Результат интеллектуальной деятельности: Способ дифференциальной экспресс-диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота

Изобретение относится к ветеринарии, эпизоотологии, а именно к способам дифференциальной экспресс-диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота.

Принципиально важной является возможность не только выявить максимальное число бруцеллоносителей, спровоцированных вакцинацией, но и оценить степень их эпизоотической опасности, не допустив сдачу на убой животных с реакциями вакцинного происхождения (Косилов И.А., Аракелян П.К., Димов С.К., Хлыстунов А.Г. Бруцеллез сельскохозяйственных животных / под ред. И.А. Косилова. - Новосибирск, 1999. - 344 с.).

В настоящее время имеется ряд способов, направленных на дифференциальную диагностику бруцеллеза. Так, в нашей стране до настоящего времени реакция агглютинации (РА) и реакция связывания комплемента (РСК) с единым бруцеллезным диагностикумом, изготовленным из типичных бруцелл в S-форме, являются обязательным диагностическим комплексом при бруцеллезе животных (Наставление по диагностике бруцеллеза животных/ утверждено Минсельхозом РФ 29.09.2003 №13-5-02/0850), вполне приемлемым при условии использования в сроки, когда нет препятствий в виде поствакцинальных реакций (Косилов И.А., Аракелян П.К., Димов С.К., Хлыстунов А.Г. Бруцеллез сельскохозяйственных животных / под ред. И.А. Косилова. - Новосибирск, 1999. - 344 с.).

Однако, комплекс РА+РСК в ранние сроки после вакцинации, когда провоцирующие свойства вакцин, как аггллютиногенных, так и слабоагглютиногенных, проявляются наиболее ярко, оказались не способными объективно выявлять бруцеллоносителей, оценивать и прогнозировать степень эпизоотической опасности животных по бруцеллезу и уровень активности бруцеллезной инфекции в целом по стаду

Такой дифференциально-диагностической способностью даже в ранние сроки после вакцинации обладают О-ПС антигены (О-цепь полисохаридов) при исследовании сывороток крови животных в реакции иммунодиффузии(РИД) в агаровом геле. В частности, из бруцелл вида abortus был получен высокоочищенный О-ПС антиген. Принципиальный механизм его дифференцирующих возможностей заключается в том что у животных при их заражении вирулентными штаммами бруцелл синтез специфических преципитирующих антител (выявляемых в РИД) происходит, а при сенсибилизации слабовирулентными штаммами (включая вакцинные) - нет (Чекишев В.М., Колганова О.А. Средства и методы дифференциальной поствакцинальной серологической диагностики бруцеллеза животных / монография - Новосибирск, 2010. - 130 с.). Указанный антиген был внедрен в широкую ветеринарную практику в составе тест - системы (Наставление по диагностике бруцеллеза животных/ утверждено Минсельхозом РФ 29.09.2003 №13-5-02/0850).

Однако РИД с О-ПС антигеном не обладает свойствами способа экспресс-диагностики, так как на ее постановку и учет уходит 2 суток. Кроме того, она имеет такие существенные недостатки, как большая трудоемкость, субъективная оценка результатов диагностики, невозможность стандартизации проведения диагностики.

Наиболее близким к заявляемому способом (прототипом), является способ, основанный на использовании ИФА.

ИФА является наиболее современным и эффективным из известных способов экспресс-диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота. В частности, была разработана новая скрининговая тест-система ИФА. Ее использование возможно даже у животных, иммунизированных против бруцеллеза В случае выявления животных с положительными и сомнительными результатами ИФА необходимо прибегать к РА и РСК, а также дополнительным дифференциальным методам (Димова А.С., Димов С.К., Сизов А.А., Сизов Д.А., Аракелян П.К. Эффективность диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в новой тест-системе ИФА. - ж. Ветеринария, 2015. №8. С. 18-20).

Недостатком данного способа является то, что он в известных вариантах не может быть использован в дифференциальной поствакцинальной диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного живыми противобруцеллезными вакцинами.

Задачей заявляемого решения является расширение арсенала экспресс-методов диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, способных осуществлять дифференциацию реакций вакцинного и инфекционного происхождения и оценивать степень эпизоотической опасности реагирующих животных.

Поставленная техническая задача решается тем, что в способе дифференциальной экспресс-диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, включающем исследование сывороток животных в иммуноферментном анализе с использованием специфического антигена из типичных бруцелл вида abortus, ОПС-антигена и конъюгата на основе рекомбинантного белка G, согласно изобретению, исследование сывороток проводят параллельно непрямым и конкурентным методами иммуноферментного анализа с использованием ОПС-антигена в качестве конкурирующего агента, а интерпретацию результатов проводят по формуле

где

D1 - оптическая плотность, измеряемая в лунке, содержащей ОП-С антиген (конкурентный иммуноферментный анализ);

D2 - оптическая плотность, измеряемая в лунке, не содержащей ОП-С антиген (непрямой иммуноферментный анализ);

Кэо - коэффициент, определяющий степень эпизоотической опасности по бруцеллезу животного, от которого получен исследованный образец сыворотки крови, и имеющий две градации:

0≤К≤60 - отсутствие у животного эпизоотической опасности по бруцеллезу;

61≤К≤100 и выше - наличие у животного высокой эпизоотической опасности по бруцеллезу.

Способ осуществляют следующим образом:

1.1. Получение и использование антигенов

В качестве антигена, сорбированного на поверхность полистирольных планшет, применяется препарат, изготовленный только из типичных бруцелл (суточная культура штамма В. abortus 19, находящегося в стабильной S-форме), полученный следующим образом.

Жидкую суточную культуру В. abortus 19 разливают по 1 мл в пробирки типа «Эппендорф», центрифугируют в течение 15 минут при 5 тыс. об./мин. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,15 М растворе хлористого натрия (NaCl), добавляя по 1 мл в каждую пробирку с осадком. Пробирки помещают в водяную баню при 85 градусах С и инкубируют в течение 15 минут, после чего охлаждают в ледяной бане в течение 5 минут. Охлажденные пробирки центрифугируют в течение 15 минут при 15 тыс. об./мин. Супернатант, содержащий антигены, сливают в стеклянный стакан, перемешивают, определяют концентрацию белка. Для сорбции используют раствор антигена с концентрацией белка 10 мкг/мл, для чего требуемое количество раствора антигена растворяют в необходимом количестве карбонатно-бикарбонатного буфера.

1.2 В качестве антигена для конкурентного анализа применяют ОПС-антиген, входящий в официально утвержденную и выпускаемую НПЦ «ВетБиоТест» тест-систему для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота и северных оленей в РИД».

2. Использование конъюгата

Для обеспечения возможности универсального использования при исследовании сывороток крови различных видов животных применяется конъюгат на основе существующего рекомбинантного белка G, позволяющий без потери чувствительности и специфичности тестировать сыворотки крови крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, свиней, верблюдов, кроликов, в отличие от используемого в ближайшем прототипе конъюгата на основе моноклональных антител против иммуноглобулинов конкретно одного вида животных.

Для этого при приготовлении такого конъюгата используют метод периодатного окисления.

Коммерческий препарат пероксидазы хрена (POD) смешивают с раствором периодата натрия, инкубируют в течение 20 минут, после чего белок осаждают насыщенным раствором сульфата аммония. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в карбонатно-бикарбонатном буфере. К образовавшемуся раствору активированной пероксидазы добавляют коммерческий препарат рекомбинантного белка G, инкубируют при температуре 37 градусов С.

Синтезированный конъюгат осаждают насыщенным раствором сульфата аммония, отделяют центрифугированием, растворяют в буфере, определяют рабочий титр, после чего используют в иммуноферментной диагностике бруцеллеза.

3. Постановка ИФА:

в способе дифференциальной экспресс-диагностики бруцеллеза животных используется метод парного исследования сывороток, при котором каждая сыворотка исследуется параллельно двумя методами иммуноферментного анализа -

1. Классическим иммуноферментным методом, при котором находящиеся в сыворотке крови животного специфические иммуноглобулины класса G (жидкая фаза) связываются со специфическим антигеном из типичных бруцелл вида abortus, сорбированном на поверхность лунки полистиролового планшета (твердая фаза);

2. Методом конкурентного иммуноферментного анализа, при котором в жидкую фазу добавляется ОПС-антиген, обладающий дифференциально-диагностическими возможностями (дифференциация реакций вакцинного и инфекционного происхождения и оценка степени эпизоотической опасности реагирующих животных) в качестве агента, конкурирующего со специфическими иммуноглобулинами класса G сыворотки крови животного за связывание со специфическим антигеном из типичных бруцелл вида abortus, сорбированном на поверхность лунки полистиролового планшета (твердая фаза);

Связавшиеся с твердой фазой специфические иммуноглобулины класса G в обоих методах регистрируют с использованием конъюгата на основе рекомбинантного белка G - пероксидаза хрена с последующей ферментативной реакцией разложения перекиси водорода и окисления хромогена с переходом из бесцветной в окрашенную фазу.

Для постановки реакции в две лунки полистиролового планшета для ИФА добавляют буферный раствор: в первую лунку - стандартный буферный раствор для разведения сыворотки, обеспечивающий соответствующую рН и ионную силу, необходимую для проведения стадии специфического связывания антител сыворотки крови с бруцеллезным антигеном.

Во вторую лунку так же добавляют стандартный буферный раствор для разведения сыворотки, в который вносят ОП-С антиген в количестве, эквимолярном количеству бруцеллезного антигена, сорбированного на поверхность лунок планшета.

В обе лунки вносят одинаковое количество сыворотки крови от обследуемого животного, и инкубируют при 37°С в течение 30-60 мин при регулярном встряхивании.

После инкубации содержимое лунок удаляют, тщательно отмывают от следов сыворотки, и добавляют конъюгат на основе рекомбинантного белка G, после чего инкубируют при 37°С в течение 30-60 мин при регулярном встряхивании.

После инкубации содержимое лунок удаляют, тщательно отмывают от следов конъюгата. Для проявления результатов реакции в лунки добавляют хромоген (тетраметилбензидин, либо аналогичный) и инкубируют в темноте при 37°С в течение 10-15 мин. По окончании инкубации реакцию останавливают добавлением серной кислоты до конечной концентрации 0,2 М/Л.

Результаты реакции регистрируют на спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм.

Интерпретацию результатов осуществляют по формуле

где

D1 - оптическая плотность, измеряемая в лунке, содержащей ОП-С антиген (конкурентный иммуноферментный анализ);

D2 - оптическая плотность, измеряемая в лунке, не содержащей ОП-С антиген (классический иммуноферментный анализ);

К.эо - коэффициент, отражающий процентное отношение показателя D1 к показателю D2. Этот коэффициент определяет степень эпизоотической опасности по бруцеллезу животного, от которого получен исследованный образец сыворотки крови, и сопоставим с результатами, получаемыми при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез в РИД с О-ПС антигеном

При этом установили следующую градацию:

0≤К≤60 - коэффициент, определяющий отсутствие у животного высокой эпизоотической опасности по бруцеллезу (РИД с О-ПС антигеном - отрицательная);

61≤К≤100 и выше - коэффициент, определяющий наличие у животного высокой эпизоотической опасности по бруцеллезу (РИД с О-ПС антигеном - положительная).

Для иллюстрации способа приведены примеры:

Пример 1

Изучали специфичность показаний ИФА с обычным антигеном, изготовленным из бруцелл вида abortus, с параллельным использованием О-ПС-антигена в конкурентном анализе, при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота с отрицательными результатами РА+РСК и РИД с О-ПС антигеном из благополучных по бруцеллезу стад без вакцинации и с вакцинацией и против бруцеллеза (таблица 1).

Результаты исследования в ИФА сывороток крови крупного рогатого скота с отрицательными результатами РА+РСК и РИД с О-ПС антигеном из благополучных по бруцеллезу стад без вакцинации и с вакцинацией против бруцеллеза

При исследовании на бруцеллез сывороток крови от крупного рогатого скота благополучных стад, не подвергавшегося вакцинации, по комплексу серологических реакций (РА+РСК, РИД) все пробы (5 проб) показали отрицательный результат. В ИФА при отрицательном и положительном контролях с учетом результатов классического и конкурентного вариантов во всех пробах (5 пробах) К.эо составил 0≤К≤60.

При исследовании на бруцеллез сывороток крови от крупного рогатого скота благополучных стад, не подвергавшегося вакцинации, по комплексу серологических реакций (РА+РСК, РИД) все пробы (13 проб) показали отрицательный результат. В ИФА при отрицательном и положительном контролях с учетом результатов классического и конкурентного вариантов во всех пробах (13 проб) К.эо составил 0≤К≤60.

Пример 2

Изучали дифференциально-диагностическую эффективность ИФА с антигеном, изготовленным из бруцелл вида abortus, и дополнительным использованием О-ПС антигена в конкурентном анализе, при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота с положительными и сомнительными результатами РА+РСК и отрицательной РИД с О-ПС антигеном из благополучных по бруцеллезу хозяйств с вакцинацией против бруцеллеза (таблица 2).

При исследовании на бруцеллез 55 проб сывороток крови от крупного рогатого скота благополучных стад из 5 хозяйств, подвергавшегося вакцинации, по комплексу серологических реакций (РА+РСК) все пробы (55 проб) показали положительный или сомнительный результат(в разном сочетании). РИД с О-ПС антигеном во всех 55 пробах была отрицательной. В ИФА при отрицательном и положительном контролях с учетом результатов классического и конкурентного вариантов во всех пробах (55 проб) К.эо составил 0≤К≤60.

Результаты исследования в ИФА сывороток крови крупного рогатого скота с положительными и сомнительными результатами РА+РСК и отрицательной РИД с О-ПС антигеном из благополучных по бруцеллезу стад с вакцинацией против бруцеллеза

Пример 3

Изучали дифференциально-диагностическую эффективность ИФА с антигеном, изготовленным из бруцелл вида abortus, и дополнительным использованием О-ПС антигена в конкурентном анализе, при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота с различными показаниями РА+РСК и РИД с О-ПС антигеном из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств без вакцинации и с вакцинацией против бруцеллеза (таблица 3).

При исследовании на бруцеллез 10 проб сывороток крови от крупного рогатого скота неблагополучных по бруцеллезу стад, не подвергавшегося вакцинации, с различными показателями у серологических реакций (РА+РСК) в ИФА при отрицательном и положительном контролях с учетом результатов классического и конкурентного вариантов К.эо составил во всех 5 пробах с отрицательной РИД 0≤К≤60, а, а во всех 5 пробах с положительной РИД - 61≤К≤100 и выше.

При исследовании на бруцеллез 10 проб сывороток крови от крупного рогатого скота неблагополучных по бруцеллезу стад, подвергавшегося вакцинации, с различными показателями у серологических реакций (РА+РСК) в ИФА при отрицательном и положительном контролях с учетом результатов классического и конкурентного вариантов К.эо составил во всех 5 пробах с отрицательной РИД 0≤К≤60, а, а во всех 5 пробах с положительной РИД - 61≤К≤100 и выше.

Результаты исследования в ИФА сывороток крови крупного рогатого скота с различными показаниями РА+РСК и и РИД с О-ПС антигеном из неблагополучных по бруцеллезу стад без вакцинации и с вакцинацией против бруцеллеза

Таким образом, основываясь на результатах, приведенных во всех трех примерах, установлена закономерность: в сыворотках крови крупного рогатого скота с различными эпизоотическими и иммунологическими характеристиками(независимо от результатов РА и РСК), исследованных на бруцеллез в ИФА с параллельным использованием классического и конкурентного(с добавлением О-ПС антигена) вариантов К.эо составлял во всех случаях при отрицательной РИД с О-ПС атигеном 0≤К≤60, а при положительной РИД с О-ПС антигеном - 61≤К≤100 и выше.

Установленная закономерность позволяет предлагать вместо официально принятой в дифференциальной поствакцинальной дигностике бруцеллеза крупного рогатого скота РИД с О-ПС антигеном, на постановку и учет которой уходит до 48 часов, применять иммуноферментный анализ в двух параллельных вариантах постановки - классическом с использованием специфического антигена из типичных бруцелл вида abortus и конкурентном - с дополнительным использовании О-ПС антиген при конъюгате на основе рекомбинантного белка G (учет реакций через 2 часа).

Преимущества данного способа:

- высокая специфичность;

- высокая дифференциально-диагностическая активность;

- высокая воспроизводимость;

- значительная экономия времени, затрачиваемого на проведение исследований, учет и интерпретацию полученных результатов, простота и объективность этих процессов за счет их инструментального обеспечения;

- высокая безопасность (за счет исключения прямого контакта с антигеном, автоматического пипетирования проб и др.).