СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА β-ХЛОР-L-АЛАНИНА

Изобретение относится к области технологии получения биологически активных соединений, используемых при производстве биологически активных добавок к пище (БАД к пище), функциональных продуктов питания, кормовых добавок, индивидуальных аминокислот и пептидов.

Область применения.

β-хлор-L-аланин - нестандартная аминокислота, которая обладает биологической активностью и относится к лекарственным веществам, воздействующим на систему крови, а именно к веществам, снижающим агрегацию тромбоцитов. Также она может быть использована для синтеза производных аминокислот и пептидов, обладающих противоопухолевой активностью.

Известны различные способы получения β-хлор-L-аланина: обработка сложного метилового эфира серина в ацетилхлориде пятихлористым фосфором. Полученный таким способом сложный метиловый эфир хлораланина подвергают гидролизу в соляной кислоте и нейтрализуют аммиаком, получая хлораланин [Фишер Е., Раске, Ber. Deutsch. chem. Ges., 1907, 40, 3717-3724].

В другой работе [Walsh С.Т., Schonbrunn A., Abeles R.H.; J. Biol. Chem., 1971, 246(22), 6855-6866] в качестве растворителя сложного метилового эфира серина использовали хлороформ и его обрабатывали пятихлористым фосфором. Также сложный метиловый эфир хлораланина подвергали гидролизу в соляной кислоте, которую затем удаляли роторным испарителем. Полученный хлораланин очищают путем адсорбции на колонке с ионообменной смолой Dowex 50 H⁺.

Однако указанные способы требуют защиты карбоксильной группы аминокислоты серина путем получения сложного метилового эфира серина, применения химически очень активного пятихлористого фосфора, ацетилхлорида, или токсичного растворителя: хлороформа. Кроме того, полученный сложный эфир хлораланина необходимо подвергать гидролизу и последующей нейтрализации кислоты и очистки хлораланина.

Наиболее близкими к предлагаемому способу является способ получения хлораланина из серина описанный в [Koki Yamashita, Kobe; Kenji Inoue, KakogaWa; Koichi Kinoshita, Takasago; Yasuyoshi Ueda, Himeji; Hiroshi Murao, Takasago, all of (JP). Patent №: (45) Date of Patent: US 6,372,941 B1 Apr. 16, 2002].

Сущность данного способа заключается в том, что 5 г L-серина добавляются к 50 мл диоксана, хлористый водород пропускается в полученный раствор с перемешиванием в комнатной температуре. В этом случае масса хлористого водорода в растворе составляла 14,5 г (0,3977 ммоль). К раствору медленно добавляется 2,5 г (0,051 моля) хлористого тионила, и реактор нагревался до 50°C. После 6 ч перемешивания этот раствор упаривается к половине оригинального объема. Полученный концентрат охлаждается до 0°C и постепенно в него добавляется 50 мл воды, чтобы получить заданную температуру. Анализ методом ВЭЖХ этого раствора показал образование 6,9 г (0,0431 моль) β-хлор-L-аланина гидрохлорида (выход: 91%). К молочно-белым кристаллам (чистота 95,2% по весу, содержащие 3,6 г (0,0225 моль)) β-хлор-L-аланина гидрохлорида добавляются 14 мл воды, чтобы получить раствор. К этому раствору медленно добавляется приблизительно 2 г сконцентрированной соляной кислоты. Затем к раствору добавляется 0,1 г активированного угля, и смесь перемешивается при комнатной температуре в течение приблизительно 10 мин. Активированный уголь отфильтровывается под пониженным давлением и промывается 1 мл воды. Затем фильтрат охлаждается до 0-10°C, и добавлением насыщенного раствора гидроксида лития доводят до рН 5,5. К раствору постепенно добавляется ацетон (42 мл), чтобы вызвать осаждение кристаллов. Получившаяся смесь охлаждается до 0-10°C и данная температура поддерживается в течение приблизительно 1 ч. Полученные кристаллы осадка отфильтровываются, промываются 14 мл ацетона. Влажные кристаллы осадка высушиваются при пониженном давлении (10 мм рт. ст.) и температуре 40°C. Анализ методом ВЭЖХ этих кристаллов показал чистоту 99,9% и выход 2,65 г чистого β-хлор-L-аланина (0,0214 моль). Общий выход 52%.

Недостатком этого способа является отсутствие осушения растворителя диоксана который в квалификации ч.д.а. и ч. содержит 0,15-0,3% воды и хлористого водорода, что приводит к гидролизу и потере дорогостоящего хлористого тионила и снижению выхода конечного продукта. Кроме того, требуется концентрирование раствора и добавление воды, что приводит к повышению растворимости β-хлор-L-аланина хлоргидрата и потерям при фильтрации и высушивании.

Учитывая недостатки известных способов получения соединений селена из предшествующего уровня техники, был разработан более эффективный способ синтеза β-хлор-L-аланина.

Сущность способа получения биологически активного вещества β-хлор-L-аланина заключающийся в том, что 5 г L-серина добавляют к 25 мл диоксана высушенного над молекулярным ситом 3А или 4А в трехгорлой колбе. Высушенный двукратным пропусканием через концентрированную серную кислоту хлористый водород вводят в раствор с перемешиванием, при насыщении раствора хлористым водородом температура повышается до 35-37°C, а после снижения до 30°C, дополнительно добавляют хлористый водород еще в течение 30 мин. К полученному раствору в течение 30 мин добавляют 2,5 г хлористого тионила и перемешивают в течение 3-4 ч при температуре 60-65°C, затем раствор охлаждают до 5-10°C и образовавшийся осадок β-хлор-L-аланина гидрохлорида высушивают на воронке Бюхнера с использованием водоструйного насоса, промывают 10 мл диоксана и снова высушивают. Полученный β-хлор-L-аланина гидрохлорид растворяют в 15-20 мл дистиллированной воде, добавляют 2-3 мл концентрированной соляной кислоты, 0,2-0,3 г активированного угля, тщательно перемешивают, фильтруют, затем к полученному раствору добавляют насыщенный раствор гидроксида лития, доводят до рН 5,5 и охлаждают до 0-5°C. К охлажденному раствору постепенно добавляют 45-50 мл охлажденного ацетона и оставляют раствор при температуре 0-5°C в течение 1-2 ч. Выпавшие кристаллы промывают охлажденным ацетоном на воронке Бюхнера и высушивают при температуре 50-60°C. Изобретение обеспечивает получение кристаллов β-хлор-L-аланина с выходом не менее 55% чистотой не менее 99,9%.

Пример 1. Способ получения

5 г L-серина добавляют к 25 мл диоксана высушенного над молекулярным ситом 3А или 4А в трехгорлой колбе, а высушенный двукратным пропусканием через серную кислоту хлористый водород вводят в полученный раствор с перемешиванием при комнатной температуре. По температуре раствора судят о насыщении раствора хлористым водородом: в начале температура повышается до 35-37°C, а затем начинает снижаться. После снижения температуры до 30°C хлористый водород добавляют дополнительно еще в течение 30 мин. Затем к раствору в течение 30 мин добавляют 2,5 г хлористого тионила и перемешивают в течение 3 ч при температуре 60-65°C. Затем раствор охлаждают до 5-10°C и образовавшийся осадок β-хлор-L-аланина гидрохлорида высушивают на воронке Бюхнера с использованием водоструйного насоса, промывают 10 мл диоксана и затем снова высушивают. Затем высушенный β-хлор-L-аланина гидрохлорид растворяют в дистиллированной воде и добавляют 2-3 мл концентрированной соляной кислоты и 0,2-0,3 г активированного угля, тщательно перемешивают и фильтруют. Добавляют к раствору насыщенный раствор гидроксида лития, доводят рН 5,5 и охлаждают до 0-5°C. К охлажденному раствору постепенно добавляют 45-50 мл охлажденного ацетона и оставляют раствор при температуре 0-5°C в течение 1-2 ч. Выпавшие кристаллы промывают охлажденным ацетоном на воронке Бюхнера и высушивают при температуре 50-60°C.

Изобретение обеспечивает получение кристаллов β-хлор-L-аланина с выходом не менее 55% чистотой не менее 99%. Анализ методом тонкослойной хроматографии: пластины «Сорбфил», система бутанол-1 - уксусная кислота - вода (4:1:1), R_f=0,42. Анализ методом капиллярного электрофореза (КЭФ) на приборе Капель 105М фирмы «Люмекс» по методике М-04-38-2009, t_ЭОП=7,796±0,243 мин, t_{β-ХЛОР-L-АЛАНИН}=11,418±0,259 мин.

В отличие от ближайшего аналога осушение растворителя диоксана над молекулярными ситами 3А или 4А и газообразного хлористого водорода пропусканием через концентрированную серную кислоту позволяет удалить воду, которая гидролизует дорогостоящий тионилхлорид, и повысить выход β-хлор-L-аланина на 3%. Молекулярные сита затем регенерируются нагреванием и используются для осушения следующей партии диоксана, а серная кислота используется для синтеза хлористого водорода.

Повышение температуры раствора после добавления хлористого тионила до 60-65°C, позволяет сократить время синтеза до 3-4 ч в отличие от ближайшего прототипа. Также, в предложенном способе не требуется концентрирование раствора после завершения синтеза, так как выпадает легко отделимый фильтрованием осадок β-хлор-L-аланина гидрохлорида, и добавления воды, которая, повышая растворимость вещества, ведет к его потерям при фильтрации.

Новизна, промышленная применимость, неочевидность.

Таким образом, вышеизложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании в изобретении следующей совокупности признаков:

- новизна способа заключается в осушении растворителя – диоксана, который содержит 0,15-0,3% воды, молекулярными ситами 3А или 4А, которые легко подвергаются регенерации нагреванием до 200-300°C, и газообразного хлороводорода пропусканием через концентрированную серную кислоту. Осушение растворителя и хлористого водорода позволяет исключить гидролиз дорогостоящего хлористого тионила и повысить выход конечного продукта - хлораланина на 3%. Повышение температуры синтеза до 60-65°C позволяет сократить время синтеза до 3-4 ч по сравнению с ближайшим прототипом. Также исключается добавление воды в конце синтеза для понижения температуры, так как вода, повышая растворимость хлораланина гидрохлорида в диоксане, способствует его потере при фильтровании;

- изобретение при его осуществлении предназначено для производства биологически активных соединений, используемых при производстве биологически активных добавок к пище (БАД к пище), функциональных продуктов питания, кормовых добавок, индивидуальных пептидов;

- для изобретения в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы, подтверждена возможность его осуществления с помощью вышеописанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- по совокупности таких признаков, как доступность, стабильность и широкий ассортимент исходных соединений, доступность и низкая стоимость реагентов, простота выделения (фильтрация), высокие выходы, стабильность целевых продуктов, несложное аппаратное оформление процесса - позволяют оценить разработанный метод как отвечающий требованиям промышленного производства.