Новое водорастворимое производное салициламида, обладающее нейропротекторным действием при недостаточности мозгового кровообращения

Изобретение относится к области медицины и органической химии и касается нового биологически активного химического соединения, а именно дикалиевой соли 4-[(4'-салицилоиламино)бутаноиламино]бутановой кислоты формулы

проявляющего нейропротекторную активность при недостаточности мозгового кровообращения. Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.

Фармакологическая регуляция мозгового кровообращения относится к числу важнейших проблем медицины. Это определяется тем, что острые и хронические нарушения кровоснабжения мозга являются одной из главных причин смертности и инвалидизации населения. Патология мозгового кровообращения может быть связана с функциональными и органическими нарушениями (спазм сосудов, эмболии, тромбоз, атеросклероз сосудов, геморрагии). При этом страдают память, интеллектуальная и психическая сферы, поведенческие и моторные реакции. Эти неблагоприятные проявления нарастают постепенно и обычно связаны с возрастом и сопутствующими ему патологическими процессами (атеросклерозом сосудов, артериальной гипертензией, нарушением метаболизма и т.д.). Это обуславливает актуальность и востребованность разработок веществ, имеющих нейропротекторную активность при недостаточном мозговом кровообращении.

Наиболее близким по строению и свойствам к описываемому соединению является 4-[(4'-никотиниламино)бутироиламино]бутановая кислота (РФ 2436772). Однако данное соединение и его ноотропная активность была исследована с использованием методики условной реакции пассивного избегания (УРПИ) с последующим применением в качестве амнезирующего фактора электрошока. В эксперименте использовались неоперированные животные, а значит не изучалось действие 4-[(4'-никотиниламино)бутироиламино]бутановой кислоты в условиях недостаточности мозгового кровообращения.

Сущность изобретения состоит в синтезе нового водорастворимого соединения, а именно дикалиевой соли 4-[(4'-салицилоиламино)бутаноиламино]бутановой кислоты, которое проявляет нейропротекторную активность при недостаточности мозгового кровообращения, вызванного в эксперименте необратимой двусторонней окклюзией общих сонных артерий у животных.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез 4-[(2-гидроксибензоил)амино]бутановой кислоты может быть осуществлен по методике, описанной в RU 2495866.

Пример 2. Синтез 4-(салицилоиламино)бутирил хлорида. К 20 ммоль 4-(слицилоиламино)бутановой кислоты в 50 мл безводного бензола прибавляют 60 ммоль оксалил хлорида и 0.2 мл N,N-диметилформамида. Смесь кипятят в течение 1 часа. Выпавший после охлаждения смеси до комнатной температуры осадок хлорангидрида отфильтровывают, промывают холодным гексаном и высушивают. Целевой 4-(салицилоиламино)бутирил хлорид выделяют в виде белого кристаллического твердого вещества (4.35 г, 90%) с т.пл. 55-56°С. Содержание активного хлора: вычислено, %: Cl 14.67; найдено, %: 14.67.

Пример 3. Синтез дикалиевой соли 4-[(4'-салицилоиламино)бутаноиламино]бутановой кислоты. В реакторе, снабженном мешалкой, смешивают 20 мл воды, 10 ммоль гамма-аминомасляной кислоты и 25 ммоль NaOH. Затем при перемешивании и охлаждении присыпают 10 ммоль 4-(салицилоиламино)бутаноил хлорида, контролирую рН среды (рН>7). Смесь перемешивают еще 3 часа, подкисляют НСl и образовавшийся осадок отфильтровывают. После перекристаллизации из этанола получают 4-[(4'-салицилоиламино)бутаноиламино]бутановой кислоты в виде белого кристаллического вещества (2.34 г, 76%) с т. пл. 256-258°С. R_f 0.35 (хлороформ-этилацетат 1:2). 4-[(4'-салицилоиламино)бутаноиламино]бутановая кислота: Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d₆), δ, м.д.: 9.84 с (1Н, -ОН), 8.35 с (1Н, -СООН), 7.62д (1Н, Ph), 7.25 с (1Н, -NH-), 7.35-7.27 м (2Н, Ph, J 6.3 Гц), 6.93д (1H Ph), 4.69 с (1Н, -NH-), 3.32-3.16 м (4Н, 2-СН₂-, J 12.7 Гц), 2.32-2.13 м (4Н, 2-СН₂-, J 9.6 Гц). 1.89-1.68 м (4Н, 2-СН₂-, J 7.8 Гц). Элементный анализ C₁₅H₂₀N₂O₅: вычислено, %: С 58.43, Н 6.54, N 9.09, О 25.95; найдено, %: С 58.40, Н 6.53, N 9.1, О 25.98.

Затем в реакторе смешивают 10 ммоль 4-[(4'-салицилоиламино)бутаноиламино]бутановой кислоты, 20 ммоль этилат калия и 50 мл бензола, перемешивают при кипении в течение 30 мин. После охлаждения продукт отделяют фильтрованием, промывают небольшим количеством бензола и сушат. Выход 97%. Т пл.=302°С с разложением. C₁₅H₁₈K₂N₂O₅: вычислено, %: С 46.85, Н 4.72, К 20.34, N 7.29; найдено, %: С 46.82, Н 4.73, К 20.31, N7.30.

Пример 4. Нейропротекторное действие вещества при недостаточности мозгового кровообращения, вызванного необратимой двусторонней окклюзией общих сонных артерий у крыс

Исследование выполнено на половозрелых беспородных крысах-самках 180-200 г., 3,5-4-месячного возраста, доставленных из питомника ФГУП ПЛЖ «Рапполово» (д. Рапполово, Ленинградская область). Все животные после транспортировки из питомника содержались в стандартных условиях вивария с 12 ч/12 ч свето/темновым циклом, температурой воздуха 20±2°С и влажностью 40-60% и проходили двухнедельный карантин, по окончании которого включались в исследование.

В ходе выполнения экспериментов были сформированы следующие группы: 1) ЛО (ложнооперированные) - животные, получавшие физиологический раствор, а при проведении операции которым под общие сонные артерии подводились, но не затягивались лигатуры; 2) контроль - животные, получавшие физиологический раствор и которым недостаточность мозгового кровообращения вызывали путем одномоментной двусторонней окклюзии общих сонных артерий (ОСА); 3) патентуемое соединение - животные, которым также перевязывали ОСА, но получавшие изучаемое соединение дозе 38 мг/кг внутрибрюшинно (профилактически однократно за 30 минут до перевязки и далее начиная с третьего дня после операции каждые 24 часа в течение 3х дней; 4) пирацетам - животные, которым перевязывали ОСА, но получавшие пирацетам в дозе 800 мг/кг внутрибрюшинно (в том же режиме, что и патентуемое соединение). Операционные вмешательства выполнялись с использованием хлоралгидрата (в дозе 400 мг/кг). Для оценки нейропротекторного действия патентуемого соединения при недостаточности мозгового кровообращения использовалась модель одномоментной необратимой билатеральной окклюзии ОСА [Мирзоян Р.С. Методические рекомендации по доклиническому изучению лекарственных средств для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени //Руководство по доклиническому изучению лекарственных средств / Под. ред. А.Н. Миронова. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. О нейропротекторном действии соединения судили по увеличению выживаемости животных после двусторонней ОСА и уменьшению у них выраженности неврологического дефицита по шкале McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной, когнитивных нарушений в тестах «Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) и «Экстраполяционного избавления» (ТЭИ).

Тест УРПИ проводили в 3 этапа: «обучение», «воспроизведение №1» (для проверки запоминания) и «воспроизведение №2» после моделирования недостаточности мозгового кровообращения у крыс. На этапе «обучения» животное помещали в светлый отсек установки, из которого оно самостоятельно переходило в темный отсек с электродным полом, где получало болевое раздражение (U=40B, 3 импульса по 0,5 сек). При повторном заходе в темный отсек животное также получало болевое раздражение. Длительность наблюдения - 3 минуты. Спустя 24 часа на этапе «воспроизведения №1» животное опять помещали в светлый отсек установки, и наблюдали за ним в течение 3-х минут. Крысы, зашедшие в темный отсек на этапе «воспроизведения №1», исключались из эксперимента. Через 72 часа (после окклюзии ОСА) после моделирования недостаточности мозгового кровообращения проводили «воспроизведение №2». Фиксировался латентный период первого захода в темный отсек, при этом болевое раздражение не наносилось.

Установка для ТЭИ представляет собой цилиндрическую емкость (высота 40 см, диаметр 35 см), в которую до определенного уровня наливается вода (t=22°C). В центре емкости вертикально закреплен цилиндр, нижняя часть которого опущена в воду на 2,5 см. На этапе «обучения» животное помещается хвостом вниз во внутренний цилиндр и в течение 3-х минут оно должно решить задачу: поднырнуть под край цилиндра, после чего животное извлекается. Спустя 24 часа при первом воспроизведении исключаются животные, которые не смогли в течение 3-х минут решить «экстраполяционную задачу». «Воспроизведение №2» выполняется аналогично таковому в тесте УРПИ, через 72 часа (после окклюзии ОСА) после моделирования недостаточности мозгового кровообращения. В тесте ТЭИ фиксируется время решения задачи: латентный период подныривания.

Необратимая окклюзия ОСА вызывала выраженное нарушение мозгового кровообращения, которое приводило к гибели животных. Исследования показали, что патентуемое соединение - дикалиевая соль 4-[(4'-салицилоиламино)бутаноиламино]бутановой кислоты - достоверно повышало (в среднем на 20-50%) выживаемость крыс после перевязки ОСА по сравнению с группой контроля (контроль-ишемия) (таблица 1), при этом случаи смерти среди животных данной группы наблюдались только в период с 6 до 12 ч. Оказываемое им нейропротекторное действие превосходило таковое у пирацетама.

При оценке неврологического дефицита по шкале МсСrаw отмечено, что у животных с перевязанными ОСА, получавшими патентуемое соединение, неврологической дефицит был наименьшим среди всех исследуемых групп (таблица 2).

При выполнении и анализе результатов тестов УРПИ и ТЭИ отмечено, что выжившим животным с ОСА, получавшим патентуемое соединение, в тесте ТЭИ требовалось меньшее время для решения задачи экстраполяционного избавления, а в тесте УРПИ в темную камеру заходило 75% животных (в группе контроль 25%), что свидетельствует о сохранении памятного следа, связанного с аверсивным воздействием (таблица 2).

Таким образом, учитывая, что дикалиевая соль 4-[(4'-салицилоиламино)бутаноиламино]бутановой кислоты увеличивает выживаемость животных и снижает выраженность неврологических нарушений, в том числе когнитивного дефицита, после окклюзии общих сонных артерий, заявленное соединение может найти применение при создании новых лекарственных средств для лечения нарушений мозгового кровообращения ишемического генеза.