Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОТБОРА ЛИЦ ДЛЯ РАБОТ ПО УНИЧТОЖЕНИЮ БОЕВЫХ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ

Изобретение относится к области медицины, в частности к гигиене труда и профессиональному отбору, и может быть использовано для отбора лиц для работ по утилизации боевых отравляющих веществ (БОВ).

Отравляющие вещества (ОВ) - токсичные химические соединения, предназначенные для поражения живой силы противника во время военных действий и одновременном сохранении материальных ценностей при атаке в городе. Могут проникать в организм через органы дыхания, кожные покровы и пищеварительный тракт. Боевые свойства (боевая эффективность) ОВ определяются их токсичностью (обусловленной способностью ингибировать ферменты или взаимодействовать с рецепторами), физико-химическими свойствами (летучесть, растворимость, устойчивость к гидролизу и т.д.), способностью проникать через биобарьеры теплокровных и преодолевать средства защиты.

В 1993-м была принята международная Конвенция, не только запрещающая применение этого оружия массового поражения, разработку его новых видов, предписывающая демонтаж или конверсию предприятий по производству, но и предусматривающая полное уничтожение всех запасов химического оружия.

Вопросам уничтожения ОВ посвящено множество научных исследований, результаты которых опубликованы в патентах на изобретения RU №№2175110 МПК F42D 5/04, G21J 3/00, 20.10.2001; 2225240, 2221614, 2217199, 2209646, 2225751, 2216396, 2209103, 2229913, 2041206; в диссертации (Григорьева А.В. "Выбор и исследование методов синтеза прекурсоров имитаторов ФОВ и экологически оптимальных способов уничтожения иприта" автореферат диссертации, СПб, 2010) и других научных публикациях.

Научно установлено, что в результате воздействия химических агентов на клетки возникают мутации, которые могут сохранятся весь репродуктивный период особи (Lyon M.F., Phillips R.J.S. Bailey H.I. Mutagenic effects of mouse spermatogonia. I. Specific locus mutation rates, - Mutat. Res., 1972b, vol. 15, №2, p. 185) и могут привести к возникновению генетических нарушений у потомства.

Известны способы профилактики мутагенных эффектов воздействия на организм алкилирующего соединения циклофосфана (Патент на изобретение RU №2189232 от 10.07.2000; патент на изобретение RU №2145869, 30.04.1999).

Индуцированный мутагенез представляет реальную опасность для жизни и здоровья человека, поскольку вновь возникающие мутации оказывают негативное влияние на приспособленность популяции в целом и здоровье пораженного индивидуума в отдельности (Leonard A. L incidence de la civilisatiion industrielle sur le patromoine genetique de l homme // Rev. Quest Sci. - 1981. - 152. - P. 385).

Практически десятая часть населения отягощена грузом наследственных заболеваний (Leonard A. L incidence de la civilisatiion industrielle sur le patromoine genetique de l homme // Rev. Quest Sci. - 1981. - 152. - P. 385).

Дальнейшее увеличение, даже незначительное, уровня мутирования может привести к прогрессивному накоплению и распространению вновь возникающих мутаций (Шалп У.Дж. Медицинские аспекты увеличения генетического груза в результате действия мутагенов окружающей среды // Генетические последствия загрязнения окружающей среды. - М.: Наука, 1977. - С. 31).

Одной из наиболее актуальных проблем медицины и, в частности, фармакологии и клинической токсикологии является профилактика мутагенных последствий неблагоприятного воздействия токсикантов в субтоксических дозах. Это реализуется как ограничением контакта человека с токсикантами мутагенами, так и применением фармакологических средств защиты от мутагенных воздействий (Дурнев А.Д., Середин С.Б. Современные принципы охраны наследственности человека. - Росс. Национ. Конгресс «Человек и лекарство». Москва, 1998. - с. 331). Антимутагенные свойства выявлены у многих природных и синтетических соединений: витаминов, аминокислот, естественных метаболитов и веществ органической и неорганической природы.

В 80-х годах прошлого столетия в военном институте в Шиханах И.Ю. Худецкий и В.Б. Засидателев разработали методическое, аппаратурное и программно-математическое обеспечение исследований умственной работоспособности и элементов операторской деятельности военных специалистов. В 1985 г. было разработано внутривидовое «Руководство по эргономическому обеспечению» (РЭО-ХВ-85). Совместно с сотрудниками ВМедА им. С.М. Кирова было обосновано «Руководство по профессиональному психофизиологическому отбору и рациональному распределению призывников, военнослужащих срочной службы и кандидатов на обучение военным специальностям в ВС СССР», введенном в действие приказом МО СССР N 162. Приказом Начальника Химических войск МО СССР было принято на снабжение химических войск «Пособие по противохимической защите» (ПХЗ-1), позволяющее производить регламентацию боевой деятельности личного состава, применяющего средства индивидуальной защиты от оружия массового поражения.

В указанных документах к работам с БОВ могли привлекаться все лица, признанные годными к призыву и службе в рядах ВС СССР. Такой подход к отбору лиц для работы по уничтожению БОВ не отвечает требованиям объективности и точности.

Цель изобретения - повысить объективность профотбора лиц для работы по уничтожению БОВ за счет использования информативных критериев оценки состояния их здоровья и научного прогнозирования возможных последствий воздействия на них малых доз БОВ.

Цель достигается тем, что при профессиональном отборе лиц для работ по уничтожению боевых отравляющих веществ путем оценки данных лабораторных и клинических исследований, отличающийся тем, что дополнительно исследуют в лимфоцитах периферической крови количество хромосомных аберраций и полагают прошедшими профотбор лиц, у которых не выявлено увеличения числа клеток с хромосомными аберрациями, превышающих нормальный уровень спонтанных хромосомных аберраций более чем в 2 раза.

В таблице 1 - представлена частота и спектр хромосомных аберраций у военнослужащих «Объектов» и в контрольной группе (М±m)

В таблице 2 представлены изменения в генетическом аппарате клеток костного мозга в результате воздействия иприта, вводимого экспериментальным животным в субтоксической дозе.

В таблице 3 - показано влияние повторного (через 50 сут) отравления азотистым ипритом (1,8 мг/кг) на уровень хромосомных аберраций в миелокариоцитах крыс, количество ХА в %.

В таблице 4 - показано влияние повторного (через 50 сут) отравления азотистым ипритом (1,8 мг/кг) на уровень реципрокных транслокаций в сперматогониях крыс.

На фиг. 1 представлена доля носителей обменных аберраций хромосомного типа среди военнослужащих «Объектов» и в контрольной группе.

Способ реализуется следующим образом.

Исследуют у кандидатов на работы, связанные с уничтожением БОВ, лимфоциты периферической крови и полагают прошедшими профотбор лиц, у которых не выявлено увеличения числа клеток с хромосомными аберрациями, превышающими нормальный уровень спонтанных хромосомных аберраций более чем в 2 раза.

Для цитогенетического обследования кровь брали из локтевой вены в стерильные вакутейнеры с гепарином. Культивирование лимфоцитов периферической крови и получение препаратов метафазных хромосом осуществляли по стандартной методике [Мак-Грегор М., Варли Дж. Методы работы с хромосомами: Пер. с англ. - М.: из-во «Мир», 1985. - 347 с.] На каждого обследованного ставили две параллельные пробы.

В сосуд для культивирования помещали 5 мл культуральной среды и 0,5 мл цельной гепаринизированной крови. Для приготовления культуральной среды в 4 мл стерильной питательной среды (RPMI 1640 с L-глютамином, фирма «Биолот») добавляли 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки (St-Biol, фирма «Биолот»), 40 мкл ФГА (фирма «ПанЭко») и антибиотики. Для накопления клеток на стадии метафазы через 48-52 часов после начала культивирования в культуры крови вводили колхицин в конечной концентрации 0,3 мкг/мл.

Для приготовления препаратов метафазных хромосом культивированные лимфоциты в течение 40 мин подвергали гипотонической обработке предварительно нагретым до 37°C 0,5% раствором KCl. Фиксацию клеток производили в трех сменах свежеприготовленного охлажденного фиксатора (метанол - уксусная кислота в объемном соотношении 3:1). Полученную в последней порции фиксатора клеточную взвесь желаемой концентрации наносили каплями на охлажденное, смоченное водой предметное стекло, высушивали над пламенем горелки и окрашивали в течение 10 минут азур-эозином по Романовскому (вариант «Профессионал» фирмы «Абрис плюс»). Окрашенные препараты шифровали и анализировали с помощью светового микроскопа фирмы Leica (ФРГ) под иммерсией при увеличении 100×10. От каждого человека было проанализировано от 100 до 200 метафазных пластинок (среднее число метафаз на человека 165,2±4,78).

Результаты выражены в количестве ХА на 100 клеток. В соответствии с методическими указаниями Всемирной организации здравоохранения [Гигиенические критерии состояния окружающей среды, вып. 46. Руководство по изучению генетических эффектов в популяции человека // Женева, 1989. - 121 с.] анализировали все виды хромосомных аберраций, распознаваемые без кариотипирования.

Математическая обработка данных производилась при помощи пакета прикладных программ Statistica for Windows, версия 6.0. Все оценки групповых частот аберраций были получены в результате усреднения индивидуальных частот, соответствующие ошибки отражали групповую изменчивость частот аберраций, т.е. не вычислялись через суммарное число клеток для группы. Поскольку распределение ХА отличалось от нормального, для обработки данных использовались непараметрические методы, принятые в популяционных цитогенетических исследованиях: критерий Манна-Уитни, корреляционный анализ Кендалла. Значимость различия частот заболеваемости в различных группах определяли с помощью точного критерия Фишера, для оценки величины различий вычисляли относительный риск. Различия признавали значимыми при р<0,05.

Для доказательства соответствия предлагаемого технического решения критерию изобретения «промышленная применимость» были проведены наблюдения за лицами, распределенными в двух группах. (Табл. 1)

Основная группа состояла из 69 человек, участвующих в выполнении работ по уничтожению химического оружия военнослужащих «Объектов», в возрасте от 22 до 48 лет (средний возраст 33,8±0,64).

Контрольная группа из 40 человек состояла из близких к обследуемым по возрасту жителей Ленинградской области, проживающих практически в тех же эколого-гигиенических условиях, что и военнослужащие объектов хранения и уничтожения химического оружия. Средний возраст в этой группе составил 34,7±1,9 лет.

Результаты цитогенетических обследований кандидатов на выполнение работ с БОВ и работников «Объектов» представлены в таблице 2.

При исследовании уровня ХА в контрольной группе было установлено, что он близок к популяционным данным, полученным разными авторами у нескольких тысяч человек за многие годы, и составил 2,67±0,21 (на 100 клеток). Спектр ХА также был сходен с популяционным. 74,5% ХА составляли нестабильные аберрации хроматидного типа, представленные одиночными фрагментами. Из нестабильных аберраций хромосомного типа в контрольной группе наблюдались парные фрагмента и дицентрики, на их долю пришлось около 25% ХА. Стабильные аберрации, определяемые при рутинном окрашивании как атипичные моноцентрики, составляли 0,6% от всех ХА.

В результате проведенного исследования установлено, что и общий уровень ХА, и частота отдельных типов аберраций у персонала «Объектов» статистически значимо превышали контрольные значения. В целом группа характеризовалась широким спектром выявленных аберраций как хромосомного, так и хроматидного типа. Были выявлены одиночные и парные фрагменты, хроматидные обмены, дицентрические и кольцевые хромосомы, атипичные моноцентрики.

Наиболее грубыми нарушениями хромосомного аппарата клетки являются обменные аберрации хромосомного типа. Обменные аберрации хромосомного типа считаются характерными для радиационного мутагенеза и их выявление у военнослужащих, занятых на работах с токсичными химикатами, может свидетельствовать о высокой степени повреждения генома. У военнослужащих «Объектов» этот показатель составил 0,17±0,03 против 0,03±0,02 в контрольной группе (р=0,003). Особого внимания заслуживает необычно высокий уровень кольцевых хромосом в группе военнослужащих «Объектов». Как правило, дицентрики и кольца при анализе объединяют в одну группу, поскольку частота кольцевых хромосом даже в экспонированных популяциях составляет 10-15% от частоты дицентриков, и обычно настолько мала, что в ограниченных когортах не поддается статистической обработке.

Вместе с тем, при метаанализе результатов многолетних мультицентровых исследований в различных странах было показано, что наличие именно кольцевых хромосом наиболее тесно ассоциировано с риском возникновения онкологических заболеваний [Bonassi S., Norppa Н., Ceppi М, Stromberg U. et al. Chromosomal aberration frequency in lymphocytes predicts the risk of cancer: results from a pooled cohort study of 22358 subjects in 11 countries // Carcinogenesis. - 2008. - V. 29, №6. - P. 1178-83].

Среди военнослужащих «Объектов» обменные аберрации хромосомного типа имели 19 человек (28,3%), в то время как из 40 лиц контрольной группы они встречались только у 3-х (7,45%) (фиг. 1), различия статистически значимы при р=0,0003.

Для уточнения роли повторного «отравления» в субтоксической дозе в нарушении цитогенетического статуса в соматических и половых клетках были проведены исследования уровня индуцированных алкилирующими агентами хромосомных аберраций в миелокариоцитах костного мозга и сперматогониях белых беспородных крыс-самцов.

Проведенные исследования иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Генетический аппарат клеток костного мозга экспериментальных животных после воздействия на организм иприта в субтоксических дозах

Исследования проводились на взрослых рандомбредных белых крысах - самцах массой 180-220 г, поставленных из питомника "Рапполово" РАМН.

Для затравки животных применяли азотистый иприт, вводимый в субтоксических дозах (не вызывающих клинические проявления отравления). Получение нужной концентрации иприта достигалось разведением токсиканта 50%-ным этиловым спиртом. Спиртовый раствор иприта в дозе 1,8 мг/кг вводили экспериментальным животным в хвостовую вену.

Хромосомные аберрации исследовали в миелокариоцитах беспородных крыс по методике Форда и Хамертона (Ford C.E., Hamerton J.L. Chromosomes off iverodentspecies // Nature. - 1956. - Vol. 31. - P. 247-254). В основе этой методики лежит регистрация структурных повреждений хромосом, которые возникают на различных стадиях митотического цикла клетки и в своем развитии доходят до стадии метафазы.

Приготовление препаратов костного мозга производили через 24 ч после последнего введения препарата по методу, описанному А.М. Малашенко и Г.Н. Золотаревой (Малашенко A.M. Определение мутагенности химических соединений (генетический скрининг) на лабораторных мышах (мет. указания). М., 1977, 12 с.), а также Орловым и Чудиновской (Орлов В.П., Г.А. Чудиновская, Е.П. Крюкова. Исследование хромосомных наборов млекопитающих. Мет. руководство. М., Наука, 1976, 15 с.). Для этого за 2 ч до эвтаназии животным внутрибрюшинно вводили 0,2 мл раствора колхицина (фирмы "Serva") в дозе 4,8 мкг/г массы тела.

Крыс подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации, быстро выделяли большеберцовые кости и вымывали костный мозг подогретой до 37°C средой N 199 в центрифужную пробирку с 10 мл той же среды. Пробирки с суспензией центрифугировали при 150 g в течение 6 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли 8 мл подогретого (до 37°C) 0,56% раствора хлористого калия. Клетки тщательно ресуспендировали и помещали в термостат при 37°C на 20 мин, после чего вновь подвергали центрифугированию. Надосадочную жидкость удаляли, оставляя ее около 0,3 мл. После тщательного перемешивания к осадку добавляли 6-8 мл охлажденного фиксатора, состоящего из ледяной уксусной кислоты и метанола (в соотношении 1:3). Смесь готовили перед фиксацией и хранили в холодильнике. Пробирки закрывали пробками, содержимое их перемешивали встряхиванием и помещали в холодильник на 10-15 мин. Затем суспензию вновь центрифугировали и добавляли 5-6 мл свежего фиксатора. Эту процедуру повторяли 2-3 раза.

Перед приготовлением препаратов суспензию центрифугировали при 150 g в течение 6 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а к осадку добавляли 1 мл свежего фиксатора и ресуспендировали. Затем на обезжиренные, влажные и охлажденные предметные стекла наносили 8-10 капель суспензии. Фиксатор выжигали в пламени горелки, а стекла подсушивали на воздухе.

Анализ препаратов проводили с помощью микроскопа фирмы "Leika" (Германия) с иммерсионным объективом (увеличение 25×100×1,25), для чего отбирали неразрушенные клетки округлой формы с хорошим разбросом и без наложений хромосом. От каждого животного анализировали не менее 100 метафаз, всего на вариант опыта - 500-600 клеток. Учитывали процент клеток с аберрациями хромосом, число одиночных фрагментов, парных фрагментов, хроматидных обменов. Метафазы анализировали на наличие в них хромосомных аберраций по рекомендациям ВОЗ.

Для анализа хромосомных аберраций считались пригодными следующие метафазные пластинки: все хромосомы четко окрашены, количество их не превышало 43 и было не меньше 40; не допускался анализ метафазных пластинок, содержащих большое количество наложений, особенно продольных.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью сравнения распределений по t критерию Стьюдента.

Проведенные исследования показали (таблица 3), что иприт, вводимый экспериментальным животным в субтоксической (не смертельной) дозе 1,8 мг/кг, вызывает значимые изменения в генетическом аппарате клеток костного мозга. Это проявилось в увеличении числа миелокариоцитов с хромосомными аберрациями (с 0,62% в контроле до 14,3% в опыте), то есть уровень хромосомных аберраций возрос более чем в 20 раз. При изучении РТ (таблица 3) было выявлено, что частота возникновения РТ у животных опытной группы, затравленных ипритом, возрастает по сравнению с интактными животными более чем в 6 раз (с 0,74 до 4,8%).

На основании вышеизложенного можно заключить, что азотистый иприт в изучаемой дозе оказывает мощное мутагенное действие на соматические и, особенно, половые клетки млекопитающих. Это проявляется ростом (по сравнению с фоновыми значениями) цитогенетических нарушений в виде хромосомных аберраций и реципрокных транслокаций (в 20 и 6 раз соответственно).

Следует подчеркнуть, что во всех группах исследования (таблица 3) встречаются 2 типа аберраций - одиночные и парные фрагменты. В группе животных, подвергнутых воздействию иприта в субтоксических дозах, нами обнаружены редкие для спонтанного фона аберрации - транслокации. Такого рода данные подтверждают общепринятые представления о высокой мутагенной активности алкилирующих агентов, к которым относится изучаемый токсикант.

Чувствительность половых клеток к воздействию химических агентов исследована не достаточно. В настоящей работе исследовали последствия воздействия иприта в субтоксической дозе на генетический аппарат сперматогоний. Интерес к этой стадии вызван следующим обстоятельством: мутации, возникающие в результате воздействия химических агентов на исследуемые клетки могут сохранятся весь репродуктивный период особи (Lyon M.F., Phillips R.J.S. Bailey H.I. Mutagenic effects of mouse spermatogonia. I. Specific locus mutation rates, - Mutat. Res., 1972b, vol. 15, №2, p. 185-190) и могут привести к возникновению генетических нарушений у потомства.

В качестве критерия мутагенной эффективности иприта был использован тест оценки реципрокных транслокаций (РТ) в половых клетках (сперматогониях) экспериментальных животных,

В каждой группе опыта использовали по 5 самцов крыс, от каждого животного анализировали по 200 метафаз. Эвтаназию животных и изготовление препаратов осуществляли через 50 суток после воздействия.

Термином реципрокные транслокации (РТ) обозначают взаимные обмены участками негомологичных хромосом. Этот тип хромосомных аберраций не отсеивается при делении клеток, доходит до стадии спермиев и, как хорошо известно, может явиться причиной ряда наследственных болезней

Цитологически частоту РТ в стволовых сперматогониях исследуют обычно не ранее чем через 45 дней после воздействия, то есть в постстерильный период, в сперматоцитах на стадии диакинеза-метафазы первого мейотического деления на постоянных воздушно-сухих препаратах, приготовленных по методике, предложенной Ивенсом, Фордом и соавт. (Evans Е.Р., Brecon G., Ford C.C. An air drying method for meiotic preparations from mammalian tests. - Cytogenetics, 1964, vol. 2, p. 289-294, Ford C.E. Meiosis in mammals. - In: Comparative mammalian cytogenetics. B. etc.: Spring. - Verl., 1969, p. 91-106).

Экспериментальных животных - самцов крыс подвергали эвтаназии путем смещения шейных позвонков. Семенники извлекали, освобождали от оболочки, измельчали в 2,2%-ном растворе цитрата натрия. Обрывки тканей и оболочек семенных канальцев осаждали центрифугированием в течение 30 секунд при 500 об/мин. Надосадочную жидкость подвергали повторному центрифугированию в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в 1%-ном растворе цитрата натрия для гипотонической обработки 9-10 мин. После повторного центрифугирования клетки фиксировали в смеси метилового спирта и уксусной кислоты (3:1) с добавлением 2-капель хлороформа. После двухкратной смены фиксатора 2 капли суспензии клеток в фиксаторе наносили на предметное стекло и просушивали под лампой. Препараты окрашивали уксуснокислым лактоорсеином.

Анализ сперматоцитов проводили на стадии диакинеза-метафазы 1 мейотического деления (Searle A.G., Ford E.C., Eans R.P. et al. Theinduction of translocations in-mousespermatozoa. I. Kineticsof dose response with acute X-irradiation. - Mutat. Res., 1974, vol. 22, №2, p. 157).

От каждого самца анализировали, как правило, не менее 200 метафаз. В норме на этой стадии сперматоциты содержат 21 бивалент, образованные при конъюгации гомологичных хромосом. В случае наличия РТ хромосомы с транслоцированными участками при конъюгации образуют мультивалентные конфигурации из трех, четырех и более хромосом в виде «колец» или «цепей». Общее число бивалентов в этом случае меньше 21. Чаще всего наблюдаются конфигурации в виде квадривалентов, указывающие на наличие одной РТ. Иногда в метафазе присутствуют ассоциации из трех и более бивалентов или имеются два и больше квадривалента, что указывает на наличие двух или более РТ.

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Стьюдента для малых выборок, при этом за величину выборки принимали число исследованных семенников.

В результате проведенных исследований (таблица 4) было выявлено, что частота возникновения РТ у животных контрольной группы, затравленных ипритом возрастает по сравнению с интактными животными более чем в 6 раз (с 0,74 до 4,8%). Такого рода данные свидетельствуют о высокой мутагенной активности иприта в отношении половых клеток млекопитающих при воздействии токсиканта в дозах, не вызывающих клинические проявления отравления.

Впервые показано, что субтоксические дозы азотистого иприта приводят к повреждению генетического аппарата не только в соматических, но и в половых клетках млекопитающих (таблица 3 и 4). Количество клеток с РТ возросло по сравнению с фоновыми значениями более чем в 6 раз.

Полученные данные могут свидетельствовать о том, что повышение (более чем в 2 раза по сравнению с нормой) уровня спонтанных хромосомных аберраций с 0,62±0,25 до 2,8+0,7%, в условиях выполненных экспериментальных исследований может свидетельствовать о формировании выраженных нарушений в геноме исследуемых клеток под влиянием БОВ. Подтверждением тому могут служить данные о существенном росте цитогентических нарушений при повторном воздействии алкилирующего токсиканта - иприта даже в субтоксической дозе.

Так в случае первичного отравления животных азотистым ипритом в субтоксической дозе количество миелокариоцитов с хромосомными аберрациями возрастало с 0,62±0,25 до 14,3±1,37%. (табл. 3 и 4). Повышение уровня спонтанных хромосомных аберраций до 2,8+0,7% сопровождалось ростом числа миелокариоцитов (более, чем в 4 раза) с онтогенетическими нарушениями при повторном отравлении БОВ (табл. 3). Аналогичную картину наблюдали и в половых клетках - сперматогониях (табл. 4).

Таким образом, результаты экспериментальных исследований подтверждают значимость роста (более чем в 2 раза по сравнению с нормой) уровня спонтанных хромосомных аберраций в прогнозировании цитогенетических нарушений при повторном воздействии на организм БОВ в субтоксических дозах. Такого рода данные могут свидетельствовать о необходимости оценки уровня спонтанных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови при профессиональном отборе лиц для работ по уничтожению боевых отравляющих веществ.