×
29.12.2017
217.015.f79c

Результат интеллектуальной деятельности: Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская Ajuga turkestanica (Regel) Briq. в условиях in vitro - продуцент туркестерона

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к биотехнологии. Каллусный штамм живучки туркестанской Ajuga turkestanica (Regel) Briq. At21, обладающий способностью продуцировать в условиях in vitro туркестерон, депонирован во Всероссийской Коллекции культивируемых клеток высших растений под регистрационным номером 88. Штамм может быть использован для получения туркестерона. Изобретение обеспечивает высокий выход туркестерона. 2 ил.,2 табл.

Область применения

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, культивированию клеток растения живучки туркестанской, и может быть использовано для получения ценного биологически активного соединения - туркестерона, которое широко применяется в спортивной медицине и косметологии.

Уровень техники

Живучка туркестанская Ajuga turkestanica (Rgl.) Briq. многолетнее травянистое растение, относится к семейству Lamiaceae - эндемик Западного Тянь-Шаня и Гиссаро-Алая, произрастает на территории Узбекистана и Таджикистана, полукустарник семейства Яснотковые. Побеги живучки туркестанской применяются в спортивной медицине и косметологии, благодаря наличию в них специфического фитоэкдистероида - туркестерона, который по анаболическому эффекту не уступает синтетическим препаратам, не являясь при этом допингом. Туркестерон не токсичен, проявляет тонизирующее действие, стимулирует работоспособность, предохраняет от негативного воздействия различных стрессорных факторов. Живучка туркестанская является источником фитоэкдистероидов. Вид продуцирует экдистерон, аюгалактон, аюгастерон, циастерон, 22-ацетилциастерон, туркестерон [Б.З. Усманов, М.Б. Горовиц, Н.К. Абубакиров. Фитоэкдизоны Ajuga turkestanica V. // Химия природных соединений. - 1977. - №5. - Р. 710-714].

Для соединений установлен широкий спектр биологической активности при различных экспериментальных патологических состояниях [З. Саатов, В.Н. Сыров, А.У. Маматханов, Н.К. Абубакиров. Фитоэкдистероиды растений рода Ajuga и их биологическая активность. 1. Распространение и химические структуры выделенных соединений // Химия природных соединений. - 1994. - №2. - С. 152]. Сумма экдистероидов растения обладает гипогликемической активностью [Т.А. Кутепова, В.Н. Сыров, З.А. Хушбактова, З. Саатов. Кутепова Т.А. Гипогликемическая активностьсуммы экдистероидов из Ajuga turkestanica. // Химико фармацевтический журнал, - Т. 35 - №11 - С. 24-25].

Экдистерон и туркестерон оказывают благотворное действие на энергетические реакции организма [Ташмухамедова М.А., К.Г. Алматов, З.А. Хушбактова, В.Н. Сыров, А.А. Абидов. Функционирование митохондрий печени крыс при введении им фитоэкдистероидов и неробола. // Узбекский биологический журнал, - 1987 - т. 3 - с. 3].

Также эти соединения обладают способностью блокировать процессы свободнорадикального окисления. Растение является среднеазиатским эндемиком с узким ареалом распространения. В связи с этим большой интерес представляет разработка биотехнологического способа получения экдистероидов с использованием культур клеток Ajuga turkestanica.

Ранее было установлено, что полученная культура тканей и клеток Ajuga turkestanica сохраняет биосинтез доминирующих в растении экдистероидов: экдистерона (20Е) и туркестерона [С.В. Лев, Р.П. Закирова, З. Саатов, М.Б. Горовиц, Н.К. Абубакиров. Экдистероиды культуры тканей и клеток Ajuga turkestanica. II Химия природных соединений-1990. - №1. - С. 51-52].

Содержание веществ в первые циклы выращивания составляло соответственно 0,12% и 0,032% на сухой вес. В процессе длительного культивирования биосинтетическая активность каллусной культуры существенно снижалась [Р.П. Закирова М.Р. Якубова. Продуктивность каллусной ткани Ajuga turkestanica при многолетнем культивировании. // Химия природных соединений. - 2002. - №4. - С. 298]. Как правило, содержание вторичных соединений в условиях in vitro на порядок ниже и беднее по составу, чем в интактном растении и часто снижается при культивировании в течение нескольких лет. Была показана возможность повышения синтеза туркестерона путем индукции морфогенеза, но повышенный синтез не был стабилен и сохранялся на срок до 11-12 циклов субкулитивирования [Р.П. Закирова, И.Т. Абдукадыров, М.Р. Якубова Возможность повышения содержания экдистероидов в каллусных и суспензионных культурах клеток Ajuga turkestanica за счет использования индуцированного морфогенеза. // Биотехнология. 2012. №3. С. 44-47]. Также для повышения синтеза туркестерона добавляли элиситоры, либо проводили трансформацию с помощью агробактерий [Cheng, D. M., Yousef, G. G., Grace, M., Rogers, R. В., & Lila, M. A. (2007). In vitro production of phytoecdysteroids from Ajuga turkestanica II The FASEB Journal - V. 21(6) - A1079].

Таким образом, в литературе не было найдено работ по получению культуры клеток живучки туркестанской, обладающей стабильным и относительно высоким синтезом туркестерон в клетках самого штамма, а также высокими ростовыми характеристиками.

Задача изобретения

Задача изобретения - создание нового каллусного штамма живучки туркестанской (Ajuga turkestanica (Regel) Briq.), который является продуцентом туркестерона, со стабильными ростовыми параметрами, высокой жизнеспособностью, устойчивым синтезом туркестерона в процессе культивирования и отсутствием сезонной зависимости его получения.

Решение задачи

Эта задача была решена созданием нового каллусного штамма живучки туркестанской в условиях in vitro, депонированного в Российскую Коллекцию Культивируемых Клеток Высших Растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук под обозначением At21 №88, который является продуцентом туркестерона.

Новизна изобретения

Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен штамм растения живучка туркестанская - продуцент туркестерона с высокими ростовыми характеристиками и стабильным относительно высоким синтезом туркестерона, по сравнению с описанными в литературе аналогами, сохраняющимся без дополнительных методов индукции синтеза.

Сущность изобретения

По мнению авторов, предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу взяты листья, черешки и завязи растений живучки туркестанской, привезенных из горных районов Узбекистана, которые стерилизуют и помещают в жидкую питательную среду в качестве эксплантов. В результате был создан новый каллусный штамм - продуцент туркестерона.

Перечень иллюстративных материалов

Фигура 1. Ростовые характеристики культуры клеток живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Фигура 2. ВЭЖХ-хроматограмма анализа содержания туркестерона в биомассе культуры клеток живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Таблица 1. Состав сред для инициации каллусообразования и последующего выращивания каллусов живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Таблица 2. Ростовые параметры культуры клеток живучки туркестанской Ajuga turkestanica.

Реализация изобретения

Культуру клеток живучки туркестанской получают из интактных растений, используя в качестве эксплантов листья, стебли и завязи. Образцы растений для получения были привезены из горных районов Узбекистана. Растительные образцы промывают проточной водой, после чего выдерживают 20 сек. в 96% этаноле. Потом промывают стерильной дистиллированной водой. Затем растительные образцы помещают в раствор диацида на 4 мин., промывают стерильной дистиллированной водой, снова помещают в раствор диацида на 4 мин, после чего 3-кратно промывают в дистиллированной стерильной воде. Завязи, листовые пластинки и стебли подсекают скальпелем, предварительно разрезав на сегменты длиной 5 мм, и используют в качестве эксплантов, которые помещают на агаризованную питательную среду. Для инициации каллусообразования живучки туркестанской используют агаризованную среду Гамборга без гормонов (табл.1, среда 1), через неделю помещают на среду Гамборга с добавлением 4 мг/л 2,4-дихлорфеноскиуксусной кислоты (2,4-Д) и 0,1 мг/л кинетина (табл.1, среда 2), на которой культуры выращивают в течение 1 недели. Затем полученные каллусные культуры переводят на среду с 2 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л кинетина (табл.1, среда 3), на которой проводят 2 цикла субкультивирования по 2 недели. Для последующего выращивания используют среду с 1 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК) и 0,05 мг/л бензиламинопурина (БАП) (табл. 1, среда 4).

Культивирование проводят в темноте, при 26±1°C, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри диаметром 60 мм (10 среды в чашке). Цикл субкультивирования составляет 4 недели. При пересеве каллус делят на 3-5 частей, в зависимости от ростовых параметров культуры на данный момент.

Полученные каллусные культуры клеток выращивают в течение более 20 циклов. В процессе культивирования определяют ростовые и биосинтетические характеристики.

Штамм Ajuga turkestanica (Regel) Briq. под обозначением At21 №88 обладает следующими признаками.

Культуральные признаки: биомасса клеток гомогенная, светло-кремовой окраски.

Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по числу клеток, по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы клетки отделяют от среды культивирования, промывают водой на бумажных фильтрах на вакуумном насосе и взвешивают. Сухую биомассу клеток получают после высушивания образцов при 25°±1С в потоке теплого воздуха. Жизнеспособность оценивают по проценту неокрашенных клеток в 0,1% растворе феносафранина.

В результате постоянного мониторинга состояния культур установлено, что жизнеспособность суспензионных культур стабильно держится на 90-97%. Ростовые характеристики культуры клеток живучки туркестанской представлены на фиг.1.

При анализе представленных кривых роста следует отметить отсутствие лаг-фазы. Начало экспоненциальной фазы роста отмечено на 14 сутки субкультивирвания. Замедление роста на 29 сутки культивирования позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры рассчитывали по сухому весу биомассы. Результаты представлены в табл.2.

Для определения содержания туркестерона навеску лиофилизированной биомассы культуры клеток подвергают кислотному гидролизу в 1.0 н. растворе соляной кислоты. Реакцию проводят в течение 14 часов при температуре 85оС.После гидролиза содержимое колбы переносят в делительную воронку, разбавляют водой и нейтрализуют 1.0 н. NH4OH. Экдистероиды исчерпывающе экстрагируют этилацетатом, растворитель отгоняют на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1 мл смеси ацетонитрил-вода (27:73, по объему). Полученный раствор фильтруют через нейлоновый фильтр с порами 0,2 мкм (Acrodisc, США) и используют для ВЭЖХ анализа.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводят на приборе Agilent 1200 (Agilent Technologies, США). Пробу объемом 20 мкл наносят на колонку Zorbax С18 (250×4,6 мм, 5 мкм). Скорость подвижной фазы 0,5 мл/мин. В качестве компонентов подвижной фазы используют ацетонитрил и воду. Элюирование осуществляют в изократическом режиме при соотношении ацетонитрил:вода 27:73, по объему. Детектирование осуществляют по поглощению при 247 нм. Количественное содержание туркестерона определяют методом внешней калибровки по стандарту туркестерона.

Результаты изобретения

Как видно из таблицы 2, штамм обладает высокой жизнеспособностью - около 95% при стабильных ростовых характеристиках. В штамме At21 №88 культуры клеток живучки туркестанской был обнаружен туркестерон, содержание которого в сухой биомассе достигало 0,05%.

В результате изобретения был показан способ получения каллусной культуры клеток живучки туркестанской, обладающей высокими ростовыми и относительно высоким устойчивым синтезом туркестерона в процессе культивирования, превышающими таковые у мировых аналогов. Удобство такого способа получения туркестерона состоит в отсутствии сезонной зависимости их производства.

Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская Ajuga turkestanica (Regel) Briq., депонированный во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений под регистрационным номером 88, в условиях in vitro - продуцент туркестерона.
Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская Ajuga turkestanica (Regel) Briq. в условиях in vitro - продуцент туркестерона
Каллусный штамм культивируемых клеток растения живучка туркестанская Ajuga turkestanica (Regel) Briq. в условиях in vitro - продуцент туркестерона
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-7 of 7 items.
10.02.2014
№216.012.9d37

Способ получения форм картофеля сорта скороплодный in vitro, устойчивых к температурным стрессам и к возбудителю фитофтороза

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии, в частности к способам получения трансгенных форм картофеля in vitro сорта Скороплодный, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам. Изобретение представляет собой создание нового способа получения форм картофеля in vitro...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002505955
Дата охранного документа: 10.02.2014
27.07.2014
№216.012.e50a

Способ получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза

(57) Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Листовые экспланты, вычлененные из тридцатидневных асептических растений исходных сортов, выращенных в сосудах 1 л, помещают в чашки Петри с жидкой средой определенного состава и прединкубируют, кокультивируют и культивируют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002524424
Дата охранного документа: 27.07.2014
20.02.2016
№216.014.e8c2

Фосфолипидная композиция экдистена, обладающая адаптогенной и гепатопротекторной активностью

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к фосфолипидной композиции экдистена, обладающей адаптогенной и гепатопротекторной активностью, в виде фосфолипидных наночастиц размером 10-30 нм, включающей фосфатидилхолин, экдистен и мальтозу при определенном соотношении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002575561
Дата охранного документа: 20.02.2016
25.08.2017
№217.015.b85d

Сильный растительный промотор pro-smamp2 из сорного растения stellaria media

Изобретение относится к области биологии, в частности молекулярной биологии и генетической инженерии. В качестве настоящего изобретения предложен фрагмент ДНК, обеспечивающий высокий уровень экспрессии генов в растениях и представляющий собой промотор гена pro-SmAMP2, соединенный с его...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002615456
Дата охранного документа: 04.04.2017
25.08.2017
№217.015.c243

Суспензионный штамм культивируемых клеток растения якорцы стелющиеся (tribulus terrestris l.) под обозначением tter8 n81 в условиях in vitro - продуцент стероидных гликозидов

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой получение суспензионного штамма культивируемых клеток растения якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) в условиях in vitro, депонированного в Российскую Коллекцию Культивируемых Клеток Высших Растений при...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617956
Дата охранного документа: 28.04.2017
19.01.2018
№218.016.04f2

Способ получения синтетической cg-богатой генетической последовательности и ее использование в растениях

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения синтетической CG-богатой генетической последовательности для синтеза гетерологичных белков. Изобретение позволяет получать более высокий уровень экспрессии мРНК репортерного гена. 8 ил., 1 пр.
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002630650
Дата охранного документа: 11.09.2017
14.03.2020
№220.018.0c14

Двигатель внутреннего сгорания

Изобретение относится к машиностроению и предназначено для преобразования возвратно-поступательного движения оппозитных поршней во вращение маховика. Двигатель внутреннего сгорания содержит корпус цилиндров 1, корпус картера 2, цилиндры 3, общий шток цилиндров 4, вал маховика 5, маховик 6,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002716551
Дата охранного документа: 12.03.2020
Showing 1-10 of 12 items.
27.07.2014
№216.012.e50a

Способ получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза

(57) Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Листовые экспланты, вычлененные из тридцатидневных асептических растений исходных сортов, выращенных в сосудах 1 л, помещают в чашки Петри с жидкой средой определенного состава и прединкубируют, кокультивируют и культивируют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002524424
Дата охранного документа: 27.07.2014
20.02.2016
№216.014.e8c2

Фосфолипидная композиция экдистена, обладающая адаптогенной и гепатопротекторной активностью

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к фосфолипидной композиции экдистена, обладающей адаптогенной и гепатопротекторной активностью, в виде фосфолипидных наночастиц размером 10-30 нм, включающей фосфатидилхолин, экдистен и мальтозу при определенном соотношении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002575561
Дата охранного документа: 20.02.2016
25.08.2017
№217.015.b85d

Сильный растительный промотор pro-smamp2 из сорного растения stellaria media

Изобретение относится к области биологии, в частности молекулярной биологии и генетической инженерии. В качестве настоящего изобретения предложен фрагмент ДНК, обеспечивающий высокий уровень экспрессии генов в растениях и представляющий собой промотор гена pro-SmAMP2, соединенный с его...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002615456
Дата охранного документа: 04.04.2017
25.08.2017
№217.015.c243

Суспензионный штамм культивируемых клеток растения якорцы стелющиеся (tribulus terrestris l.) под обозначением tter8 n81 в условиях in vitro - продуцент стероидных гликозидов

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой получение суспензионного штамма культивируемых клеток растения якорцев стелющихся (Tribulus terrestris L.) в условиях in vitro, депонированного в Российскую Коллекцию Культивируемых Клеток Высших Растений при...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617956
Дата охранного документа: 28.04.2017
19.01.2018
№218.016.04f2

Способ получения синтетической cg-богатой генетической последовательности и ее использование в растениях

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения синтетической CG-богатой генетической последовательности для синтеза гетерологичных белков. Изобретение позволяет получать более высокий уровень экспрессии мРНК репортерного гена. 8 ил., 1 пр.
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002630650
Дата охранного документа: 11.09.2017
10.05.2018
№218.016.3be2

Штамм суспензионной культуры клеток растения диоскорея дельтовидная (dioscorea deltoidea wall) под обозначением ифр-дм-05-pro n89 - продуцент протодиосцина

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм суспензионной культуры клеток растения диоскорея дельтовидная (Dioscorea deltoidea Wall) под обозначением ИФР-ДМ-05-pro №89, депонированный в Российскую коллекцию высших растений при Федеральном государственном...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002647760
Дата охранного документа: 19.03.2018
01.03.2019
№219.016.c9b7

Штамм культивированных клеток растений ajuga reptans l.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности. Штамм Е IVk суспензионной культуры растительных клеток Ajuga reptans L. N 63 - продуцент экдистероидов. Изобретение позволяет эффективно получить экдистероиды. 2 ил.
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002296154
Дата охранного документа: 27.03.2007
01.03.2019
№219.016.c9ba

Штамм культивированных клеток растений serratula coronata l.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности. Штамм GI 1.1 суспензионной культуры растительных клеток Serratula coronata L. N 64 - продуцент экдистероидов. Изобретение позволяет эффективно получить экдистероиды. 2 ил.
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002296155
Дата охранного документа: 27.03.2007
27.04.2019
№219.017.3bd3

Штамм суспензионной культуры клеток растения тис валлиха (taxus wallichiana zucc.), депонированный в российской коллекции культивируемых клеток высших растений под обозначением и регистрационным n 90 - продуцент таксоидов

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм суспензионной культуры клеток растения тис валлиха (Taxus wallichiana Zucc.), депонированный во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002685874
Дата охранного документа: 23.04.2019
14.03.2020
№220.018.0c14

Двигатель внутреннего сгорания

Изобретение относится к машиностроению и предназначено для преобразования возвратно-поступательного движения оппозитных поршней во вращение маховика. Двигатель внутреннего сгорания содержит корпус цилиндров 1, корпус картера 2, цилиндры 3, общий шток цилиндров 4, вал маховика 5, маховик 6,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002716551
Дата охранного документа: 12.03.2020
+ добавить свой РИД