Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики тяжести преэклампсии на основании оценки экспрессии ДНК - распознающих рецепторов DAI-1 в ткани плаценты

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, связано с разработкой способа морфологической диагностики преэклампсии путем иммуногистохимического исследования плаценты, в том числе у пациенток со сложностью оценки тяжести преэклампсии и недостаточными клинико-лабораторными данными.

Преэклампсия (ПЭ) - это мультисистемное патологическое состояние, развивающееся при беременности, клинические признаки которого манифестируют после 20-й недели гестации, частота распространения достигает 2-8% [Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia // Semin Perinatol. 2009. Vol. 33(3). P. 130-137].

К настоящему времени известны способы диагностики преэклампсии. Предложен способ диагностики преэклампсии у беременной с хронической артериальной гипертензией в сроки 24-40 недель беременности (RU 2483311 Макаров О.В. и др. 27.05.13), при котором с помощью твердофазного иммуноферментного анализа сыворотки крови определяют содержание аутоантител класса IgG к двуспиральной ДНК, антигенам мембран тромбоцитов ТrМ-001-15 и ТrМ-015-12, антигенам почечной ткани KiM-05-300 и KiS-07-120 и антигену митохондрий печени НММР. Далее, для каждого вида исследованных антител определяют соотношение аутоантител в опытной сыворотке к контрольной сыворотке. Однако недостатком данного метода является его трудоемкость и необходимость определения большого спектра антител. Зарегистрирован также способ диагностики преэклампсии (RU 2408259 С2, Абрамова и др., 10.01.2011) по сердечно-сосудистистым параметрам. Если при увеличении срока беременности скорость распространения пульсовой волны снижается, диагностируют физиологическое развитие беременности, а при отсутствии снижения или при нарастании скорости прогнозируют развитие преэклампсии. Недостатком указанного способа является необходимость наблюдения пациенток в течение длительного периода. В случаях, когда существует необходимость быстрой и достоверной верификации заболевания, данный способ не может быть применим.

Наряду с этим, известен способ морфологической диагностики преэклампсии путем иммуногистохимического выявления повышенного уровня активности ингибитора активатора плазминогена (plasminogen activator inhibitor -1, PAI-1) в структурах плаценты [Estelles A., Gilabert J., Keeton M., Eguchi Y., Aznar J., Grancha S., Espna F., Loskutoff D.J., Schleef R.R. Altered expression of plasminogen activator inhibitor type 1 in placentas from pregnant women with preeclampsia and/or intrauterine fetal growth retardation. // Blood. 1994. Vol. 84. Р. 143-150]. Однако при наличии у пациенток мутации генов тромбофилии и склонностью к тромбообразованию этот метод может не работать.

Другим способом морфологической диагностики преэклампсии является иммуногистохимическое выявление и определение соотношений фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и его трех рецепторов (VEGFR1, VEGF-R2, VEGF-R3) [Tripathi R., Rath G., Jain A., Salhan S. Soluble and membranous vascular endothelial growth factor receptor-1 in pregnancies complicated by preeclampsia. // Ann. Anat. 2008. Vol. 190. P. 477-489; Tripathi R., Rath G., Ralhan R., Saxena S., Salhan S. Soluble and membranous vascular endothelial growth factor receptor-2 in pregnancies complicated by preeclampsia. // Yonsei Med. J. 2009. Vol. 50. Р. 656-666]. Однако недостатком данного способа является низкая степень их достоверности из-за отсутствия прямой связи - с процессами, происходящими только при беременности, такими как образование плаценты.

Также известно несколько способов диагностики тяжести преэклампсии. К ним относятся способ оценки тяжести преэклампсии с помощью изучения содержания тромбоцитов в венозной крови, когда по уровню тромбоцитопении судят о степени тяжести преэклампсии (Преэклампсия: руководство. / Под ред. акад. РАМН Г.Т. Сухих, проф. Л.Е. Мурашко. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. С. 226-228). Недостатком данного способа является низкая степень его достоверности из-за наличия многочисленных механизмов тромбоцитопении (в т.ч. аутоимунного механизма, связанного с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови, анемией, изменением объема циркулирующей крови и другими), в том числе и не характерных для беременности, а также отсутствием четкой зависимости между степенью тяжести преэклампсии и выраженностью тромбоцитопении). Описан способ (RU 2478966 С1, Редьков О.В и др. 10.04.13) оценки степени тяжести преэклампсии, который включает анализ плазмы периферической венозной крови беременных, вынашивающих плод мужского пола, после 20 недель беременности определяют концентрацию плодной ДНК и при концентрации плодного генетического материала от 1,8 до 2,6 нг/мл прогнозируют преэклампсию средней степени тяжести и при концентрации 2,6 нг/мл и выше - преэклампсию тяжелой степени. Хотя данный способ очень точен, однако, не применим если женщина вынашивает девочку.

Известен иммуногистохимический способ диагностики гестоза (тяжелой преэклампсии) (RU 2407008 С1, Сарыева и др., 20.12.2010), при котором посредством морфологического и иммуногистохимического исследования базальной децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона плаценты определяют индекс экспрессии маркеров апоптоза р53 и bcl-2 и по ним проводят определение тяжести преэклампсии. Несмотря на это, высокий индекс клеток, подвергнутых апоптозу, часто связан с расстройством кровообращения, наличием множественных инфарктов, развитием плацентарной недостаточности, что не связано с преэклампсией.

Описан также способ (RU 2487657 С1, Кулаков и др., 10.11.2012, 01.03.2012), при котором проводят морфометрию терминальных ворсин плаценты. Определяют общую площадь капилляров и площадь синцитиотрофобласта терминальных ворсин и рассчитывают отношение полученных значений площадей капилляров и синцитиотрофобласта. Однако данный метод может быть ориентировочным и разветвленный тип ангиогенеза ворсин плаценты может встречаться при наличии гипоксии плаценты различного генеза.

DAI-1 рецепторы (от англ. DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors - ДНК связанный активатор интерферон-регулирующих факторов; цитоплазматические ДНК распознающие рецепторы [Biological DNA Sensor. The Impact of Nucleic Acids on Diseases and Vaccinology // 1 st Edition Editors by Ishii K., Tang C.K. 2013, 368 p. eBook ISBN 9780124051683; Takaoka A, Wang Z, Choi MK, Yanai H, Negishi H, Ban T, Lu Y, Miyagishi M, Kodama T, Honda K, Ohba Y, Taniguchi T. DAI (DLM-1/ZBP1) is a cytosolic DNA sensor and an activator of innate immune response // Nature. 2007. Vol. 26. N448. Pt. 7152. Р. 501-505].

Известно, что уровень свободной ДНК (как материнской, так и фетальной) повышается при преэклампсии [Ge Q., Не Y., Qiao D. Ren М., Zhang J. Quantification of Maternal Serum Cell-Free Fetal DNA in Early-Onset Preeclampsia // Int J Mol Sci. 2013; 14(4): 7571-7582;], фрагменты ДНК являются их лигандами, поэтому активность DAI-1 меняется.

Целью изобретения является повышение объективности диагностики преэклампсии, определение степени тяжести заболевания, улучшение перинатальных исходов.

Способ осуществляют следующим образом

Полученные парафиновые гистологические препараты толщиной 3 мкм из парацентральной части плаценты подвергают депарафинизации общепринятым методом путем последовательной обработки срезов, включающей 3 смены ксилола (по 10 минут), 3 смены 96° этилового спирта (по 10 минут), 80° этилового спирта (по 5 минут), 50° этилового спирта (5 минут), 2 смены дистиллированной воды (по 3 минуты). После процедуры депарафинизации и гидратации образцы проходили процедуру демаскировки антигена с Target Retrieval Solution 10х (Dako, Дания) в микроволновой печи при мощности 600°С. После этого стекла помещали в буфер на 20 мин при комнатной температуре для охлаждения. Эндогенную пероксидазную активность блокируют путем инкубации срезов в течение 5 минут с реагентом 3% Н₂О₂. Отмывание срезов производят трижды фосфатно-солевым буферным раствором (PBS рН=7,6) по 5 минут в каждом. После этого срезы инкубируют с первичными антителами к DAI-1 (1:1000; Thermo Fisher Scientific; USA) в течение 30 минут при комнатной температуре. Отмывание срезов производят трижды фосфатно-солевым буферным раствором (PBS рН=7,6) по 5 минут в каждом. Далее используют систему визуализации En Vision (Dako REAL En VisionTM Detection System, Дания) в течение 30 минут. Промывают трижды фосфатно-солевым буферным раствором. Процедуру окрашивания завершают 3-минутной инкубацией со смесью DAB+ с субстратом. В результате чего участки, где находится антиген, окрашиваются в коричневый цвет. Для улучшения визуализации структурных элементов плаценты срезы докрашивают водным раствором гематоксилина Майера в течение 5 секунд. После этого споласкивают срезы дистиллированной водой, затем проводят обезвоживание: 50° этиловый спирт (3 минуты), 80° этиловый спирт (3 минуты), 2 смены 96° этилового спирта (3 минуты), с последующей сменой 3-х ксилолов (по 3 минуты); и заключают препараты в синтетическую смолу (затем на препарат капали синтетическую смолу и накрывают покровным стеклом).

Негативным контролем являются срезы ткани плаценты, окрашенные по той же методике, но без инкубации с антителами. Позитивные контроли ставятся в соответствии со спецификацией производителя.

Продукты реакции визуализировались в виде коричневого окрашивания. Интенсивность окрашивания продукта реакции в структурных элементах ворсин в синцитиотрофобласте плаценты определяли по уровню оптической плотности.

На основании полученных данных препаратов при проведении измерения по 3 точкам измерений оптической плотности цитоплазмы синцитиотрофобласта промежуточных ворсин плаценты, нами выявлено, что в образцах плаценты при тяжелой преэклампсии в связи с выраженными дистрофическими изменениями, повреждением и слущиванием синцитиотрофобласта Hofmann-Kiefer K.F., Chappell D., Knabl J., Frank H.G., Martinoff N., Conzen P., Becker B.F., Rehm M. Placental syncytiotrophoblast maintains a specific type of glycocalyx at the fetomaternal border: the glycocalyx at the fetomaternal interface in healthy women and patients with HELLP syndrome// Reprod Sci. 2013. Vol. 20. №.10. P. 1237-45], уровень оптической плотности в цитоплазме синцитиотрофобласта DAI-1 была ниже 0,15 у.е. Учитывая, что повреждение синцитиотрофобласта, поддерживающих нормальное течение беременности, является ведущим в генезе преэклампсии, то сохранение и повышение экспрессии DAI-1 в цитоплазме синцитиотрофобласте характерно для более мягкого (умеренного) течения преэклампсии, а снижение - для тяжелой рис. 1а-в). Следует отметить, что экспрессия паттерн-распознающих рецепторов DAI-1 описана нами в структурах плаценты впервые. Чувствительность предлагаемого метода - 83%, специфичность - 66%.

Примеры

Пример 1. Пациентка Т., 35 лет, была родоразрешена на 38 неделе гестации. Из плаценты был вырезан кусочек размером 2×2×0,5 см, из которого по стандартной методике готовят гистологические срезы. Полученные срезы после общепринятой методики депарафинизациии подвергают процедуре иммуногистохимии с инкубацией с первичными антителами DAI-1, согласно описанной методике.

На готовых препаратах проводят определение уровня оптической плотности, средний уровень оптической плотности DAI-1 в цитоплазме синцитиотрофобласта соответствовал 0,08 ед., что свидетельствовало о тяжелой преэклампсии. При последующем получении данных клинико-лабораторного исследований и анализа истории родов установлено наличие признаков повышения артериального давления выше 160/100 мм рт.ст. и повышенного содержания белка в суточной моче выше 1 г/сут, на основании чего сделано клиническое заключение о развитии у беременной тяжелой преэклампсии.

Пример 2. Пациентка С., 33 лет, в связи с появлением эпизодов повышенного артериального давления и подозрением на развитие преэклампсии поступила для наблюдения и последующего родоразрешения. После операции кесарева сечения из плаценты вырезали кусочек размером 2×2×0,5 см, из которого по стандартной методике готовят парафиновые гистологические препараты. Полученные срезы после общепринятой методики депарафинизации с последующим иммуногистохимическим окрашиванием с применением первичных антител к DAI-1. На готовых препаратах проводили определение уровня оптической плотности, средний уровень экспрессии в цитоплазме синцитиотрофобласта DAI-1 у данной пациентки соответствовал 0,2 у.е., что свидетельствовало об отсутствии тяжелой преэклампсии. При анализе результатов клинического течения и лабораторных показателей мочи в истории родов сделано заключение об отсутствии тяжелой преэклампсии.

Пример 3. Пациентка Б., 38 лет на сроке 34 недель поступила с артериальным давлением 150/100 мм рт.ст., белком в моче 0,9 г в сутки. Была госпитализирована и находилась на стационарном лечении 2 недели. В связи с нарастанием тяжести преэклампсии была подвергнута оперативному родоразрешению. Из плаценты вырезан кусочек размером 2×2×0,5 см, из которого по стандартной методике готовят парафиновые гистологические препараты, а после методики депарафинизации подвергли процедуре иммуногистохимии, согласно описанной методике. После постановки иммуногистохимической реакции с первичными антителами к DAI-1 и анализа уровня оптической плотности, нами было выявлено, что средний уровень экспрессии DAI-1 в цитоплазме синцитиотрофобласта равен 0,35 ед, что свидетельствует об отсутствии тяжелой преэклампсии, что в дальнейшем было подтверждено данными истории болезни (у пациентки была выявлена умеренная преэклампсия). Сохранение окрашивания в синцитиотрофобласте является положительным прогностическим критерием для оценки тяжести преэклампсии.

Учитывая, что преэклампсия – заболевание, неограниченное рамками гестационного периода, поэтому установление тяжести преэклампсии важно для последующего лечения женщин (Клинические рекомендации РФ (протоколы лечения): Гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и в послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия. 2016). Предлагаемый способ позволяет улучшить результаты постановки диагноза, а следовательно, и лечения данного контингента больных.

Диагностические возможности предлагаемого способа были проверены при сопоставлении результатов морфологического исследования материала плаценты и данных клинико-лабораторных обследований 47 беременных, находившихся на лечении в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова. У 14 из них была диагностирована тяжелая преэклампсия, у 33 - умеренная преэклампсия и артериальная гипертензия.

Подписи к рисункам

Иммуногистохимическое окрашивание ворсин плаценты DAI-1 при артериальной гипертензии и при преэклампсии, ×400.

Фиг. А - Иммуногистохимическое окрашивание DAI-1 в ворсинах плаценты, при артериальной гипертензии.

Фиг. Б - Иммуногистохимическое окрашивание DAI-1 в ворсинах плаценты, при умеренной преэклампсии.

Фиг. В - Иммуногистохимическое окрашивание DAI-1 в ворсинах плаценты, при тяжелой преэклампсии.

Список литературы:

- Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia // Semin Perinatol. 2009. Vol 33(3). P. 130-137.

- Estelles A., Gilabert J., Keeton M., Eguchi Y., Aznar J., Grancha S., Espna F., Loskutoff D.J., Schleef R.R. Altered expression of plasminogen activator inhibitor type 1 in placentas from pregnant women with preeclampsia and/or intrauterine fetal growth retardation // Blood. 1994. Vol. 84. P. 143-150.

- Tripathi R., Rath G., Jain A., Salhan S. Soluble and membranous vascular endothelial growth factor receptor-1 in pregnancies complicated by preeclampsia//Ann. Anat. 2008. Vol. 190. P. 477-489;

- Tripathi R., Rath G., Ralhan R., Saxena S., Salhan S. Soluble and membranous vascular endothelial growth factor receptor-2 in pregnancies complicated by preeclampsia // Yonsei Med. J. 2009. Vol. 50. P. 656-666.

- Преэклампсия: руководство / Под ред. акад. РАМН Г.Т. Сухих, проф. Л.Е. Мурашко. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. С. 226-228.

- Ge Q., Не Y., Qiao D. Ren М., Zhang J. Quantification of Maternal Serum Cell-Free Fetal DNA in Early-Onset Preeclampsia // Int J Mol Sci. 2013; 14(4): 7571-7582

- Biological DNA Sensor. The Impact of Nucleic Acids on Diseases and Vaccinology // 1st Edition Editors by Ishii K., Tang C.K. 2013, 368 p. eBook ISBN 9780124051683.

- Takaoka A, Wang Z, Choi MK, Yanai H, Negishi H, Ban T, Lu Y, Miyagishi M, Kodama T, Honda K, Ohba Y, Taniguchi T. DAI (DLM-1/ZBP1) is a cytosolic DNA sensor and an activator of innate immune response //Nature. 2007. Vol. 26. N448. Pt. 7152. P. 501-505.

- Hofmann-Kiefer K.F., Chappell D., Knabl J., Frank H.G., Martinoff N., Conzen P., Becker B.F., Rehm M. Placental syncytiotrophoblast maintains a specific type of glycocalyx at the fetomaternal border: the glycocalyx at the fetomaternal interface in healthy women and patients with HELLP syndrome // Reprod Sci. 2013. Vol. 20. №.10. P. 1237-45.

- Клинические рекомендации РФ (протоколы лечения): Гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и в послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия. 2016