×
19.01.2018
218.016.0898

СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ФОЛАТНОГО ЦИКЛА МЕТОДОМ ПЦР И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Заявлен набор для оценки полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР, включающий компоненты для выделения ДНК, видоспецифичные олигонуклеотидные пары праймеров для проведения одностадийной экспресс-идентификации нескольких однонуклеотидных замен в аллелях генов MTHFR, MTR, MTRR и компоненты для детекции результатов гель-электрофорезом. Изобретение позволяет с высокой точностью определять степень предрасположенности к заболеваниям, связанным с нарушениями репродуктивной, сердечно-сосудистой систем, канцерогенезу и др. патологиям по изучению полиморфизма в генах фолатного цикла.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области медицины, в частности диагностики, молекулярной генетики и молекулярной биологии, и касается способа оценки полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР с последующей детекцией результатов гель-электрофорезом и набора для его осуществления.

Фолатный цикл представляет собой сложный каскадный процесс, контролируемый ферментами, которые в качестве коферментов имеют производные фолиевой кислоты. Эта кислота является сложной молекулой, состоящей из птероидной кислоты и одного (моноглутаматы) или нескольких (полиглутаматы) остатков глутаминовой кислоты. Ключевым этапом в данном процессе является синтез метионина из гомоцистеина. Это достигается в процессе превращения фолатов: восстановления 5,10-метилентетрагидрофолата до 5-метилтетрагидрофолата, несущего метильную группу, которая необходима для превращения гомоцистеина в метионин. Восстановление фолатов происходит при участии фермента метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR). Метильная группа переносится на В12, который затем отдает ее гомоцистеину, образуя метионин с помощью фермента метионин-синтазы (MTR). Однако в некоторых случаях В12 может окисляться, что приводит к подавлению метионин-синтазы. Для поддержания активности фермента необходимо восстановительное метилирование с помощью фермента метионин-синтаза-редуктазы (MTRR).

В этом цикле происходит перенос метальных групп и осуществляется метаболизм гомоцистеина. Метаболизм фолатов (производных фолиевой кислоты) - важное звено первичного метаболизма клетки. Обмен фолатов является поставщиком одноуглеродных фрагментов для таких жизненно важных клеточных процессов, как регенерация метионина, биосинтез пуриновых нуклеотидов и превращение уридинмонофосфата в тимидилат, метилирование ДНК и РНК. Одноуглеродные остатки, поступающие в обмен фолатов, образуются при катаболизме некоторых аминокислот (серина, глицина, гистидина), а также при катаболизме холина.

Помимо процессов катаболизма, одноуглеродные остатки поступают в обмен фолатов при детоксикации формальдегида, а также при утилизации формиата - побочного продукта клеточного метаболизма.

Дефицит производных фолиевой кислоты, связанный с особенностями диеты, а также мутации в генах фолатного обмена, обусловливающие снижение активности ферментов, приводят к избыточному накоплению гомоцистеина в крови и, как следствие, нарушению процессов метилирования в клетках. Анализ мутаций в генах фолатного цикла - метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), метионин-синтазы-редуктазы (MTRR) и метионин-синтазы (MTR) позволяет определить предрасположенность к таким заболеваниям, как фетоплацентарная недостаточность, незаращение нервной трубки, нарушение расхождения хромосом в оогенезе (повышает риск рождения детей с синдромом Дауна) и другим патологиям плода, несовместимым с жизнью, атеросклероз, атеротромбоз, инфаркт и др. [2, 4].

Исследование полиморфизма гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) имеет прогностическое значение и позволяет определить риск развития онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний, а также дефектов внутриутробного развития во время беременности из-за нарушения обмена фолиевой и кислоты и гипергомоцистеинемии, оценить вероятность патологии у потомства, что дает возможность своевременного принятия мер посредством назначения корректирующей терапии.

В настоящее время известны следующие наборы и тест-системы для определения полиморфизма генов фолатного цикла: ДНК-технология «Генетика метаболизма фолатов». Метод для определения полиморфизма генов основан на технологии ПЦР с анализом кривых плавления дает возможность идентифицировать фрагменты ДНК путем детекции изменений в уровне флуоресценции комплекса фрагмент-проба (меченный флуорофором олигонуклеотидный зонд) на этапе его денатурации и последующего построения графика кривой плавления [3]. Недостатком набора является выделение ДНК только из крови, детекция результатов и программное обеспечение подходит только к определенному прибору - детектирующему амплификатору для ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (приборы серии ДТ производства ООО «НПО ДНК-Технология»). Набор для изучения полиморфизмов генов фолатного цикла SNP-экспресс (Литех, Москва) с последующей детекцией результатов гель-электрофорезом (его недостатком является выделение ДНК из крови) [1], которые являются близкими к предлагаемому изобретению. Однако идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе.

Задачей настоящего изобретения является создание набора для оценки полиморфизмов генов фолатного цикла методом ПЦР с последующей детекцией результатов гель-электрофорезом.

Набор для регистрации 4 полиморфизмов в генах MTHFR, MTRR, MTR позволяет регистрировать в одной пробирке замены с.665С>Т, с.1286А>С в гене MTHFR, c.66A>G в гене MTRR и c.2756A>G в гене MTR методом специфической лигазной реакции.

Решение задачи настоящего изобретения - оценка полиморфизма генов фолатного цикла методом ПЦР с последующей детекцией результатов гель-электрофорезом и набор для его осуществления. Для этого экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для проведения мультиплексной цепной реакции, подобрано сочетание праймеров, необходимое и достаточное соотношение компонентов реакционной смеси и определен режим постановки ПЦР, что является важным при проведении ПЦР анализа.

Заявляемая тест-система разделена на 3 комплекта:

- комплект 1 содержит компоненты для выделения ДНК, упакованные в шесть пластиковых флаконов, содержащих раствор 1 (6М раствор гуанидинтиоционата), раствор 2 (4М раствор гуанидинтиоционата), раствор 3 (спиртосолевой раствор), ацетон, элюент для ДНК (ТЕ-буфер), нуклеосорбент;

- комплект 2 содержит компоненты для проведения ПЦР и включает 2 пластиковые пробирки со смесью 1 (праймеры, дНТФ и вода), 2 пластиковые пробирки со смесью 2 (праймеры, дНТФ и вода), 2 пластиковые пробирки со смесью 3 (праймеры, дНТФ и вода), 2 пластиковые пробирки со смесью 4 (праймеры, дНТФ и вода), 1 пластиковую пробирку с 10-кратным буфером, 1 пластиковую пробирку, содержащую Taq-полимеразу, 1 пластиковую пробирку с ТЕ-буфером;

- комплект 3 содержит компоненты для учета результатов анализа и включает 1 пластиковый флакон, содержащий ТАЕ буфер, 2 флакона с агарозой для электрофореза и 1 флакон с буфером для нанесения проб.

Тест-система предназначена для определения методом мультилокусной полимеразной цепной реакции полиморфизма в генах фолатного цикла. Система рассчитана на проведение 50 определений, включая контрольные образцы.

Заявляемый способ идентификации включает следующие этапы.

а) Выделение ДНК (комплект 1).

б) Проведение ПЦР (комплект 2).

ПЦР проводят в один этап по следующей программе: предварительная денатурация 96°С - 2 мин, 25 циклов из 96°С - 10 с, 58,2°С - 10 с, 72°С - 30 с, заключительная достройка цепи 72°С - 5 мин.

в) Визуализация полученных результатов гель-электрофорезом (комплект 3).

Пример

Исследование проведено на девушках и женщинах добровольцах в возрасте от 18 до 33 лет русской и казахской национальностей, всего 91 человек. Все испытуемые были проинформированы о содержании работы, заполнили согласие на проведение исследования и анкету с вопросами о возрасте, национальности, регулярности менструального цикла, заболеваниях самих добровольцев и их матерей, образе жизни.

У них забиралась кров из вены, из которой затем проводили выделения ДНК и изучение мутаций генов MTHFR метилентетрагидрофолатредуктазы, MTRR метионин-синтаза-редуктазы и MTR метионин-синтазы методом ПЦР. После выделения ДНК из крови и постановки ПЦР, проводили анализ и статистическую обработку данных нуклеотидных замен гена MTHFR, MTRR и MTR., после чего мы распределяли полиморфные аллели в гомо- и гетерозиготном состоянии по группам в зависимости от национальности добровольцев. Кроме того, нами была определена корреляция полиморфных вариантов данного гена с заболеваниями испытуемых.

Изучаемые полиморфизмы генов:

MTHFR (метилентетрагидро-фолатредуктаза)

Полиморфизм: MTHFR:677 С>Т

Нейтральный аллель: С/С

Аллель риска: С/Т, Т/Т Частота - 30-40%

Полиморфизм: MTHFR:1298 А>С

Нейтральный аллель: А/А

Аллель риска: А/С, С/С Частота - 20-30%

Локализован на хромосоме 1р36.3

MTR (В12-зависимая метионин-синтаза)

Полиморфизм: MTR:2756 A>G

Нейтральный аллель: А/А

Аллель риска: A/G, G/G Частота - 20-30%

MTRR (метионин-синтаза редуктаза)

Полиморфизм: MTRR:66 A>G

Нейтральный аллель: А/А

Аллель риска: А/А, G/G Частота - 40-50%

Расположен на хромосоме 5р15.3-р15.2

ПЦР проводили в один этап по следующей программе: предварительная денатурация 96°С - 2 мин, 25 циклов из 96°С - 10 с, 58,2°С - 10 с, 72°С - 30 с, заключительная достройка цепи 72°С - 5 мин.

В гене MTR_2756 гомозиготная замена GG в 9 раз чаще встречалась у казахов (57,1%), в то время как у русских составила только 6,3%. Гомозиготы по норме и гетерозиготы в выборках встречались с одинаковой частотой.

Аналогичная динамика прослеживалась и для гена MTHFR_677: замена по двум аллелям ТТ у казахов достигла 19%, у русских - 2,1%. Однако в гетерозиготном состоянии этот полиморфный ген несколько чаще встречался у представителей русской национальности (41,6 к 23,8%).

Ген MTHFR_1298, в отличие от предыдущих, у русских испытуемых содержал замены значительно чаще: АС - 41,6%, СС - 12,5%, что в 1,5 и 3 раза больше, чем у казахов.

Одинаковая частота всех трех состояний в обеих популяциях выявлена для гена MTRR_66 с преобладанием гетерозигот AG над нормой АА и гомогозиготами GG.

Следует отметить высокие показатели замены обоих аллелей в выборке в целом. Кроме того, полученные результаты показывают, что этническая обусловленность замены нуклеотида в положении 677 гена MTHFR у испытуемых отличается от замены в положении 1298.

Согласно полученным результатам, из выборочной совокупности более подвержены возникновению гомозиготных нуклеотидных замен и соответствующим метаболическим эффектам представительницы казахской национальности.

Способ с использованием набора обеспечивает быстрое, простое, точное выявление полиморфизмов генов метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), метионин-синтазы-редуктазы (MTRR) и метионин-синтазы (MTR) фолатного цикла.

Источники информации

1. Вайнер А.С., Воронина Е.Н., Кострыкина Н.А., Филипенко М.Л. Полиморфные варианты генов фолатного цикла в популяции жителей Новосибирска. Вестник НГУ, 2008, Том 6, выпуск 2. - С. 13-19.

2. Добролюбов А.С., Липин М.А., Поляков А.В., Фетисова И.Н. Полиморфизм генов фолатного обмена и болезни человека // Вестник новых медицинских технологий, 2006. - Т. 13, №4 С. 71-73.

3. Иевлева К.Д., Баирова Т.А., Колесников С.И., Калюжная О.В. Распространенность полиморфизма 2756A>G гена метионинсинтазы в популяциях Восточной Сибири // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2014. - №6(100). - С. 108-110.

4. Ковалев В.В. Роль полиморфизма генов системы фолатного цикла в реализации программы Эко и ПЭ (литературный обзор) / Вестник УМАН, 2009. - №4.

Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 30 items.
27.04.2013
№216.012.394d

Средство, обладающее гиполипидемическим действием, на основе экстракта семян лотоса орехоносного (nelumbo nucifera)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства растительного происхождения на основе экстракта, обладающего гиполипидемическим действием. Средство получают путем экстрагирования семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera) 50%-ным этиловым спиртом в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002480230
Дата охранного документа: 27.04.2013
27.10.2013
№216.012.787e

Средство, обладающее иммунотропной и антиоксидантной активностью, на основе экстракта семян лотоса орехоносного (nelumbo nucifera)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства на основе экстракта семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera), обладающего иммунотропной и антиоксидантной активностью. Средство, обладающее иммунотропной и антиоксидантной активностью, которое получено...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002496508
Дата охранного документа: 27.10.2013
10.11.2013
№216.012.7c79

Средство, обладающее анксиолитическим и антидепрессивным действием, на основе экстракта семян лотоса орехоносного (nelumbo nucifera)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства на основе экстракта семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera), обладающего анксиолитическим и антидепрессивным действием. Средство, обладающее анксиолитическим и антидепрессивным действием, получают путем...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002497538
Дата охранного документа: 10.11.2013
13.01.2017
№217.015.7a04

Секция сеялки

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению, в частности к сеялкам точного высева семян сельскохозяйственных культур. Секция сеялки включает четырехзвенную шарнирно-рычажную систему для соединения с рамой сеялки, корпус с семенным ящиком, сошник, высевающий аппарат, копирующее...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002599163
Дата охранного документа: 10.10.2016
13.01.2017
№217.015.89cd

Способ тестирования физиологического состояния осетровых рыб

Изобретение относится к ихтиологии и рыбоводству и представляет собой способ тестирования физиологического состояния осетровых рыб, включающий исследование сыворотки крови рыб, отличающийся тем, что сыворотку крови исследуют методом краевой дегидратаци в аналитических ячейках и производят...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002602662
Дата охранного документа: 20.11.2016
25.08.2017
№217.015.a1e7

Устройство для уборки тростника южный

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению, в частности к устройствам для скашивания стебельных растений и заготовке тростника южного.. Устройство для уборки тростника южный включает лодку, двигатель, коробку передач, режущий аппарат, привод и механизм управления. На боковой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002606911
Дата охранного документа: 10.01.2017
25.08.2017
№217.015.a70d

Ротационный мелиоративный рыхлитель

Изобретение относится к области сельскохозяйственного машиностроения, в частности к ротационным почвообрабатывающим орудиям для рыхления почвы с одновременным внесением в почву мелиорантов и удобрений. Ротационный мелиоративный рыхлитель содержит установленные посредством поводков блоки дисков...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002608067
Дата охранного документа: 12.01.2017
25.08.2017
№217.015.cf08

Способ коррекции плосковальгусной деформации стоп и устройство для его осуществления

Группа изобретений относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использована для коррекции походки у детей с диагнозом плосковальгусная деформация стоп. Система захвата и анализа движения в виде инструментально-диагностического комплекса состоит из компьютера с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002621120
Дата охранного документа: 31.05.2017
25.08.2017
№217.015.cf40

Способ получения масла из семян робинии псевдоакации и его состав

Изобретение относится к эфиромасличной промышленности. Масло семян робинии псевдоакации получено обработкой семян робинии псевдоакации, собранных в октябре, методом сверхкритической флюидной экстракции диоксидом углерода, при этом используют семена робинии псевдоакации, измельченные до частиц...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002621022
Дата охранного документа: 30.05.2017
25.08.2017
№217.015.cf5e

Устройство для уничтожения молоди саранчи

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Устройство для уничтожения саранчи представляет собой металлическую раму. На раме находится не менее трех быстровращающихся валов. На каждом валу вдоль диаметра на равном расстоянии закреплены отрезки лески. Для привлечения саранчи...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002621027
Дата охранного документа: 30.05.2017
Showing 1-10 of 16 items.
27.04.2013
№216.012.394d

Средство, обладающее гиполипидемическим действием, на основе экстракта семян лотоса орехоносного (nelumbo nucifera)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства растительного происхождения на основе экстракта, обладающего гиполипидемическим действием. Средство получают путем экстрагирования семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera) 50%-ным этиловым спиртом в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002480230
Дата охранного документа: 27.04.2013
27.10.2013
№216.012.787e

Средство, обладающее иммунотропной и антиоксидантной активностью, на основе экстракта семян лотоса орехоносного (nelumbo nucifera)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства на основе экстракта семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera), обладающего иммунотропной и антиоксидантной активностью. Средство, обладающее иммунотропной и антиоксидантной активностью, которое получено...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002496508
Дата охранного документа: 27.10.2013
10.11.2013
№216.012.7c79

Средство, обладающее анксиолитическим и антидепрессивным действием, на основе экстракта семян лотоса орехоносного (nelumbo nucifera)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства на основе экстракта семян Лотоса орехоносного (Nelumbo nucifera), обладающего анксиолитическим и антидепрессивным действием. Средство, обладающее анксиолитическим и антидепрессивным действием, получают путем...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002497538
Дата охранного документа: 10.11.2013
13.01.2017
№217.015.7a04

Секция сеялки

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению, в частности к сеялкам точного высева семян сельскохозяйственных культур. Секция сеялки включает четырехзвенную шарнирно-рычажную систему для соединения с рамой сеялки, корпус с семенным ящиком, сошник, высевающий аппарат, копирующее...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002599163
Дата охранного документа: 10.10.2016
13.01.2017
№217.015.89cd

Способ тестирования физиологического состояния осетровых рыб

Изобретение относится к ихтиологии и рыбоводству и представляет собой способ тестирования физиологического состояния осетровых рыб, включающий исследование сыворотки крови рыб, отличающийся тем, что сыворотку крови исследуют методом краевой дегидратаци в аналитических ячейках и производят...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002602662
Дата охранного документа: 20.11.2016
25.08.2017
№217.015.a1e7

Устройство для уборки тростника южный

Изобретение относится к сельскохозяйственному машиностроению, в частности к устройствам для скашивания стебельных растений и заготовке тростника южного.. Устройство для уборки тростника южный включает лодку, двигатель, коробку передач, режущий аппарат, привод и механизм управления. На боковой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002606911
Дата охранного документа: 10.01.2017
25.08.2017
№217.015.a70d

Ротационный мелиоративный рыхлитель

Изобретение относится к области сельскохозяйственного машиностроения, в частности к ротационным почвообрабатывающим орудиям для рыхления почвы с одновременным внесением в почву мелиорантов и удобрений. Ротационный мелиоративный рыхлитель содержит установленные посредством поводков блоки дисков...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002608067
Дата охранного документа: 12.01.2017
25.08.2017
№217.015.cf08

Способ коррекции плосковальгусной деформации стоп и устройство для его осуществления

Группа изобретений относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использована для коррекции походки у детей с диагнозом плосковальгусная деформация стоп. Система захвата и анализа движения в виде инструментально-диагностического комплекса состоит из компьютера с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002621120
Дата охранного документа: 31.05.2017
25.08.2017
№217.015.cf40

Способ получения масла из семян робинии псевдоакации и его состав

Изобретение относится к эфиромасличной промышленности. Масло семян робинии псевдоакации получено обработкой семян робинии псевдоакации, собранных в октябре, методом сверхкритической флюидной экстракции диоксидом углерода, при этом используют семена робинии псевдоакации, измельченные до частиц...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002621022
Дата охранного документа: 30.05.2017
25.08.2017
№217.015.cf5e

Устройство для уничтожения молоди саранчи

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Устройство для уничтожения саранчи представляет собой металлическую раму. На раме находится не менее трех быстровращающихся валов. На каждом валу вдоль диаметра на равном расстоянии закреплены отрезки лески. Для привлечения саранчи...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002621027
Дата охранного документа: 30.05.2017
+ добавить свой РИД