КОННЕКТОР И УСТАНОВКА С ЭТИМ КОННЕКТОРОМ ДЛЯ ХРОНИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ ЭЛЕКТРОВОЗБУДИМЫХ КЛЕТОК

Предлагаемая группа изобретений относится к лабораторному оборудованию для проведения исследований в области медицины и физиологии, касается коннектора и установки с этим коннектором для хронической стимуляции электровозбудимых клеток, которая может быть использована в электрофизиологических исследованиях для хронической электрической стимуляции электровозбудимых клеток (например, культуры нейронональных клеток), выращиваемых на микроэлектродной матрице (МЭМ).

Известен макет физиологической микросенсорной системы на основе нервных клеток (RU 128761 U1, кл. G09B 23/28, опубл. 27.05.2013 г.), служащей для регистрации активности нейрональных культур. Система содержит микроскоп с помещенной в него матрицей с культурой нервных клеток, блок регистрации генерируемой нервными клетками электрической активности и генератор стимулирующих импульсов. Микроскоп выполнен с возможностью фотографической цифровой регистрации флуоресцентного свечения нервных клеток, а матрица с культурой нервных клеток связана с упомянутым блоком регистрации и генератором стимулирующих импульсов.

Данное устройство предусматривает стимуляцию нейрональной культуры генератором стимулирующих импульсов. В качестве стимулятора используется установка производства компании Multichannel Systems (Германия). Установка управляется посредством рабочей станции при помощи пакета программного обеспечения, обеспечивающего регистрацию электрической активности клеток, выбор электродов и управление стимуляцией, генерацию и загрузку паттернов стимуляции, а также управление термостатом, в который помещена культура клеток.

Указанная система может быть реализована для временной стимуляции клеток, в пределах 10 минут, в течение которых клеточная культура может находиться без постоянной подачи 5% СО₂. Кроме того, даже в условиях реализации постоянной подачи газа для длительной стимуляции клеток, такая система предполагает постоянное использование установки генерации и детекции импульсов от Multichannel System и, как следствие, невозможность использования ее для других экспериментов в течение длительного времени, что было бы непрактичным для одной лаборатории.

В задачу группы изобретений положено создание нового коннектора и новой установки с ним для хронической стимуляции электровозбудимых клеток.

Техническим результатом от использования группы изобретений является повышение удобства использования, возможность управления стимуляцией нейрональных электровозбудимых клеток в пригодных для электроники условиях эксплуатации без вмешательства в стерильные условия развития клеток.

Поставленная задача достигается тем, что коннектор содержит основание и крышку, выполненные с возможностью герметичного соединения друг с другом, микроэлектродную матрицу, выполненную в виде массива из металлических микроэлектродов, сформированных на подложке, с чашей для культуры клеток и с контактными площадками по периметру, соединенными посредством токопроводящих дорожек с микроэлектродами, плату с отверстием, с выступом, с прижимными пружинными контактами, соединенными токопроводящими дорожками, при этом основание выполнено с отверстием для выступа платы, крышка выполнена с отверстием, покрытым фильтрующей мембраной, микроэлектродная матрица установлена на дно основания, над микроэлектродной матрицей установлена плата, причем чаша с культурой клеток выполнена выступающей сквозь отверстие платы, выступ платы выполнен выходящим за периметр основания через отверстие для выступа платы и соединен с внешним разъемом, прижимные пружинные контакты платы расположены соосно контактным площадкам микроэлектродной матрицы с возможностью взаимодействия с ними; основание выполнено с углублением, с внутренними выступами и с прозрачным окном на дне; 56 электродов микроэлектродной матрицы выполнены диаметром 50 мкм, являются измерительными и предназначены для регистрации электрофизиологической активности нейрональной культуры, а 4 электрода выполнены диаметром 500 мкм и используются для хронической стимуляции клеток; импеданс измерительных электродов не превышает 500 кОм; токопроводящие дорожки и вся поверхность микроэлектродной матрицы, которая контактирует с клетками, кроме микроэлектродов, покрыты полимером SU-8 (MicroChem, США) толщиной 2-3 мкм.

Поставленная задача достигается также тем, что установка для хронической стимуляции нейрональных электровозбудимых клеток содержит стимулятор с разъемом на выходе для проводных соединений, коннектор, помещенный в инкубатор, при этом коннектор содержит основание и крышку, выполненные с возможностью герметичного соединения друг с другом, микроэлектродную матрицу, выполненную в виде массива из металлических микроэлектродов, сформированных на подложке, с чашей для культуры клеток и с контактными площадками по периметру, соединенными посредством токопроводящих дорожек с микроэлектродами, плату с отверстием, с выступом, с прижимными пружинными контактами, соединенными токопроводящими дорожками, при этом основание выполнено с отверстием для выступа платы, крышка выполнена с отверстием, покрытым фильтрующей мембраной, микроэлектродная матрица установлена на дно основания, над микроэлектродной матрицей установлена плата, причем чаша с культурой клеток выполнена выступающей сквозь отверстие платы, выступ платы выполнен выходящим за периметр основания через отверстие для выступа платы и соединен с внешним разъемом, прижимные пружинные контакты платы расположены соосно контактным площадкам микроэлектродной матрицы с возможностью взаимодействия с ними, стимулятор соединен с коннектором и с микроэлектродной матрицей посредством подключения шлейфа из проводных соединений к разъему стимуллятора и к внешнему разъему коннектора; стимулятор генерирует импульсы с регулируемой амплитудой 600-800 мкВ и фиксированной длительностью 500 мкс при входном триггер-сигнале амплитудой 5 В ; основание коннектора выполнено с углублением, с внутренними выступами и с прозрачным окном на дне; 56 электродов микроэлектродной матрицы выполнены диаметром 30 мкм, являются измерительными и предназначены для регистрации электрофизиологической активности нейрональной культуры, а 4 электрода выполнены диаметром 500 мкм и используется для хронической стимуляции клеток; импеданс измерительных электродов не превышает 500 кОм; токопроводящие дорожки и вся поверхность микроэлектродной матрицы, которая контактирует с клетками, кроме микроэлектродов, покрыты полимером SU - 8 (MicroChem, США) толщиной 2-3 мкм; используют шлейф из четырех проводных соединений длиной от 100 см.

На фиг. 1 представлена установка для хронической стимуляции нейрональных электровозбудимых клеток.

На фиг. 2 представлен коннектор установки для хронической стимуляции нейрональных электровозбудимых клеток, где: 2а - коннектор в собранном виде; 2б - коннектор в разобранном виде; 2в - плата коннектора.

На фиг. 3 представлены фотографии нейронов около микроэлектродов матрицы.

На фиг. 4 представлен растр активности электродов матрицы на 4 день in vitro до хронической стимуляции. Каждая точка - время возникновения спайки на каждом микроэлектроде.

На фиг. 5 представлен растр активности электродов матрицы на 15 день in vitro, хроническая стимуляция проводилась на протяжении 11 дней.

Конструктивно установка на фиг. 1 содержит:

1 - стимулятор;

2 - коннектор;

3 - инкубатор.

Конструктивно коннектор 2 на фиг. 2 содержит:

4 - основание;

5 - отверстие для выступа платы;

6 - прозрачное окно;

7 - крышку;

8 - отверстие с фильтрующей мембраной;

9 - микроэлектродную матрицу;

10 - чашу;

11 - контактные площадки;

12 - токопроводящие дорожки микроэлектродной матрицы;

13 - плату;

14 - отверстие платы;

15 - выступ;

16 - прижимные пружинные контакты для соединения с микроэлектродной матрицей;

17 - токопроводящие дорожки платы;

18 - внешний разъем.

Стимулятор 1 выполнен с разъемом на выходе для проводных соединений.

Коннектор 2 помещен в инкубатор 3.

Основание 4 коннектора 2 выполнено с отверстием 5 для выступа 15 платы 13.

Крышка 7 выполнена с отверстием 8, покрытым фильтрующей мембраной,

Основание 4 и крышка 7 выполнены с возможностью герметичного соединения друг с другом.

Микроэлектродная матрица 9 выполнена в виде массива из металлических микроэлектродов, сформированных на подложке, с чашей 10 для культуры клеток на питательной среде и с контактными площадками 11 по периметру, соединенными посредством токопроводящих дорожек 12 с микроэлектродами.

Плата 13 выполнена с отверстием 14, с выступом 15, с прижимными пружинными контактами 16, соединенными токопроводящими дорожками 17 с разъемом 18.

Микроэлектродная матрица 9 установлена на дно основания 4.

Над микроэлектродной матрицей 9 установлена плата 13 таким образом, что сквозь отверстие 14 выступает чаша 10 с культурой клеток на питательной среде, выступ 15 выходит за периметр основания 4 через отверстие 5 и соединен с внешним разъемом 18, прижимные пружинные контакты 16 расположены соосно контактным площадкам 11 микроэлектродной матрицы 9 с возможностью взаимодействия с ними.

Стимулятор 1 соединен с коннектором 2 и с микроэлектродной матрицей 9 посредством подключения шлейфа из проводников к разъему на выходе стимуллятора 1 и к внешнему разъему 18 коннектора 2.

Основание 4 коннектора 2 может быть выполнено с углублением, с отверстием 5 для выступа 15 платы 13 и с прозрачным окном на дне 6.

Стимулятор 1 генерирует импульсы, например, с регулируемой амплитудой 600-800 мкВ и фиксированной длительностью 500 мкс при входном триггер-сигнале амплитудой 5 В.

Шлейф выполнен, например, из четырех проводных соединений длиной от 100 см.

Например, 56 электродов микроэлектродной матрицы выполнены диаметром 50 мкм, являются измерительными и предназначены для регистрации электрофизиологической активности нейрональной культуры, а 4 электрода выполнены диаметром 500 мкм и используется для хронической стимуляции клеток. Электроды для регистрации также могут быть использованы для стимуляции, но с меньшей эффективностью.

Импеданс измерительных электродов не прекоторевышает 500 кОм.

Токопроводящие дорожки 12 и вся поверхность микроэлектродной матрицы 9, которая контактирует с клетками, кроме микроэлектродов, покрыты полимером SU-8 (MicroChem, США) толщиной 2-3 мкм.

Сборку предлагаемой установки осуществляют следующим образом.

Изготавливают стимулятор 1 с разъемом на выходе для нескольких проводных соединений, например четырех. Количество проводных соединений должно соответствовать количеству стимулируемых электродов на микроэлектродной матрице 9.

Шлейф выполняют, например, длиной от 100 см. Длина шлейфа должна быть достаточна для изоляции стимулятора 1 и коннектора 2 друг от друга через инкубатор 3.

Изготавливают коннектор 2 в виде контейнера, например, из пластика с основанием 4, с крышкой 5. Основание 4 выполняют с отверстием 5 для выступа 15 платы 13, а также, например, с углублением, с внутренними выступами и с прозрачным окном 6 на дне основания 4. Крышку 7 выполняют с отверстием 8. Отверстие 8 покрывают фильтрующей мембраной, пропускающей газ СО₂, необходимый для жизнеобеспечения клеток.

Используют микроэлектродную матрицу 9, изготовленную в виде массива из металлических микроэлектродов, сформированных на стеклянной или кремниевой подложке, с циллиндрической чашей 10 по центру и контактными площадками 11 по периметру, соединенными с микроэлектродами посредством токопроводящих дорожек 12.

Например, используют микроэлектродную матрицу 9, изготовленную в виде массива из 60 золотых микроэлектродов с 60 контактными площадками по периметру. При этом часть, например 56, микроэлектродов выполняют диаметром 50 мкм и используют для регистрации электрофизиологической активности нейрональной культуры, а остальные, например 4 микроэлектрода, выполняют диаметром 500 мкм и используют для хронической стимуляции клеток.

Токопроводящие дорожки 12 и всю поверхность микроэлектродной матрицы 9, которая контактирует с клетками, кроме микроэлектродов, покрывают, например, полимером SU-8 (MicroChem, США) толщиной 2-3 мкм, обеспечивая их изоляцию от контакта с клеточной средой.

Культуры нейронональных клеток на питательной среде помещают на циллиндрическую чашу 10 микроэлектродной матрицы 9 непосредственно перед установкой микроэлектродной матрицы 9 в коннектор 2.

Изготавливают плату 13 с отверстием 14, с выступом 15, с прижимными пружинными контактами 16 для соединения с микроэлектродной матрицей 9 и с внешним разъемом 18, соединенными токопроводящими дорожками 17.

Внешний разъем 18 выполняют, например, из стандартной штыревой вилки с расстоянием 2.54 мм между штырьками.

На дно основания 4 устанавливают микроэлектродную матрицу 5 с культурами нейрональных клеток на питательной среде на чаше 10. Плату 13 устанавливают, например, на внутренние выступы основания 4 таким образом, чтобы сквозь отверстие 14 выступала чаша 10 микроэлектродной матрицы 9, выступ 15 выходил за периметр основания 4 через отверстие 5, прижимные пружинные контакты 16 были расположены над контактными площадками 11 микроэлектродной матрицы 9 и взаимодействовали с ними. Затем герметично соединяют основание 4 с крышкой 7 коннектора 2. Для этого место соединения основания 4 с крышкой 7 коннектора 2, а также отверстие 5, которое контактирует с выступом 15 платы 13, покрывают силиконом для обеспечения герметичности и предотвращения попадания на клетки матрицы 9 бактерий и спор грибов. Выступ 15 платы 13 соединяют с внешним разъемом 18, например, с помощью пайки. При этом внешний разъем 18 оставляют снаружи коннектора 2 для соединения со шлейфом проводных соединений.

Для осуществления хронической стиммулляции нейрональных электровозбудимых клеток коннектор 2 помещают в стандартный инкубатор 3, в котором поддерживают постоянную температуру в 35°С и 100% влажность. Используют инкубатор 3 с отверстием для проведения шлейфа, которое герметично закрывают. Отверстие в инкубаторе 3, через которое прокладывают шлейф, герметично закрывают, с помощью мягкой пробки из полимера так, чтобы не повредить шлейф и предотвратить утечку газа из инкубатора 3.

Соединяют стимулятор 1 с коннектором 2 путем подключения шлейфа из проводных соединений к разъему стимулятора 1 и к внешнему разъему 18 коннектора 2.

Хроническую стимуляцию электровозбудимых клеток с помощью предлагаемой установки осуществляют следующим образом.

С помощью стимулятора 1 генерируют последовательность биполярных электрофизиологических импульсов с регулируемой амплитудой 600-800 мкВ и фиксированной длительностью 500 мкс по заданному протоколу. Например, генерируют последовательность, состоящую из серии 5 импульсов с межимпульсным интервалом 20 мс и интервалом между сериями 200 мс.

Передачу генерируемых биполярных стимулов от стимулятора 1 на микроэлектродную матрицу 9 осуществляют посредством шлейфа, например, из четырех проводников, подключенного к разъему на выходе стимулятора 1 с одной стороны и к внешнему разъему 18 коннектора 2 с другой стороны. При этом генерируемые биполярные стимулы передаются через прижимные пружинные контакты 16 по токопроводящим дорожкам 17 платы 13 на контактные площадки 11 микроэлектродной матрицы 9 к культурам электровозбудимых клеток.

Коннектор 2 в собранном виде может быть установлен в микроскоп. При этом прозрачное окно 6, выполненное, например, на дне основания 4 коннектора 2, позволяет осуществлять наблюдения за культурой клеток через микроскоп.

Коннектор 2 также может быть использован для регистрации электрической активности электровозбудимых клеток, например, совместно с усилителем.

Стимулятор 1 представляет собой отдельную установку, которую можно использовать для длительной стимуляции, не затрагивая другие эксперименты. К тому же, от одного стимулятора 1 одновременно можно подавать электрические импульсы на несколько коннекторов 2, что увеличивает эффективность всей установки. Например, стимулятор 1 может быть соединен с пятью коннекторами одновременно, при этом непрерывная стимуляция возможна до 5 дней при использовании микроэлектродоной матрицы с сопротивлением электродов порядка нескольких сотен кОм и при использовании стимулятора с питанием на четырех аккумуляторных батареях класса АА (номинальное напряжение 1,2 В, емкость 2000 мА/ч), после чего батареи должны быть перезаряжены. Коннектор 2 во время проведения хронической стимуляции установлен в инкубаторе 3, поэтому нейрональная культура не требует дополнительного обогрева и подачи СО₂.

Покрытие электропроводящих дорожек 12 и всей поверхности микроэлектродной матрицы 9, которая контактирует с клетками, кроме микроэлектродов, полимером SU - 8 (MicroChem, США) толщиной 2-3 мкм, обеспечивает их изоляцию от контакта с клеточной средой.

Таким образом, использование предлагаемой группы изобретений способствует повышению удобства использования, обеспечивает управление стимуляцией электровозбудимых клеток в пригодных для электроники условиях эксплуатации, без вмешательства в стерильные условия развития клеток.

Ниже приведены примеры конкретного использования предлагаемой группы изобретений.

На чашу 10 стерильной микроэлектродной матрицы 9 с питательной средой была произведена посадка культуры дифференцированных нейронов гиппокампа эмбрионов мышей на 18-й день гистрации (Pimashkin et al., 2013). Матрица 9 устанавливалась в коннектор 2, сверху помещалась плата 13 так, что контактные площадки 11 матрицы 9 располагались под прижимными пружинными контактами 16 платы 13 и взаимодействовали с ними. Затем основание 4 соединялось с крышкой 7 коннектора 2.

Коннектор 2 находился в стандартном инкубаторе 3, в котором поддерживалась постоянная температура в 35°С, 5% концентрация СО₂ и 100% влажность.

На четвертый день in vitro коннектор 2 через внешний разъем 18 платы 13 и шлейфа из четырех проводников соединялся со стимулятором 1. На 4 микроэлектрода диаметром 500 мкм матрицы 5 подавалась постоянная стимуляция, состоящая из серии 5 импульсов с межимпульсным интервалом 20 мс и интервалом между сериями 200 мс.

Каждый день с четвертого дня in vitro в течение 10 минут биоэлектрическая активность нейрональной культуры регистрировалась с помощью установки MEA-USB-128-BC-Inv (Multichannel Systems) и снимались фотографии культуры на микроскопе Leica DFC420 С. Анализ биоэлектрической активности производился с помощью программы Meaman (Пимашкин А.С. Свидетельство №2012611190 от 27.01.2012).

В результате наблюдалось сохранение жизнеспособности нейронов хронической стимуляции (фиг. 3, 4, 5). Также наблюдалось изменение характера динамики биоэлектрической активности.