Результат интеллектуальной деятельности: Способ инкорпорации биологически активных микро- и наночастиц в нейтрофилы

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно - к способу инкорпорации микро- и наночастиц, а также масляных растворов и эмульсий в нейтрофилы. Способ может быть использован для активации, иммуномодуляции различных звеньев иммунитета, а также адресной доставки лекарственных и диагностических веществ.

В настоящее время происходит бурное развитие био- и нанотехнологий, связанных с разработкой способов инкорпорации биологически активных веществ различных по своим физико-химическим свойствам с целью адресной доставки этих веществ в различные органы организма, а также снижение дозы и токсичности лекарственных или диагностических средств. Для этого используют липосомы, микросферы на основе биодеградабельных компонентов и фагоцитирующие клетки. Однако если липосомы и нашли свое ограниченное применение в практике, то реальные факты о попытках парентерального использования в медицине относительно твердых по плотности микросфер отсутствуют. В большинстве случаев это связано с возникновением ряда осложнений, обусловленных образованием в сосудистом русле микротромбов. Иначе дело обстоит с инкорпорированием в фагоцитирующие клетки (макрофаги и нейтрофилы) твердых и нерастворимых в воде биологически активных веществ. Фагоциты - это естественные форменные элементы самой крови, и в силу этого они являются биологически совместимыми с ее компонентами (опсонины, факторы свертываемости крови, система комплемента и т.д.) и не способны вызывать какие-либо нарушения или осложнения, связанные с изменениями реологических свойств кровотока. Существуют в основном две большие субпопуляции фагоцитов - макрофаги и нейтрофилы. Если в литературе и встречаются данные по этой проблеме, то, как правило, это касается макрофагов, а вот данных по нейтрофилам фактически нет. Причиной этого являются методические сложности - в выделении нейтрофилов, в процессе их получения, хранения и стабилизации самой суспензии нейтрофилов. Макрофаги в этом отношении имеют преимущество, поскольку более стабильны в суспензии и долгоживущие. Однако последние имеют существенный недостаток в другом - экономически затратная процедура их получения у человека [1]. Нейтрофилы же здесь преуспевают, поскольку их довольно много в плазме крови и они достаточно зрелые в функциональном отношении, по сравнению с моноцитами, которые только предстоит дифференцировать в макрофаги в условиях in vitro в течение 7-9 суток. К этому следует добавить, что как макрофаги, так и нейтрофилы часто в процессе активации их в условиях in vitro проявляют крайне нежелательное свойство - способность к образованию макроагрегатов, что сводит порой работу исследователя «к нулю».

В источниках информации по инкорпорации микрочастиц в фагоциты имеется большое число модифицированных методик проведения фагоцитоза (4, 5). Все они проводятся в условиях ex vivo, а это, как известно, значительно усложняет технику проведения самой процедуры.

Известен способ получения и доставки мелких частиц фармацевтически активных средств в организм млекопитающего, включающий сбор клеток ткани млекопитающего донора, выращивание клеток в культуральной среде, к которой добавляют фармацевтическую композицию, содержащую частицы одного или нескольких фармацевтически активных соединений или диагностического средства (средств), обеспечение поглощения частиц клетками или в внутриклеточном компартменте клеток, прикрепление частиц к краю клеток, или их комбинации; и введение клеток млекопитающему. Клетки способные к фагоцитозу и могут быть выбраны из группы, состоящей из макрофагов, моноцитов, гранулоцитов, нейтрофилов, базофилов, эозинофилов, дендритных клеток и их комбинаций [6] РФ 2006144851, C12N 5/06, 2008).

В способе, принятом за прототип, заявители описывают в наиболее обобщенном виде общепринятые способы оценки фагоцитоза, а именно он включает в себя следующие этапы: сбор клеток тканей от животного-донора, селективный или неселективный рост этих клеток в клеточной культуральной среде, к которой добавляют твердые частицы терапевтически активного соединения, в основном, свободного от носителя лекарственного средства - ирританта (первичного ирританта) около 10% или менее по весу, и имеющего средний размер частиц менее 100 микрон, культивирование клеток с твердыми частицами терапевтически активного соединения, частицы которого поглощаются клетками, прикрепление активного соединения в виде частиц к периферии таких клеток; или сочетание внутриклеточного поглощения и прикрепления к поверхности клетки, необязательное выделение и/или повторное образование взвеси из клеток, полученных на стадиях, введение клетки в организм млекопитающего. Фармацевтически активный материал может быть введен внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, внутрисуставно, интратекально, эпидурально, интрацеребрально, через ротовый маршрут, ректально, местно, чрескожно, перорально, интраназально, легочным путем, внутрибрюшинно или в их комбинации. После введения в организм нагруженные клетки осуществляют транспортировку фармацевтической композиции в виде частиц. Клетки, способные к фагоцитозу, могут быть выбраны из группы, состоящей из макрофагов, моноцитов, гранулоцитов, нейтрофилов, базофилов, эозинофилов, дендритных клеток и их комбинаций [7]. Способ-прототип состоит из следующих этапов:

- получение и выделение относительно чистого пула клеток из организма человека или животного. Следует заметить, что получение интактных нейтрофилов у мышей осуществляется только благодаря предварительному введению в брюшную полость раствора первичного ирританта (воспалительного агента);

- помещение клеточной суспензии в полной питательной среде в пластиковый флакон для прилипания полученных клеток ко дну пластикового флакона с целью создания клеточного монослоя (от 40-60 минут при +37°C);

- к монослою, отмытому от неприлипающей фракции клеток, добавляют суспензию биологически активного вещества для проведения процесса их поглощения фагоцитами. В большинстве случаев для улучшения процесса фагоцитоза требуется стадия опсонизации микрочастиц (30 минут в инактивированной от активности комплемента сыворотке, с последующей отмывкой при помощи центрифуги);

- по завершении экспозиции фагоцитов с исследуемыми микрочастицами проводят троекратную отмывку монослоя клеток от непоглощенных частиц;

- скрепером или ферментативным раствором (трипсин с ЭДТА) слущивают прилипшие к поверхности пластика фагоциты;

- троекратная отмывка фагоцитов с инкорпорированными в них частицами от фрагментов разрушенных клеток.

Таким образом, стадия получения выхода в брюшную полость нейтрофилов с помощью ирританта [2, 3, 4, 5] использовалась только для получения интактных (или нативных) нейтрофилов. Затем, по истечении 2-4 часов, промывали брюшную полость животного холодной питательной средой и в последующем ее центрифугировали с целью отмывки от ирританта (элиситанта). После получения этих клеток, но уже в условиях in vitro проводили процедуру фагоцитоза или иные обработки этих клеток. При этом способе выход нейтрофилов в брюшную полость составлял до 3-5 миллионов клеток с одной мышки.

Недостатками данного способа являются:

- введение в брюшную полость ирританта (воспалительный агент, например, протеозо-пептон, тиогликолят, раствор казеина, минеральное масло и т.д.), не включающего инкорпорируемое биологически активное вещество, что само по себе приводит к изменению физико-химических и биологических свойств фагоцита;

- слущивание прилипших к поверхности пластика фагоцитов неизбежно приводит к гибели части клеток. Именно на этой стадии, если в эксперименте используют активаторы функциональной активности фагоцитов, происходит образование макроагрегатов;

- получение описанным способом сравнительно небольшого количества нейтрофилов;

- невозможность к инкорпорации масляных растворов и эмульсионных суспензий;

- трудоемкость и длительность способа;

- значительные затраты в связи с использованием дорогостоящих реактивов и оборудования (питательной среды для культивирования, сыворотки, флаконов для культивирования, термостата, скрепера, раствора трипсина с ЭДТА);

- невозможность хранить полученные нейтрофилы в течение длительного времени (не менее 8 месяцев).

Для устранения этих недостатков был разработан предлагаемый способ.

Задачей изобретения является повышение качества получаемой клеточной суспензии и сокращение времени проведения способа.

Поставленная задача решается тем, что в способе инкорпорации твердых и маслянистых биологически активных микро- и наночастиц в нейтрофилы, включающем введение в брюшную полость животного-донора суспензии, содержащей ирритант, выдерживание срока для миграции нейтрофилов в брюшную полость, фагоцитоз частиц, отмывку полученных клеток, например, центрифугированием, - в качестве ирританта используют биологически активное вещество, которое необходимо инкорпорировать в нейтрофилы, проведение стадии фагоцитоза осуществляют в самом организме животного in vivo в течение 7-12 часов, отмывку нейтрофилов из перитонеального экссудата проводят введением в полость животного-донора холодного (от 0°C до +4°C с плавающими кусочками льда) забуференного физиологического раствора, приготовленного на деионизованной воде, после чего производят консервацию полученных клеток.

Полученные клетки консервируют в условиях мягкой фиксации, например, 1% раствором формалина, с которым экспонировали клетки в течение 10-20 минут при температуре от 0°C до +4°C.

В случае использования в качестве животного-донора – мыши - объем холодного забуференного физиологического раствора составляет 8-10 миллилитров.

Предложенное изобретение, на наш взгляд, является новым и соответствует критерию «изобретательский уровень».

Введение в качестве ирританта биологически активного вещества, которое необходимо инкорпорировать в нейтрофилы, улучшает качество функционального состояния нейтрофилов, за счет отсутствия в цитоплазме нейтрофилов остатков первичного ирританта, то есть с помощью которого в прототипе только лишь получали интактные нейтрофилы.

Проведение стадии фагоцитоза в самом организме животного, т.е. in vivo и минуя стадию опсонизации, а не ex vivo, как в известных способах, исключает агрегацию нейтрофилов, что также повышает качество в виде стабильности полученной клеточной суспензии.

Осуществление отмывки нейтрофилов из перитонеального экссудата введением в полость животного-донора холодного (от 0°C до +4°C с плавающими кусочками льда) забуференного физиологического раствора позволяет избежать образования нейтрофильных агрегатов, что также повышает качество полученной клеточной суспензии. Приготовление забуференного физиологического раствора, приготовленного на деионизованной воде, позволяет избежать мельчайших примесей, в том числе ионов кальция (Са) и магния (Mg).

Существенное сокращение времени проведения предлагаемого способа обеспечивается:

- введением в качестве ирританта сразу биологически активного вещества, которое необходимо инкорпорировать в нейтрофилы, без введения первичного ирританта;

- отсутствием стадии опсонизации in vitro;

- существенно сокращаются временные затраты на дополнительные процедуры прилипания клеток к пластику, фагоцитоз и троекратную отмывку от непоглощенных частиц в случае работы с микрочастицами;

- однократной отмывкой (для микрочастиц) вместо 3-кратной в известных традиционных подходах и отсутствием вредных примесей.

Пример 1.

В качестве микрочастичкового биологически активного вещества нами был использован зимозан, известный стимулятор гемопоэза и активатор многих функций ряда иммунокомпетентных клеток и в частности нейтрофилов. Зимозан - биологически активное вещество, которое необходимо ввести в организм человека. Размер его частиц варьировался от 1-5 микрон, что достигалось либо механическим гомогенизированием с помощью тефлонового гомогенизатора, либо с помощью ультразвукового диспергатора. Концентрация частиц зимозана доводилась до 4 мг в миллилитре, например, физиологического раствора на фосфатном буфере. Далее, внутрибрюшинно мышке вводили 1 мл указанной суспензии зимозана. Необходимо отметить, что оптимально-эффективную дозу исследуемого препарата в каждом случае необходимо подбирать индивидуально, исходя из двух ограничительных факторов - во-первых, время экспозиции для фагоцитоза не должно превышать 12 часов, поскольку дальнейшая инкубация приводит к «загрязнению» перитонеального экссудата другими субпопуляциями иммунокомпетентных клеток, часть из которых не способна к фагоцитозу (лимфоциты); во-вторых, необходимо учитывать размер и природу частиц, которые определяют скорость процесса их поглощения фагоцитами, в частности, нейтрофилами. Исходя из этого, необходимая оптимальная доза препарата подбирается индивидуально, то есть вводя в брюшную полость 1 миллилитр суспензии (разной концентрации), затем через 3, 4, 5, 6, 7, 8… до 12 часов у мыши получали смыв клеток перитонеальной полости и проводили микроскопию. Оптимальным становилась ситуация, когда был максимальный выход в брюшную полость нейтрофилов с одновременным отсутствием в растворе свободно находящихся частиц зимозана либо иного биологически активного вещества микрочастичковой или наночастичковой природы. Таким образом, мы выяснили, что объем суспензии зимозана, равный 1 миллилитру с концентрацией в 4 мг/мл, способен оптимально стимулировать выход нейтрофилов в брюшную полость (10-20 миллионов нейтрофилов с мыши). При этом происходит практически полное поглощение всего количества введенных в брюшную полость гранул зимозана нейтрофилами. Таким образом, по истечении оптимального срока для миграции нейтрофилов в брюшную полость и экспозиции для фагоцитоза (от 7 до 12 часов) этих частиц проводят промывку брюшной полости. Отмывку нейтрофилов из перитонеального экссудата проводили введением в полость холодного 8-10 миллилитров (от 0°C до +4°C с плавающими кусочками льда) забуференного физиологического раствора, приготовленного на деионизованной воде. Это исключает образование нейтрофильных агрегатов при выделении и дальнейшей работе с этими клетками. Далее, после непродолжительного (1 минута) массажа брюшка мышки перитонеальную жидкость откачивали и помещали в центрифужную пробирку и далее производили центрифугирование при 1500 об/мин в течение 7-10 минут. Если экспериментатор имеет дело с наноразмерными частицами, то необходима дополнительная троекратная отмывка клеток от незахваченных нейтрофилами частиц все тем же холодным забуференным физиологическим раствором. С целью длительного хранения этих клеток проводят мягкую фиксацию (консервацию), которая бы не приводила к деформации клеток и не вступала во взаимодействие с инкорпорированным веществом, например слабым раствором формалина (1-2% раствор, в течение 10-20 минут при температуре 0-+4°C).

Пример 2.

Этот пример касается использования масляных суспензий. В качестве масляной суспензии мы взяли минеральное масло (например, в котором можно растворить какое-либо биологически активное вещество) и смешивали последнее в соотношении 1:1 с физиологическим раствором хлорида натрия. Затем эту смесь диспергировали до желательного размера микрочастиц, которые удобны для фагоцитоза нейтрофилами, например, от 1-5 микрон - это достигается при скорости механического гомогенизатора (диспергатора) при 7000 об/мин в течение 5-10 минут, при комнатной температуре, либо проводить эту процедуру с помощью ультразвуковой установки, например с частотой 22000 герц в течение 5-10 минут. Затем немедленно приготовленную суспензию вводим внутрибрюшинно по 1 миллилитру в мышь. Все остальные этапы аналогичны тем, что описаны выше в Примере 1.

Технический результат от предложенного способа заключается, прежде всего, в повышении качества получаемой клеточной суспензии и сокращении времени проведения способа, что было показано ранее. Кроме того, способ позволяет:

- получить достаточно большое количество нейтрофилов (до 15-50 млн с одной мыши, в зависимости от природы исследуемого вещества и времени экспозиции, а значит уменьшаются затраты на закупку экспериментальных животных;

- поскольку слущивание клеток скрепером всегда сопровождается разрушением клеток, то данный способ позволяет избежать потери клеток;

- избежать образования макроагрегатов и, соответственно, иметь стабильную в растворе и работе суспензию;

- реализовать возможность работы с растворенными в масле и в эмульсионных суспензиях биологически активными веществами;

- отказаться от использования ряда дорогостоящих реактивов (питательной среды для культивирования, сыворотки, флаконов для культивирования, термостата, скрепера, раствора трипсина с ЭДТА);

- хранить полученные нейтрофилы в течение длительного времени (не менее 10 месяцев).

Литература

1. Andreesen R., Scheibenbogen С, Brugger W., Krause S., Meerpohl H-G., Leser H-G., Engler H., and Lohr G.W. Adoptive transfer of tumor cytotoxic macrophages generated in vitro from circulating blood monocytes: A new approach to cancer immunotherapy. Cancer Res. 1990, 50, 7450-7456.

2. Watt SM, Burgess AW, Metcalf D. Isolation and surface labeling of murine polymorphonuclearneutrophils. J Cell Physiol. 1979 Jul; 100(1): 1-21.

3. Call D.R., Nemzek J.A., et al. Ratio of local to systemic Chemokine concentrations regulates neutrophil recruitment. Am.J. Path 2001, v. 158, p. 715-721.

4. Murata T, Sullivan JA. Sawyer DW. Mandell GL Influence of type and opsonization of ingested particle on intracellular free calcium distribution and superoxide production by human neutrophils. Infect Immun. 1987 Aug; 55(8): 1784-91.

5. Amiji M., Jain S. Calcium flginate microparticles as a non-condensing DNA delivery and transfection system for macrophages. Pharmaceutical Engineering 2012, v 32, N 5, pp. 1-7.

6. Применение терапевтических средств ex-vivo в виде твердых микрочастиц. Заявка на изобретение РФ 2006144851, C12N 5/06, 2008.

7. Ex-vivo application of solid microparticulate therapeutic agents. Патент Канады CA 2565972, A61K 45/00, C12N 5/06, 2005.