоко в период времени, не превышающий примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6 суток или примерно 1, 2, 3 или 4 недель после рождения. В другом варианте осуществления младенец потреблял молозиво в общей сложности (за весь период жизни младенца) в количестве, не превышающем примерно 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30 или 50 мл, или грудное молоко в общей сложности в количестве, не превышающем примерно 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или 300 мл, или молозиво в общей сложности в количестве, не превышающем примерно 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30 или 50 мл, и грудное молоко в общей сложности в количестве, не превышающем примерно 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или 300 мл. Молозиво является формой молока, вырабатываемого молочными железами млекопитающих (включая человека) на поздних сроках беременности. Молозиво продуцируется у большинства млекопитающих непосредственно перед родами. Молозиво содержит антитела для защиты новорожденного от болезней, а также имеет более низкое содержание жира и более высокое содержание белка, чем обычное грудное молоко. Молозиво продуцируется у матери в течение примерно 24-72 часов после родов. Грудное молоко является формой молока, вырабатываемого грудными или молочными железами самки млекопитающего для кормления ее новорожденного потомства. Грудное молоко вырабатывается примерно через 24-72 часа после родов, то есть после окончания периода продукции молозива.

Молочная смесь представляет собой питательную композицию для младенцев млекопитающих и содержит достаточное количество калорий, белков, углеводов, жиров, витаминов и минералов, являясь единственным источником питания при обеспечении в достаточном для младенца количестве.

Молочная смесь может представлять собой смесь на основе коровьего молока, смесь на основе соевого белка, частично гидролизованную смесь, полностью гидролизованную смесь, гипоаллергенную молочную смесь, изготовленную из отдельных аминокислот, безлактозную молочную смесь, смесь против срыгивания (которая сгущается в желудке) или кисломолочную смесь на основе коровьего молока. Молочные смеси могут содержать белок, жир, линолевую кислоту, витамин А, витамин С, витамин D, витамин Е, витамин К, тиамин, рибофлавин, витамин В6, витамин В12, ниацин, фолиевую кислоту, пантотеновую кислоту, кальций, магний, железо, цинк, марганец, медь, фосфор, йод, хлорид натрия, хлорид калия, углеводы (например, лактозу, сахарозу, глюкозу, натуральные крахмалы, модифицированные крахмалы), нуклеотиды, стабилизаторы, эмульгаторы, биотин, холин, инозит, разбавитель (например, обезжиренное молоко или воду).

Молочные смеси могут быть получены в любой форме выпуска, подходящей для применения младенцам, в том числе, например, в форме восстанавливаемых порошков, готовых к употреблению жидкостей (жидких форм, подходящих для введения младенцу, в том числе восстановленных порошков, разведенных концентратов, и готовых жидкостей, и разведенных жидких концентратов). Формы выпуска молочной смеси хорошо известны в данной области техники.

Молочная смесь может быть в жидкой форме или в форме порошка, предназначенного для восстановления. Порошковые молочные смеси могут быть в сыпучей форме или в форме по существу сыпучей дисперсной композиции, которую можно легко зачерпнуть и отмерить ложкой или другим аналогичным устройством. Порошковые композиции могут легко восстанавливаться подходящей водной жидкостью, например, водой, с образованием жидкой питательной смеси для немедленного перорального или энтерального применения (например, которая используется сразу после приготовления в течение примерно 24 часов или в течение примерно 48 часов). Порошковые композиции включают высушенные распылением, агломерированные, смешанные в сухом виде, или другие известные, или иные эффективные дисперсные формы. Количество питательного порошка, необходимое для приготовления подходящего для одной порции объема, может быть различным.

Молочные смеси для использования в настоящем изобретении (порошковые и жидкие формы) можно упаковывать и запечатывать в одноразовые или многоразовые контейнеры и затем хранить в подходящих условиях в течение примерно 12, 24, 36 или более месяцев. Многоразовые контейнеры могут быть открыты и затем закрыты для многократного использования при условии, что закрытая упаковка хранится в подходящих условиях и содержимое используется в течение примерно 1, 2 или 3 суток (жидкие формы) или одного года (порошковые формы).

Младенцу можно скармливать смесь в количестве примерно 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500 мл/кг массы тела/сутки с добавлением или без добавления твердой пищи. Младенцу можно скармливать смесь примерно 1, 2, 3, 4, 5, 10 или более раз в сутки.

Лактоферрин связывается с рецепторами на поверхности клеток млекопитающих: клеток врожденной (NK-клеток, нейтрофилов, макрофагов, базофилов, нейтрофилов и тучных клеток) и адаптивной (лимфоцитов и антигенпредставляющих клеток) иммунной системы, а также эпителиальных и эндотелиальных клеток. За счет этого взаимодействия лактоферрин способен модулировать созревание и функции иммунных клеток и, таким образом, оказывать влияние и на адаптивный, и на врожденный иммунитет. Молочная смесь по изобретению может содержать примерно 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 2,0, 3,0, 3,5, 3,6, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15 или более г/л лактоферрина (или любой диапазон, или значение примерно от 0,25 до примерно 15 г/л). В одном варианте осуществления настоящего изобретения молочная смесь содержит примерно от 1,0 до примерно 10 г/л, примерно от 1,0 до примерно 3,6 г/л, примерно от 3,6 до примерно 5,0 г/л или примерно от 3,6 до примерно 10 г/л лактоферрина. Лактоферрином может быть лактоферрин крупного рогатого скота.

В одном варианте осуществления изобретения младенец имеет постоянно или временно ослабленный иммунитет (например, имеет ослабленный иммунитет в течение примерно 1 суток, 1, 2, 3 недель, 1, 2, 3, 4 или более месяцев) или имеет незрелую иммунную систему. Младенец может иметь ослабленный иммунитет за счет первичного иммунного дефицита (дефицит, отсутствие или неполноценность иммунной системы в результате генетического дефекта), например, дефицита В-клеток, дефицита Т-клеток, комбинированного дефицита B-клеток и Т-клеток, дефицита природных клеток-киллеров, дефицита фагоцитарных клеток, дефицита системы комплемента. Иммунодефицит может быть вторичным иммунодефицитом вследствие, например, недостаточности питания, использования иммуносупрессивных препаратов, рака (например, лейкоза, лимфомы, множественной миеломы), хронических инфекций, сахарного диабета, печеночной недостаточности, гепатита, лимфангиэктазии, апластической анемии, синдрома «трансплантат против хозяина», серповидно-клеточной анемии, лучевой терапии, спленэктомии, цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барра, вируса кори, вируса ветряной оспы, нефротического синдрома, почечной недостаточности, уремии или СПИДа.

В одном варианте осуществления младенец имеет физиологический иммунодефицит нормального, доношенного, здорового младенца или более выраженный физиологический иммунодефицит в результате преждевременных родов, ослабленного иммунитета, болезни или другой проблемы. Нормальный, доношенный, здоровый младенец рождается с физиологическим иммунодефицитом, поскольку его врожденные и адаптивные иммунологические ответы значительно подавлены. Физиологический иммунодефицит является более выраженным у недоношенных, имеющих ослабленный иммунитет, и больных младенцев. Физиологический иммунодефицит включает низкие концентрации IgG и IgM, незрелые Т-клетки (приводя, например, к более низким уровням продукции цитокинов), незрелую цитотоксическую активность, сниженную продукцию и функции нейтрофилов, сниженные уровни комплемента или их комбинации. Младенец с более выраженным физиологическим иммунодефицитом имеет на 10, 20, 30, 40, 50% или более низкие концентрации IgG, IgM и/или цитокинов, на 10, 20, 30, 40, 50% или более низкое количество незрелых Т-клеток, сниженную цитотоксическую активность, сниженную продукцию и функции нейтрофилов, сниженные уровни комплементов или их комбинации по сравнению с нормальным, доношенным, здоровым младенцем.

Материнский IgG обычно проникает в плод через плаценту во время третьего триместра беременности. IgG сохраняется в течение примерно 4-6 месяцев после рождения младенца. Если младенец рождается преждевременно, то у младенца будут низкие концентрации IgG, поскольку полноценное количество IgG не было получено от матери. Нормальные концентрации IgG для доношенного младенца составляют примерно 8-12 г/л. Низкие концентрации IgG составляют примерно 7,5, 7, 6, 5, 4, 3, 2 г/л или менее IgG для человека.

В одном варианте осуществления изобретения младенец рождается у матери с плацентарными нарушениями, гипергаммаглобулинемией, ВИЧ-инфекцией, плацентарной малярией, гуморальным иммунодефицитом или другой инфекцией или заболеванием, которые вызывают снижение переноса IgG через плаценту.

Недоношенный младенец человека рождается раньше положенного срока, составляющего менее чем примерно 37 недель беременности, обычно примерно на 26-34 неделе беременности. Другие млекопитающие рождаются недоношенными, если они рождаются на сроке, составляющем менее чем примерно 93% от полного времени беременности.

Младенец человека с низкой массой тела при рождении (в срок или преждевременно) весит менее чем примерно 2,5, 2,25, 2,0, 1,8, 1,5 кг или ниже при рождении. Другие млекопитающие имеют низкую массу тела при рождении, если они рождаются с массой ниже, чем примерно 75% от средней массы доношенных новорожденных для этого вида.

Материнские антитела обеспечивают пассивную иммунную защиту новорожденным, а также активно влияют на иммунную систему новорожденных. Материнские антитела могут сформировать репертуар B-клеток у потомства и модулировать зрелый ответный антителогенез у своего потомства. Например, у новорожденных от иммунизированных определенным идиотипом матерей или у новорожденных, получавших антиидиотипическую терапию, подавляется экспрессия определенного идиотипа в течение различных периодов времени. Смотри Rueff-Joy и др., J. Immunol. 16:721 (1998). Кроме того, у матерей, иммунизированных определенным антигеном, рождаются новорожденные с большим количеством IgM-антител с такой же антигенной специфичностью и таким же идиотипом, как антитела матери. Смотри тот же источник. Этот иммунный отпечаток может сохраняться в поколении F2. Lemke и др., Eur. J. Immunol. 24:3025 (1994). IgA материнского молока задерживает развитие зародышевых центров в GALT и снижает концентрацию IgA в сыворотке крови. Кроме того, сывороточные иммуноглобулины стимулируют развитие В-клеток у потомства без изменения репертуара В-клеток. Кроме того, иммуноглобулины материнского молока или молозива могут вызывать и поддерживать толерантность Cκ-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с фенотипом CD8+. Смотри Rueff-Joy и др., J. Immunol. 16:721 (1998).

Младенцы, которые не получают по существу молозива или грудного молока, или по существу молозива и по существу грудного молока, и которые необязательно являются недоношенными и/или больными (например, имеющими ослабленный иммунитет), не получают преимущества такого праймирования иммунной системы. Стало неожиданным, что младенцы, которые не получали по существу молозива и/или грудного молока и которые необязательно являются недоношенными и/или больными, положительно реагировали на лактоферрин в молочной смеси, поскольку их иммунная система не была праймирована молозивом или грудным молоком. По существу отсутствие получения молозива составляет менее чем 5 мл молозива. По существу отсутствие получения грудного молока составляет менее чем 10 мл грудного молока.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу повышения функции иммунных клеток у новорожденного млекопитающего, которое не потребляло по существу молозиво, по существу грудное молоко, или по существу молозиво и по существу грудное молоко, включающему введение новорожденному млекопитающему молочной смеси, содержащей примерно от 1,0 до примерно 10 г/л лактоферрина крупного рогатого скота. Иммунными клетками могут быть, например, Т-клетки, В-клетки, или природные клетки-киллеры, или любые другие клетки, обладающие способностью презентации антигена. Клетки, обладающие способностью презентации антигена, являются клетками, которые представляют комплексы белка или фрагмента белка на своей поверхности, таким образом, что T- или B-клетки, которые контактируют с таким комплексом, становятся активированными. Новорожденное млекопитающее может иметь незрелую иммунную систему, может иметь постоянно ослабленный иммунитет или может иметь временно ослабленный иммунитет. Новорожденное млекопитающее может родиться недоношенным или может быть больным. Повышение функции иммунных клеток может выражаться в увеличении концентрации общего сывороточного иммуноглобулина (например, увеличении концентрации общего сывороточного иммуноглобулина или увеличении секреции цитокинов клетками иммунной системы или их комбинации). Увеличение секреции цитокинов может выражаться в увеличении уровня IL-6, IL-10, IFN-гамма, IL-4, TNF-альфа, IL12p40 или их комбинации. Увеличение концентрации общего сывороточного иммуноглобулина или увеличение секреции цитокинов может выражаться в увеличение примерно на 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 процентов или более (или любой диапазон значений, или значение примерно от 5 до примерно 1000 процентов) по сравнению с аналогичным младенцем, который не получает молочную смесь с добавлением лактоферрина.

Все патенты, патентные заявки и другие научные или технические документы, упомянутые по тексту данного описания, включены сюда в качестве ссылки во всей своей полноте. Изобретение, иллюстративно описанное здесь, соответственно может применяться на практике в отсутствие любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые не были здесь конкретно раскрыты. Так, например, в каждом отдельном случае настоящего документа любой из терминов «включающий», «состоящий по существу из» и «состоящий из» может быть заменен любым из двух других терминов при сохранении их общепринятого значения. Использованные термины и выражения применяются в качестве терминов описания, а не ограничения, без намерения при применении таких терминов и выражений исключить любые эквиваленты показанных и описанных признаков или их частей, но подразумевается, что в пределах объема изобретения, описанного в формуле изобретения, возможны различные модификации. Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение конкретно раскрыто вариантами осуществления, необязательными признаками, специалисты в данной области техники могут прибегнуть к модификации и варианту раскрытых здесь сущностей изобретения, и считается, что такие модификации и варианты находятся в пределах объема настоящего изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения.

Кроме того, если признаки или аспекты настоящего изобретения описаны в терминах группы Маркуша или других групп альтернатив, то специалистам в данной области техники понятно, что тем самым изобретение также описано в терминах любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша или другой группы.

Нижеследующее приведено исключительно в иллюстративных целях и не предназначено для ограничения объема изобретения, в общих чертах описанного выше.

Примеры

Пример 1

Новорожденным поросятам, не получавшим молозива, скармливали в течение 7 суток или 14 суток смесь, содержащую 0,4 (контроль), 1,0 (LF1) или 3,6 (LF3) г/л лактоферрина крупного рогатого скота. Были отобраны сыворотки крови и ткани иммунной системы (селезенка, пейеровы бляшки подвздошной кишки и брыжеечные лимфатические узлы). Иммунные клетки выделяли из крови, пейеровых бляшек подвздошной кишки и брыжеечных лимфатических узлов, и не подвергались стимуляции или подвергались стимуляции ex vivo в течение 72 часов полимиксином B (PB) (10 мкг/мл), LF (50 мкг/мл)+PB, LPS (2 мкг/мл), LPS+LF, PreLPS+LF (смешанные в течение 1 часа перед добавлением в культуру) или PHA (2,5 мкг/мл).

Концентрации сывороточного иммуноглобулина определяли с использованием наборов для количественного определения антител, специфичных для свиней, производства Bethyl Laboratories (Монтгомери, штат Техас). Вкратце, 96-луночные планшеты с плоским дном для ELISA покрывали 10 мкг/мл антисвиным иммобилизованным антителом, разведенным в покрывающем буфере (карбонат/бикарбонат натрия, рН 9,6) и инкубировали в течение ночи при 4°С. На следующие сутки покрывающий буфер удаляли и планшет блокировали 300 мкл 3% BSA/PBS при комнатной температуре в течение 1 часа. Через 1 час планшеты отмывали 3 раза PBS/0,1% Твином™ 20 (полисорбатом). Затем пробы разводили PBS/0,5% рыбьим желатином и в лунки добавляли по 100 мкл каждой разведенной пробы. Через час после инкубации планшет снова отмывали PBS/Твином™ (полисорбатом). Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл козьего антисвиного IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена, разведенной до концентрации 1:75000 PBS/0,5% рыбьим желатином. Планшет инкубировали в темноте в течение 1 часа. Затем планшет отмывали 5 раз PBS/Твином™ (полисорбатом) и в каждую лунку вносили пипеткой TMB (100 мкл). Планшет инкубировали в темноте в течение 15 минут. Наконец, в качестве стоп-реагента добавляли 100 мкл 2 н раствора серной кислоты. Поглощение содержимого лунок планшета считывали при 450 нм на SpectraMax с 570 нм в качестве калибровочной длины волны планшета. Данные рассчитывали с использованием стандартной кривой, включенной в набор для количественного определения.

Для оценки продукции цитокинов клетки выделяли из селезенки и брыжеечных лимфатических узлов (MLN) 7-дневных поросят с использованием сочетания методов механической и ферментативной диссоциации. Полные клеточные изоляты оставляли нестимулированными или стимулированными, инкубировали в течение 72 часа при 36°С в атмосфере 5% углекислого газа. Стимуляторы включали: полимиксин В (РВ, 10 мкг/мл), LF (50 мкг/мл)+РВ, LPS (2 мкг/мл), LPS+LF, PHA (2,5 мкг/мл) или LF, который инкубировали с LPS в течение 1 часа перед добавлением в культуры. LPS стимулирует В-клетки и другие антигенпредставляющие клетки, которые экспрессируют TLR4 (рецептор LPS). LPS не стимулирует Т-клетки. РНА стимулирует Т-клетки. PHA связывается с гликопротеином на поверхности Т-клеток, вызывая активацию Т-клеток.

Супернатанты собирали через 72 часа, замораживали и отправляли в Panomics (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния) для анализа с использованием наборов Procarta Cytokine Plex на платформе Luminex.

На фигуре 1 показано, что диетический лактоферрин увеличивал концентрацию IgG в сыворотке крови. Обработка LF3 приводила к достоверному увеличению концентрации IgG в сыворотке крови по сравнению с обработкой LF1.

В клетках брыжеечных лимфатических узлов диетический лактоферрин увеличивал продукцию IL-6 клетками, стимулированными LPS, но нестимулированными PHA клетками ex vivo. Фигура 2А. Эти данные указывают, что лактоферрин должен вводиться перорально, чтобы быть эффективным в увеличении продукции цитокинов, и может быть неэффективным при введении другим путем, таким как внутривенный или подкожный, или любым другим способом. Кроме того, различный ответ на стимулятор В-клеток LPS и стимулятор Т-клеток PHA свидетельствует о том, что диетический лактоферрин может специфически воздействовать на клетки, связанные с LPS-стимулированным ответом, такие как В-клетки, или другие клетки с Toll-подобным рецептором 4 (TLR4), рецептором положительных клеток.

Лактоферрин, доставленный ex vivo, не снижал продукцию IL-6 в ответ на стимуляцию LPS. Фигура 2B. Эти данные указывают, что введение лактоферрина не ингибировало врожденный ответ на LPS-несущие бактерии. Эти данные также указывают на то, что лактоферрин непосредственно не взаимодействовал с LPS, и таким образом, присутствие LPS в пищевой среде, вероятно, не оказывает влияния на способность клеток индивидуума, потребляющего лактоферрин, проявлять усиленный цитокиновый ответ.

Диетический лактоферрин увеличивал продукцию IL-6, но не влиял стимуляцией лактоферрина ex vivo. Фигура 2C. Показано, что лактоферрин должен вводиться перорально, чтобы быть эффективным, и может быть неэффективным при введении другим путем, таким как внутривенный или подкожный, или любым другим способом.

В клетках брыжеечных лимфатических узлов диетический лактоферрин увеличивал продукцию IL-10 клетками, стимулированными LPS ex vivo. Лактоферрин, доставленный ex vivo, не снижал продукцию IL-10 в ответ на стимуляцию LPS. Фигуры 3А и 3В. Эти данные еще раз подтверждают, что лактоферрин должен вводиться перорально, чтобы быть эффективным, и что лактоферрин непосредственно не взаимодействовал с LPS, означая, что присутствие LPS в пищевой среде, вероятно, не оказывает влияния на способность клеток индивидуума, потребляющего лактоферрин, проявлять усиленный цитокиновый ответ.

В клетках брыжеечных лимфатических узлов диетический лактоферрин увеличивал продукцию IFN-γ клетками, стимулированными LPS, но нестимулированными PHA клетками ex vivo. Фигура 4А. Лактоферрин, доставленный ex vivo, не снижал продукцию IFN-γ в ответ на стимуляцию LPS. Фигура 4В.

В стимулированных LPS клетках брыжеечных лимфатических узлов продукция IL-4 была снижена под действием стимуляции лактоферрином ex vivo. Фигура 5. В отличие от других эффектов лактоферрина в отношении продукции цитокинов, где необходима пищевая нагрузка для увеличения продукции цитокинов, в данном случае результаты показывают, что другие пути введения лактоферрина, такие как внутривенный, могут быть более эффективными в снижении продукции IL-4 в ответ на воздействие LPS-положительными бактериями, чем на воздействие диетическим лактоферрином.

В клетках селезенки диетический лактоферрин увеличивал продукцию IL-10 клетками, стимулированными LPS ex vivo. Лактоферрин, доставленный ex vivo, не снижал продукцию IL-10 в ответ на стимуляцию LPS. Фигуры 6А и 6В.

В клетках селезенки диетический лактоферрин увеличивал продукцию IFN-γ клетками, стимулированными LPS ex vivo. Лактоферрин, доставленный ex vivo, не снижал продукцию IFN-γ в ответ на стимуляцию LPS. Фигура 7В.

В стимулированных LPS клетках селезенки продукция IL-4 была увеличена диетическим лактоферрином. Фигура 8.

В клетках селезенки диетический лактоферрин увеличивал продукцию TNF-α клетками, стимулированными LPS ex vivo. Лактоферрин, доставленный ex vivo, не снижал продукцию TNF-α в ответ на стимуляцию LPS. Фигура 9.

В клетках селезенки продукция IL-12р40 была увеличена за счет стимуляции PHA ex vivo. В отличие от других эффектов диетического лактоферрина, где продукция цитокинов увеличивалась в ответ на стимуляцию LPS, но не на стимуляцию PHA, продукция IL-12р40 в селезенке увеличивалась при стимуляции PHA, подтверждая, что диетический лактоферрин также влияет на Т-клетки.

Диетические лактоферрин способствовал увеличению продукции IL-12р40. Фигура 10.

В таблице 1 приведен ряд цитокинов, которые определяли в вышеуказанных экспериментах.

В целом иммунный ответ повышался в нестимулированных и стимулированных условиях в основном при введении лактоферрина в пищевой рацион (пероральное введение), но не при непосредственном добавлении лактоферрина к клеткам в культуре. На основании этого можно предположить, что способ введения через пищевой рацион является необходимым для лактоферрина, чтобы быть эффективным иммуностимулятором при условии, где индивидуум является новорожденным, лишенным молозива, имеющим ослабленный иммунитет, или при одном из вышеуказанных условий. Отсутствие эффекта стимуляции лактоферрином ex vivo, при костимуляции LPS ex vivo, означает, что природный LPS не будет препятствовать использованию или применению способов и композиций по изобретению. Диетический лактоферрин увеличивал исходную продукцию многих цитокинов, а также улучшал цитокиновый ответ на стимуляцию LPS, указывая на вероятное усиление ответа на бактериальную стимуляцию у индивидуумов, получавших диетический лактоферрин в приведенных концентрациях. Повышенные уровни циркулирующих иммуноглобулинов усиливают защиту и от бактерий, и от вирусов. В совокупности эти данные указывают на то, что введение лактоферрина в пищевой рацион приведет к усилению иммунного ответа, в частности, у индивидуумов, имеющих ослабленный иммунитет, лишенных молозива, или индивидуумов с аналогичной иммунной недостаточностью.