N-[3-ОКСОЛУП-20(29)-ЕН-28-ОИЛ]-2,2,6,6-ТЕТРАМЕТИЛПИПЕРИДИН-4-ИЛАМИН, ОБЛАДАЮЩИЙ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области химии и медицины, в частности к средствам химической терапии онкологических заболеваний.

Химическая терапия онкологических заболеваний является одной из основных проблем современной медицины, что связано как с недостаточной эффективностью многих препаратов, так и с сопутствующими их применению побочными эффектами. Кроме того, опухолевые клетки, пережившие химиотерапию, нередко проявляют лекарственную устойчивость к широкому спектру препаратов. Таким образом, поиск лекарственных средств новых структурных типов остается важной и актуальной задачей.

Растительные терпеноиды - одна из крупнейших групп биохимических веществ, которые традиционно используется в лечебных целях в Индии и Китае, в настоящее время рассматривается в качестве противоопухолевых препаратов в клинических испытаниях. Терпеноиды являются вторичными метаболитами, содержащимися в большинстве организмов, особенно растений. Как известно, существует более 40000 видов растительных терпеноидов, и каждый год обнаруживаются все новые соединения [ J., S. Isoprenoids: an evolutionary pool for photoprotection // Trends Plant Sci. - 2005. - 10. - 166-169; Withers S.T., Keasling J.D. Biosynthesis and engineering of isoprenoid small molecules // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - 73. - 980-990]. Большое количество природных терпеноидов известны как средства для профилактики опухолевых заболеваний. Они вызывают цитотоксический эффект в опухолевых клетках, что показано в доклинических испытаниях на животных.

Растительные терпеноиды представляют собой одну из наиболее многочисленных групп природных соединений. Разнообразие структур и функций терпеноидов вызывает повышенный интерес к их коммерческому использованию. Растительные терпеноиды были признаны полезными в профилактике и лечении ряда заболеваний, включая рак, а также они обладают противомикробными, противогрибковыми, противопаразитарными, противовирусными, антиаллергенными, спазмолитическими, гипогликемическими, противовоспалительными, иммуномодулирующими свойствами [Rabi Т., Bishayee A. Terpenoids and breast cancer chemoprevention // Breast Cancer Res. Treat. - 2009. - 115. - 223-239; Wagner K.H., Elmadfa I. Biological relevance of terpenoids. Overview focusing on mono-, di- and tetraterpenes // Ann. Nutr. Metab. - 2003. - 47. - 95-106; Sultana N., Ata A. Oleanolic acid and related derivatives as medicinally important compounds // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. - 2008. - 23. - 739-756; Shah B.A., Qazi G.N., Taneja S.C. Boswellic acids: a group of medicinally important compounds // Nat. Prod. Rep. - 2009. - 26. - 72-89].

Терпеноиды делятся на несколько классов, таких как монотерпены, дитерпены, тритерпены и тетратерпены [Rabi Т., Bishayee A. Terpenoids and breast cancer chemoprevention // Breast Cancer Res. Treat. - 2009. - 115. - 223-239].

Эпидемиологические и экспериментальные исследования показывают, что монотерпены могут быть полезными в профилактике и лечении ряда раковых заболеваний, в том числе рака молочных желез, кожи, легких, полости рта, толстой кишки, карциномы поджелудочной и предстательной железы [Burke Y.D., Ayoubi A.S., Werner S.R., McFarland B.C., Heilman D.K., Ruggeri B.A., Crowell P.L. Effects of the isoprenoids perillyl alcohol and farnesol on apoptosis biomarkers in pancreatic cancer chemoprevention // Anticancer Res. - 2002. - V. 22. - P. 3127-3134; Crowell P.L. Prevention and therapy of cancer by dietary monoterpenes // J. Nutr. - 1999. - 129. - 775-778].

Тритерпеноиды подавляют рост различных опухолевых клеток, при этом не оказывая никакого токсичного влияния на нормальные клетки [Setzer W.N., Setzer М.С. Plant-derived triterpenoids as potential antineoplastic agents // Mini Rev. Med. Chem. - 2003. - V. 3. - P. 540-556; Petronelli A., Pannitteri G., Testa U. Triterpenoids as new promising anticancer drugs // Anticancer Drugs. - 2009. - V. 20. - P. 880-892]. Многочисленные доклинические исследования предоставили обширные доказательства того, как природные и синтетические производные тритерпеноидов обладают химиопрофилактическим и терапевтическим эффектами от рака толстой кишки, рака молочной железы, рака простаты и рака кожи [Liby K.Т., Yore М.М., Sporn М.В. Triterpenoids and rexinoids as multifunctional agents for the prevention and treatment of cancer // Nat. Rev. Cancer. - 2007. - V. 7. - P. 357-369; Rabi T., Gupta S. Dietary terpenoids and prostate cancer chemoprevention // Front. Biosci. - 2008. - V. 13. - P. 3457-3469; Mullauer F.B., Kessler J.H., Medema J.P. Betulinic acid, a natural compound with potent anticancer effects // Anticancer Drugs. - 2010. - V. 21. - Р. 215-227]. Эти тритерпеноиды и их производные действуют на разных стадиях развития опухоли, тормозят процессы канцерогенеза, вызывающие дифференциацию клеток опухоли и апоптоз, и подавляют опухолевый ангиогенез, инвазию и метастазирование путем регулирования транскрипции и факторов роста, а также внутриклеточных сигнальных механизмов [Liby K.Т., Yore М.М., Sporn М.В. Triterpenoids and rexinoids as multifunctional agents for the prevention and treatment of cancer // Nat. Rev. Cancer. - 2007. - V. 7. - P. 357-369; Ovesna Z., Vachalkova A., Horvathova K., Tothova D. Pentacyclic triterpenoic acids: new chemoprotective compounds // Minireview. Neoplasma. - 2004. - V. 51. - P. 327-333]. В настоящее время тритерпеноиды проходят I/II фазы клинических испытаний для оценки их химиопрофилактических свойств, а также противоопухолевой активности [Liby K.Т., Yore М.М., Sporn М.В. Triterpenoids and rexinoids as multifunctional agents for the prevention and treatment of cancer // Nat. Rev. Cancer. - 2007. - V.7. - Р. 357-369].

В последние годы при создании противоопухолевых агентов внимание уделяется поиску ингибиторов тканевой инвазии опухолевых клеток и индукторам апоптоза опухолевых клеток [Fenteany, G.; Zhu, S. Cur. Top. Med. Chem. 2003, v. 3 (4), p. 593-616]. В качестве перспективных ингибиторов инвазии опухолевых клеток рассматриваются хинон- и гидрохинонсодержащие ди- и сестертерпеноиды морских губок - стронгулофорин-26 [Warabi K., Patrik В.О., Austin P., Roskelley C.D., Roberge M., Andersen R.J., J. Nat. Prod. 2007, v. 70 (5), p. 736-740], авинозол [Diaz-Marrero A.R., Austin P., Van Soest R., Matainaho Т., Roskelley C.D., Roberge M., Andersen R.J., Org. Lett. 2006, v. 8 (17), p. 3749-3752]. Соединения проявляют значительную цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам, а также обладают антиинвазивной активностью в тестах связывания: IC₅₀ (доза, ингибирующая инвазию опухолевых клеток на 50%) соединений составляет 1-50 мкг/мл (клетки рака груди MDA-MB-231) и 20-50 мкг/мл (клетки карциномы LS 174Т) [Diaz-Marrero A.R., Austin P., Van Soest R., Matainaho Т., Roskelley C.D., Roberge M., Andersen R.J., Org. Lett. 2006, v. 8 (17), p. 3749-3752]. Соединения (II, III) являются малодоступными метаболитами.

Аналогом по свойствам заявляемому соединению является растительный тритерпеноид бетулиновая кислота. Описаны некоторые биологические эффекты бетулиновой кислоты, включающие антивирусную, антипаразитарную, антибактериальную активности и, в частности, задержку роста опухолевых клеток [Eiznhamer D.A, Xu Z.Q. Betulinic acid: a promising anticancer candidate // I. Drugs, 2004, v. 7 (4), p. 359-373]. Противоопухолевая активность была показана на клеточной линии меланомы [Liu W.K., Но J.С., Cheung F.W., Liu В.P., Ye W.С., Che С.N. Apoptotic activity of betulinic acid derivatives on murine melanoma B16 cell line // Eur. J. Pharmacol. 2004, v. 498(1-3), p. 71-78], при головной и шейной плоскоклеточной карциноме [Eder-Czembirek С., Czembirek С., Erovic В.М. et al. Combination of betulinic acid with cisplatin-different cytotoxic effects in two head and neck cancer cell lines // Oncol. Rep. 2005, v. 14 (5), p. 667-671], лейкемии [Ehrhardt H., Fulda S., Fuhrer M., Debatin K.M., Jeremias I. Betulinic acid-induced apoptosis in leukemia cells // Leukemia. 2004, v. 18(8), p. 1406-1412] и других опухолевых клеточных линий [Yun Y., Han S., Park E., Yim D., Lee С.K. Immunomodulatory activity of betulinic acid by producing proinflammatory cytokines and activation of macrophages II Arch. Pharm. Res. 2003, v. 26(12), p. 1087-1095]. В 2000 году бетулиновая кислота была включена в программу RAID (Rapid Access to Intervention Development) Национального института рака, как потенциальный противоопухолевый агент (http://dtp.nci.nih.gov/docs/small_mol/status_small_mol.html). Препарат на основе бетулиновой кислоты проходил клинические исследования в США в качестве средства для лечения злокачественной меланомы (http://clinicaltrials.gov/show/NCT00346502).

Задачей изобретения является создание нового эффективного средства, обладающего противоопухолевым действием.

Поставленная задача решается новым химическим соединением - N-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-4-иламином структурной формулы (1)

Биологическая активность соединения (I) изучалась путем определения способности к подавлению роста опухолевых клеток: МТ-4 (лимфоциты Т-клеточной лейкемии), СЕМ-13 (клетки Т-клеточных лейкозов человека), U-937 (гистиоцитарная лимфома человека), ВТ-474 с высокой экспрессией HER-2 (рак молочной железы), MDA-MB-231 и MCF-7 с низким уровнем экспрессии HER-2 (рак молочной железы), клетки меланомы М8, клетки рака простаты DU-145.

Цитотоксическую активность устанавливали путем определения CD₅₀ - доза, ингибирующая жизнеспособность опухолевых клеток на 50%. Для определения CCID₅₀ использовали стандартный МТТ тест, как описано в рекомендациях [Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J Immunol Methods, 1983, v. 16 (1), p. 55-63; Wilson J.K., Sargent J.M., Elgie A.W., Hill J.G., Taylor C.G. A feasibility study of the MTT assay for chemosensitivity testing in ovarian malignancy // Br. J. Cancer, 1990, v. 62 (2), p. 189-194].

Результаты изучения цитотоксической активности приведены в табл. 1. Из данных таблицы 1 видно, что заявляемое соединение (1) обладает способностью подавлять рост опухолевых клеток человека. Наибольшей цитотоксической активностью обладает соединение (1) для опухолевых клеток меланомы MEL8 (1,05 мкМ) и лимфомы человека U-937 (0,52 мкМ). Цитотоксическая доза соединения (1) составляет 7,9 мкМ для клеток Т-клеточных лейкозов СЕМ и 10,1 мкМ - для клеток Т-клеточной лейкемии МТ-4. Это соединение оказалось в более чем в 20 раз активным ингибитором жизнеспособности опухолевых клеток U-937; более чем в 5 раз активным в отношении клеток меланомы MEL8; в 4-9 раз более активным в отношении клеток опухолей рака молочной железы (MCF-7, MDA-MB-231, ВТ474) и в 2,5 раза более активным ингибитором жизнеспособности опухолевых клеток МТ-4, DU-145, чем бетулиновая кислота. Механизм противоопухолевого действия соединения (1) связан с индукцией апоптоза в опухолевых клетках (таблица 2). Наиболее выражена индукция апоптоза в клетках MEL8 (до 37,6% через 2 суток наблюдения) и клетках рака молочной железы MCF-7 (79,8% на это же время).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Методика получения - N-[3-оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-4-иламином (1) приведена ниже.

Раствор 6.2 ммоль (2.82 г) бетулоновой кислоты 3 в 70 мл сухого хлористого метилена в атмосфере аргона обработали 2 экв. (1.1 мл, 12,6 ммоль) хлористого оксалила. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 6 ч, растворитель удаляли на роторном вакуумном испарителе при температуре не более 30°С. К остатку добавляли безводный хлористый метилен и операцию повторяли снова. Эту операцию повторяли 3 раза. Получали хлорангидрид, который использовали в следующей стадии. К раствору 2.12 ммоль (1 г) хлорангидрида в 60 мл сухого хлористого метилена прибавляли 4.24 ммоль амина и 8.48 ммоль (1,19 мл) перегнанного триэтиламина. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 48 ч, периодически перемешивая, затем промывали 10%-ным раствором соляной кислоты и водой, высушивали безводным MgSO₄ и упаривали. Остаток хроматографировали на окиси алюминия, используя в качестве элюента хлористый метилен, перекристаллизовывали из эфира. Соединение (1) получали в виде белого аморфного порошка, т.пл. 168-170°С. Выход 91%, [α_D²⁰] +14 (с 1.6). Масс-спектр (m/z): 592.4962 [М]+. C₃₉H₆₄N₂O₂. Вычислено: 592.4960. ИК-спектр (ν, см-1): 1661 (CONH), 1705 (С=О), 3398 (CONH). Спектр ЯМР 1Н (δ, м.д., J/Гц): 0.86 (2Н, м, Н-3', 5'), 0.89 (3Н, с, Ме-25), 0.94 (3Н, с, Ме-27), 0.95 (3Н, с, Me-26), 0.97 (1Н, м, Н-12), 0.98 (3Н, с, Ме-24), 1.03 (3Н, с, Ме-23), 1.10 (6Н, с, 2Ме), 1.13 (1H, м, Н-15), 1.24 (3Н, с, Me), 1.25 (3Н, с, Me), 1.27 (1H, м, Н-5), 1.31-1.46 (11Н, м, Н-1,6,6,7,7,9,11,11,15,21,22), 1.51 (1Н, м, Н-16), 1.55 (1Н, т, J=11.3, Н-18), 1.65 (3Н, с, Ме-30), 1.69 (2Н, м, Н-12, 22), 1.80 и 1.91 (2Н, оба м, Н-3', 5'), 1.87 (2Н, м, Н-1, 16), 1.97 (1Н, м, Н-21), 2.41 (3Н, м, Н-2, 2, 13), 3.16 (1H, тд, J1=11.2, J2=4.4, Н-19), 4.21 (1Н, м, Н-4'), 4.55 и 4.70 (2Н, оба уш.с, Н-29,29), 5.27 (1Н, д, J=7.6, CONH). Спектр ЯМР 13С (δ, м.д.): 14.44 (к, С-27), 15.81 (к, С-26), 15.83 (к, С-25), 19.39 (к, С-30), 19.49 (т, С-6), 20.87 (к, С-24), 21.28 (т, С-11), 25.49 (т, С-12), 26.46 (к, С- 23), 28.38 (к, Me), 28.44 (к, Me), 29.26 (т, С-15), 30.79 (т, С-21), 33.66 (т, С-16), 33.56 (т, С-7), 34.00 (т, С-2), 34.85 (к, 2Ме), 36.78 (с, С-10), 37.81 (д, С-13), 38.29 (т, С-22), 39.49), 46.69',5' (т, С-1), 40.61 (с, С-8), 41.89 (д, С-4'), 42.38 (с, С-14), 44.90 и 45.32 (оба т, С-3 (д, С-19)), 47.18 (с, С-4), 49.84 (д, С-9), 50.00 (д, С-18), 51.01 (с, С-2',6'), 54.86 (д, С-5), 55.31 (с, С-17), 109.21 (т, С-29), 150.79 (с, С-20), 175.16 (с, С-28), 217.99 (с, С-3).

Пример 2. Определение цитотоксичности соединения (1) в отношении различных опухолевых клеток.

Для определения 50% цитотоксической дозы для опухолевых клеток in vitro использовали стандартный МТТ тест. Клетки МТ-4, СЕМ-13 и U-937 культивировали в среде RPMI-1640 термоинактивированной (30 мин при температуре 65°С), содержащей 10% сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота, 2 ммоль/л L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина при температуре 37°С в СО₂ инкубаторе. Клетки ВТ-474, MDA-MB-231, MCF7, М8, DU-145 культивировали в среде DMEM термоинактивированной (30 мин при температуре 65°С), содержащей 10% сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота, 2 ммоль/л L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина, при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей СО₂ (в СО₂ инкубаторе). Для эксперимента использовали клетки на 3 сутки культивирования после оценки морфологии, подсчета концентрации и жизнеспособности клеток. Клетки МТ-4, СЕМ-13 и U-937 помещали в лунки 96-луночного планшета («Cel-Cult», Англия) по 100 мкл в лунку, в посевной концентрации 0,5×10⁶ клеток в мл. Исследуемое соединение (1) добавляли к клеткам, получая конечные концентрации 0,01-1000 мкМ, используя по 3 лунки на каждую концентрацию. Клетки, инкубируемые в тех же условиях без добавления исследуемого соединения (1), являлись контрольными. Клетки культивировали 72 часа. Водный раствор МТТ (5 мг/мл) профильтровывали через 0,22 мкм фильтр («Flow laboratories», Англия), добавляли в каждую исследуемую культуру в соотношении 1:10 к ее объему, смесь инкубировали 4 часа при температуре 37°С в СО₂ инкубаторе. По окончании инкубации супернатант осторожно удаляли, затем в каждую анализируемую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО. Осадок ресуспендировали и 30 мин инкубировали в темноте при комнатной температуре до полного растворения кристаллов формазана.

Оптическую плотность (OD) образцов измеряли на мультилуночном спектрофотометре BioRad 680 (США) при длине волны, равной 490 нм. Процент ингибирования роста клеток определяли по формуле 100 - (среднее значение OD в опыте/среднее значение OD в контроле) × 100. Полученное значение для контрольного триплета (первые три лунки без добавления соединений, параллельных для каждого исследуемого экспериментального агента) принималось за 100%. Рассчитывали среднее значение и ошибку среднего для каждой концентрации анализируемого соединения (1). По результатам строили диаграмму зависимости жизнеспособности клеток (%) от концентрации исследуемого цитотоксического вещества, определяли 50% цитотоксическую дозу (ЦД₅₀), а также стандартную ошибку (SE) показателя ЦД₅₀.

Соединение (1) ингибирует рост опухолевых клеток человека СЕМ, U-937 и МТ-4 в концентрациях 7,9, 0,52 и 10,1 мкМ соответственно. Цитотоксическая активность этого соединения проявляется в более низких дозах по сравнению с цитотоксичностью аналога по свойствам бетулиновой кислоты. Дозы, ингибирующие жизнеспособность опухолевых клеток на 50% для бетулиновой кислоты в этих же условиях, составляют 9,5, 13,4 и 25,5 мкМ.

Соединение (1) проявляет свой цитотоксический эффект в отношении клеток рака молочной железы в концентрациях 6,9, 5,4 и 6,4 мкМ для клеток MCF-7, MDA-MB-231, ВТ474 соответственно. Препарат сравнения - бетулиновая кислота ингибирует рост этих опухолевых клеток в концентрациях 66,4, 22,8 и 24,2 мкМ.

Таким образом, соединение (1) более активно в отношении клеток рака молочной железы в 9,6, 4,2 и 3,8 раза по сравнению с бетулиновой кислотой.

Наибольшую цитотоксическую активность соединение (1) проявляет в отношении клеток меланомы - 1,05 мкМ, что более чем в 5 раз лучше по сравнению с бетулиновой кислотой. Также заявляемое соединение(1) более активно по сравнению с бетулиновой кислотой в отношении клеток рака простаты 10,6 мкМ и 25,6 мкМ, соответственно.

Пример 3. Анализ апоптоза методом проточной цитометрии.

Для выявления апоптотических клеток использовали метод проточной цитометрии. Клетки после инкубации с соединением (1) в течение 48, 72 часов в конечной концентрации от 2 до 9 мкг/мл, отмывали PBS (x1) и фиксировали в 70% этаноле. Для этого, поддерживая температуру суспензии 4°С, к 100 мкл клеточной суспензии в PBS (x1) добавляли 900 мкл готового 70% раствора этанола при постоянном перемешивании, выдерживали клетки в суспензии 10 мин при -20°С, затем отмывали PBS (x1) и в течение 30 минут инкубировали при температуре 37°С в гипотоническом растворе пропидия йодида (50 мкг/мл), содержащем 0,1% натрия цитрата, 0,1% тритона Х-100 и РНКазу (150 ед. ак./мл). Клетки, инкубируемые без соединения (1) при тех же условиях, использовали в качестве контроля. Измерения проводили по второму каналу флуоресценции (FL-2) при длине волны 488 нм на проточном цитометре FACSCalibur («Becton Dickinson», США). Далее из полученных ДНК-гистограмм рассчитывали апоптотический индекс (%). Полученные данные приведены в таблице 2.

Представленные данные показывают, что механизм противоопухолевой активности соединения (1) различается для разных клеток. Наиболее выражена индукция апоптоза в клетках MEL8 (до 37,6% через 2 суток наблюдения) и клетках рака молочной железы MCF-7 (79,8% на это же время), в то время как для клеточных линий U-937 и MDA-MB-231 процент апоптотических клеток составляет 1-6%.