СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ВЛИЯНИЯ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ

Способ относится к медицине и ветеринарии, к таким разделам, как биология, гематология, гистология, микробиология. Может быть использован как метод выявления наличия или отсутствия любого воздействующего фактора физической природы на биологический объект, позволяющий ускорить диагностику заболевания и выбрать перспективный способ лечения.

Известно, что одним из последствий воздействия какого-либо фактора на животных являются изменения в лейкограмме. Общепринятая методика оценки гемограммы основана на подсчете процентного количества всех видов клеток крови. Такая методика не всегда является достаточно точной и достоверной в силу человеческого фактора при визуальном методе подсчета и/или может не давать точной клинической картины при использовании автоматического метода (например, подсчитывается количество лейкоцитов, но не отмечается, сколько из них изменены или находятся в стадии разрушения). Таким образом, не всегда удается определить начальную стадию заболевания, ответную реакцию организма на неинвазивное воздействие, облучение, лекарственные препараты.

Задачей изобретения является создание экспресс-метода для диагностики, прогнозирования, выявления наличия или отсутствия воздействующего фактора и определения степени ответной реакции организма на оказанное воздействие.

Нижеизложенные данные позволяют говорить об актуальности применения на практике фрактальных структур биологических объектов для анализа степени воздействия любого фактора.

Модели, основанные на таком понятии как «фрактальное множество», приобретают большую популярность для описания структур различной природы в разных областях естествознания. В начале 80-х гг. фрактальные структуры ("фракталы") проникли и в биологию, так как структуры, которые можно описать с помощью фрактальных множеств, в биологии встречаются достаточно часто. А значит, можно попробовать использовать понятие «фрактальной размерности» [1-4] для обнаружения результатов воздействия фактора любой этиологии на биологические объекты. «Фрактал» определяется как множество с определенным количеством элементов структуры, содержащихся в заданном объеме [5-7]. Описание любой фрактальной структуры в рамках фрактального множества корректно при условии достаточной удаленности пространственных масштабов от максимального и минимального масштабов существования структуры [8, 9]. Поэтому «фракталом» можно считать любую структуру, отдельные части которой подобны целой [10, 11].

Все существующие методы для определения фрактальной размерности основываются на ее классическом определении, данном Хаусдорфом. Часть этих методов достаточно просты, часть интересны только с математической точки зрения. Однако в медико-биологических областях применяются наиболее простые методы, в основе которых лежит подсчет числа элементов структуры в определенном объеме [12].

Для определения фрактальной размерности на практике используется алгоритм Грассберга-Прокаччиа [13], который в пространствах высокой размерности дает более точные результаты. Идея алгоритма заключается в получении зависимости вероятности попадания двух точек множества в ячейку определенного размера от размера ячейки с последующим определением наклона линейного участка этой зависимости. В процессе фрактального анализа изображение разделяется на секторы (ячейки) и подсчитывается количество секторов, покрывших все изображение. Повторение данного действия с использованием секторов разной размеренности позволяет построить логарифмическую функцию зависимости размера секторов (Ось O_X) от количества секторов, необходимых для покрытия всего изображения (Ось O_Y). Крутизна этой функции будет отображать размеренность сектора. Размеренность сектора считается максимально приближенной к фрактальной.

Известно, что программный пакет HarFA применяли для определения диаметра и количества микроорганизмов по анализу изображений их колоний (М. Vesela et al. / HarFA - Harmonic and Fractal Image Analysis (2002), pp. 21-22). Однако в известных источниках нет сведений о возможности определения наличия физического воздействия на живой организм в целом или на отдельно взятые ткани. Заявленный способ предполагает возможность проведения объективной цитоморфологической оценки состояния клеток крови в целом без выявления характерных особенностей каждой клетки в отдельности. Это позволит диагностировать состояние ткани после физио-, радио-, лучевой или рентгенотерапии, прогнозировать течение репаративного процесса, контролировать и корректировать в процессе лечения или обследования дозу воздействия в каждом отдельном случае, изменяя и подбирая ее индивидуально. В частности, способ позволяет определить наличие любого неинвазионного воздействия на живой организм, и прежде всего, воздействия, незаметного при субъективном обследовании мазка крови или любой другой ткани животного. Заявленный способ включает в себя в качестве объективной компоненты анализа данные числовых значений фрактальной размерности, полученные в ходе автоматического распознавания в заданном режиме. В ветеринарии и педиатрии это представляется особенно актуальным, так как пациенты не могут сами рассказать о самочувствии и ощущениях, а дозировка физических факторов всегда определяется «средней нормой» и часто не может быть подобрана/изменена для данного конкретного пациента по объективным причинам. Более того, воздействие физических факторов (радиация, перегрев, переохлаждение) зачастую вообще не ощущается и диагностируется лишь по отдаленным последствиям.

Также из уровня техники известен способ прогнозирования течения репаративного остеогенеза при хирургическом лечении ложных суставов длинных трубчатых костей (патент №2501526 от 24.10.2012). Данный способ взят в качестве ближайшего аналога. В указанном прототипе проводят измерение и оценку микроскопического поведения системы кровотока в исследуемой зоне микрососудистых сетей по показателям нелинейной динамики, а именно фрактальной размерности Хаусдорфа и корреляционной размерности фазового пространства, с целью оценки течения остеогенеза. Однако указанный аналог имеет принципиально иное назначение и не может быть осуществим без применения лазерной допплеровской флоуметрии.

В заявленном способе проводится объективная, более глубокая и быстрая экспресс-диагностика состояния клеток крови после любых физических факторов воздействия по изменению значения фрактальной размерности. С помощью заявленного способа можно анализировать уже готовые данные числового значения фрактальной размерности, полученные в ходе автоматического распознавания, что делает диагностику более быстрой. Фрактальную размерность биологических объектов определяли с помощью программного пакета «HarFA». Важной особенностью программы является способность самостоятельно преобразовывать цветное изображение в черно-белое, что является важным фактором для получения достоверных результатов фрактального анализа.

Метод фрактального анализа заключается в разделении изображения на секторы (ячейки) с последующим подсчетом количества секторов, потребовавшихся для покрытия всего изображения. Повторение данного действия с использованием секторов разной размеренности позволят построить логарифмическую функцию зависимости размера секторов (Ось O_X) и количества секторов, необходимых для покрытия всего изображения (Ось O_Y). Крутизна этой функции будет отображать размеренность сектора.

Размеренность сектора считается максимально приближенной к фрактальной размеренности.

Для реализации предлагаемого метода в пакете HarFa и обоснования выбора шага разбиения была проведена обработка более 100 фотографий и проведен их анализ с различным шагом разбиения: 0,1; 0,01 и 0,001.

В качестве обоснования выбора шага разбиения в данном описании приведены фотографии мазков крови с разрешением 96 пиксель/дюйм и их обработка (Рис. 1). Результат обработки фотографий при цветовой комбинации BW с шагом разбиения 0,1; 0,01 и 0,001 представлен на рисунке 1 (а-в).

Программа в автоматическом режиме устанавливает пороговые значения оттенка, освещенности и насыщенности цвета. После чего пиксели исследуемого объекта в соответствии с освещенностью и насыщенностью цвета переводятся в черно-белое изображение. Затем проходит подсчет: полностью черных секторов; секторов, которые охватывают границы черного объекта (например, содержат часть черного объекта); и секторов, которые содержат только белый фон. По полученным результатам строятся три функции (три уравнения регрессии) на графике с тремя фрактальными размерностями (диапазон фрактальной размерности), которые характеризуют свойства черных секторов, черно-белой границы и белого фона.

При апробации предлагаемого способа были проверены все цветовые комбинации в пакете HarFa: BW (серый), B+BW (темно-серый), W+BW (светло-серый), В (черный), W (белый). С целью обнаружения и дальнейшего обоснования наличия фактора воздействия на целостный организм выбрали цветовые комбинации BW, B+BW, W+BW в совокупности. Если в 2-х из 3-х рассматриваемых цветовых комбинаций отмечено изменение фрактальной размерности, это показывает наличие воздействия в целом на организм. Для определения присутствия воздействия различных факторов на клетки крови для анализа выбирали ту цветовую комбинацию, в которой все исследуемые клетки преобразованы программой в черный цвет (BW).

Сопоставление данных анализа лейкограмм с результатами фрактального анализа показывает большую информативность и точность для диагностики заболевания и реакции организма на любой воздействующий фактор. Если по лейкограмме не всегда видна клиническая картина заболевания на ранней стадии развития и не удается определить степень влияния неинвазионного воздействия на организм, то по фрактальной размерности и особенностям фрактального анализа такой вывод можно сделать более точно.

В процессе обработки фотографий мазков крови определяется коэффициент фрактальной размерности, который служит мерой хаотичности и неопределенности организации системы биологического объекта. Числовое значение данного показателя позволяет сделать вывод о наличии воздействующего фактора на организм как в целом, так и дифференцированно на отдельные клетки. Сравнение полученных результатов изменений клеток крови после физического воздействия (рентген, акустическое, температурное) подтверждает точность, объективность и информативность предлагаемого метода.

Таким образом, предлагаемый способ, включающий фрактальный анализ фотографий мазков крови, объективно выявляет изменения в клеточной структуре биологических объектов после различных воздействующих факторов, и, следовательно, фрактальный анализ позволяет получить важную и достоверную информацию для диагностики.

Техническим результатом заявленного изобретения является:

1) определение наличия любого воздействующего фактора на организм как в целом, так и дифференцированно на отдельные клетки;

2) дифференцированная диагностика ответной реакции организма на неинвазивное воздействие, а как следствие, вывод о том, какие клетки и каким образом реагируют на данное воздействие наиболее сильно или слабо;

3) определение любой стадии изменения клеточной структуры;

4) возможность проведения анализа клеточной структуры в динамике как в покое, так и при наличии воздействующего фактора;

5) предлагаемый способ универсален, так как подходит для исследования любого биологического объекта и определения наличия (отсутствия) фактора воздействия любой этиологии;

6) достаточно быстрое получение результатов обработки данных, не требующих больших затрат на биологический материал (достаточно одной капли крови) и затрат на стоимость обработки.

Способ позволяет достаточно быстро и точно получить результаты в процессе обработки фотографии мазка крови методом фрактального анализа; способ не зависит от субъективного фактора визуального анализа мазка крови и не требует больших финансовых затрат. Материалом для дальнейшей интерпретации являются получаемые графики с коэффициентом фрактальной размерности и представление результатов в виде дискретной или непрерывной форме отображения информации.

Указанный технический результат достигается за счет того, что после физического воздействия на клетки тканей животного проводят последовательно: забор крови, приготовление мазков, их окраску дифференциальными красителями, получение изображений приготовленных препаратов с помощью записывающего устройства, анализ полученных изображений в программе HarFA с построением уравнений регрессии, последующим выбором шага разбиения в диапазоне от 0,1 до 0,001, цветовых комбинаций BW, B+BW, W+BW, анализом вида гистограмм, амплитуды фрактального спектра и фрактальной размерности, при котором изменение ее абсолютного значения при одновременном отсутствии самоподобия гистограмм до и после физического воздействия говорит об изменении состояния биологического объекта.

Экспериментальная работа была выполнена на кафедре Информационных технологий, математики и физики МГАВМиБ. Забор крови у клинически здоровых кошек и лошадей осуществляли в ветеринарной клинике «МедВет». В качестве факторов физического воздействия на кровь животных in vitro были выбраны: рентген, бегущая акустическая (ультразвуковая) волна, высокая и низкая температура и их сочетанное действие. Обработку крови ультразвуком (УЗ) проводили аппаратом УЗТ-3.06 в импульсном режиме 10 мс, время воздействия 30 с, I_SATA - интенсивность от 0,05 Вт/см², частота 2,64 МГц. Делали мазки опыта и контроля и окрашивали по стандартной методике быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК. Полученные образцы просматривали под иммерсией в проходящем свете микроскопа «Mikmed-5» (объектив 100^x/1,25, окуляр 10^x/18) и фотографировали со средним разрешением от 72 до 300 пикселей/дюйм. Для исследования в пакете «HarFA» были отобраны сначала фотографии окрашенных мазков крови здоровой кошки в возрасте 6 лет. Контролем были фотографии окрашенного стекла, интактной крови и фотографии сыворотки крови. В качестве опытных образцов служили мазки, сделанные после УЗ-воздействия на кровь. Фотографии с разрешением 300 пиксель/дюйм чистого стекла (Рис. 2а); стекла с равномерно нанесенной на него краской (Рис. 2б) и стекла с равномерно нанесенной сывороткой крови (Рис. 2в) были проверены в программе «HarFA» (Рис. 3). Толщина нанесения контрольных образцов соответствовала толщине мазка крови. Окраска - Дифф-Квик стандартными красителями. Анализ полученных во всех цветовых комбинациях результатов показал, что программа "HarFA" определяет чистое стекло и стекло с нанесенными сывороткой или красителем в качестве однородных неклеточных структур, для которых гистограммы не могут быть построены. Соответствующие графики уравнений регрессии и значения фрактальной размерности определили выбор цветовой комбинации BW для работы с изображениями мазков крови. На рис. 3 (а, б, в) показан результат обработки фотографий неклеточных структур в программе «HarFA»: а) - чистого стекла; значение фрактальной размерности в цветовых комбинация BW и B+BW отсутствует; в "W+BW"- комбинации равно 2,00. Гисторгаммы в виде прямоугольников. Клеточных структур нет; б) - стекла с равномерно нанесенной на него краской; значение фрактальной размерности в цветовых комбинация BW и B+BW отсутствует; в "W+BW"- комбинации равно 2,00. Гисторгаммы в виде прямоугольников. Клеточных структур нет. в) - стекла с равномерным нанесением на него сыворотки крови. Толщина образца соответствует толщине мазка крови. Окраска Дифф-Квик стандартными красителями. Значение фрактальной размерности в цветовых комбинация BW и W+BW отсутствует; в "B+BW"- комбинации равно 2,00. Программа обнаружила наличие биологической жидкости при автоматической работе в цветовой комбинации B+BW. Гисторгаммы в виде прямоугольников. Клеточных структур нет.

Фотографии мазков крови кошки с разрешением 96 пиксель/дюйм для сравнения состояния нейтрофилов до и после влияния УЗ приведены на рисунке 4 (рис. 4А контроль: нормальный лимфоцит и сегментоядерный нейтрофил; рис. 4Б опыт: после УЗ, палочкоядерный нейтрофил: разрушние цитоплазмы и ядра; 4В до УЗ: нормальный и палочкоядерный нейтрофил; рис. 4Г после УЗ: лизис ядер лимфацитов). Результат обработки данных фотографий при цветовой комбинации BW (серый) с шагом фрактальной размерности 0,01 представлен на рисунке 5 (рис. 5А до УЗ, лимфоцит и палочкоядерный нейтрофил; рис. 5Б после УЗ, палочкоядерный нейтрофил; 5В после УЗ, лимфацит; сдвиг гистограммы (нижний ряд) и изменение фрактальной размерности (верхний ряд) графиков. Анализ уравнений регрессии и соответствующих графиков позволяет говорить о фрактальной структуре исследуемых биологических объектов. А сравнив гистограммы и значение фрактальной размерности D - по сдвигу гистограмм и изменению индекса D, - можно сделать вывод об отсутствии самоподобия исследуемых объектов до и после УЗ обработки, и как следствие, говорить об обнаружении наличия воздействия фактора на клетки.

Вторая часть исследований намеренно проводилась на крови здоровой взрослой лошади 8 лет (рис. 6. Форменные элементы крови лошади: 1. Контроль; после воздействия температуры нейтрофилы в группах (4, 5); после совместного действия температуры и УЗ: тромбоциты (2) и группа лейкоцитов (3) с дегенеративными изменениями).

Ветеринарам хорошо известно, что изменение гематологических и биохимических показателей у этого вида животных происходят крайне медленно, как бы «по инерции», существенно запаздывая во времени после воздействующего агента. Клиницисты говорят, что лошадь может быть клинически больна, а лейкограмма и биохимия остаются еще долгое время в норме. 100 мл крови лошади с введенным антикоагулянтом оставляли на 5 минут при низкой температуре t=-15°С. Визуально никаких изменений не регистрировали. Образцы крови, находящиеся при комнатной температуре t=20°С (контроль), выглядели так же, как и опытные. Затем сразу же делали мазки, окрашивали и фотографировали. Фотографии мазков крови с разрешением 72 пиксель/дюйм представлены на рисунке 7, где оси OY фрактальная размерность, ОХ - Ln (r)- логарифм расстояния между точками фазового пространства. Для объективной оценки наличия (или отсутствия) изменений в клетках крови был использован результат обработки данных фотографий при непрерывном варианте отображения информации в пакете «HarFA» (рис. 7: 1-5). Отчетливо видно, что фрактальный спектр графиков после комбинированного воздействия УЗ и температуры на образцы крови (рис. 7.2 и 7.3) существенно отличается как от контрольных препаратов (рис. 7.1), так и от мазков крови, обработанных каким-либо одним фактором (рис. 7.4; 7.5). Фрактальный спектр ответа биологических объектов на изучаемое воздействие выбранных физических факторов представляет собой спектр коэффициентов корреляции от логарифма расстояния между точками фазового пространства. По степени и характеру изменения амплитуды можно делать вывод о том, как клетки реагируют на данный тип воздействия.

Аналогичные представленным выше результаты были получены и для всех других отобранных физических факторов воздействия. Фрактальная размерность интактных клеток, вид гистограмм, фрактальный спектр графиков, их амплитуда резко отличались от соответствующих показателей обработанных образцов. Степень и характер выявляемых изменений напрямую зависели от увеличения дозы воздействия.

Заключение

В результате проведенной работы была отработана методика анализа фрактальной структуры биологических объектов, степени их реакции на воздействия различных физических факторов. С помощью анализа вида гистограмм, изменения фрактальной размерности и амплитуды фрактального спектра графиков можно судить о состоянии ткани.

Источники информации

1. Heinz, Otto Peitgen, Hartmut Jurgens, Deitmar Saupe Chaosand. Fractals - Springer Science, 2004. - 866 p.

2. Karl Becker, Michael Dofler Dynamical system and fractals - Cambridge. Cambridge university press, 1990. - 399 p.

3. Keneth Falconer Fractal Geometry/ Matematical Foundations and Applications. - Wiley, 2003. - 339 p.

4. Yuval Fisher Fractal Image Compression. Theory and Application. Springer - Verlag, 1994. - 433 p.

5. Андреев Ю.В. Хаотические процессоры / Ю.В. Андреев, А.С. Дмитриев, Д.А. Куминов // Успехи современной радиоэлектроники. - 1997. - №10. - С. 50-79.

6. Божокин, С.В. Фракталы и мультифракталы / С.В. Божокин, Д.А. Паршин. - Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2001. - 128 с.

7. Болтянский, В.Г., Ефремович, В.А. Наглядная топология / В.Г. Болтянский, В.А. Ефремович. - М.: Наука. Главная редакция физико-математической литературы, 1983. - 60 с.

8. Смирнов, Б.М. Физика фрактальных кластеров (Современные проблемы физики) / Б.М. Смирнов. - М.: Наука, Главная редакция физико-математической литературы, 1991. - 136 с.

9. Топорков, А. Озеленение компьютерного мира / А. Топорков // CHIP. 2002. август. С. 108-109.

10. Третьяков, Ю.Д. Дендриты, фракталы и материалы / Ю.Д. Третьяков // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - №11. - С. 96-102.

11. Шишкин, Е.И. Моделирование и анализ пространственных и временных фрактальных объектов / Е.И. Шишкин. - Екатеринбург: Уральский государственный университет, 2004. - 88 с.

12. Зубарев Д.Н. Неравновесная статистическая термодинамика, М. 1971. 417 с.

13. Grassberger P., Procaccia I. Measuring the strangeness of strange attractors. Physica D 9. 1983. P. 189-208.