СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА БИФИДОБАКТЕРИЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КОМБИНИРОВАННОГО РАДИАЦИОННО-ТЕРМИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ОРГАНИЗМА И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ КОМБИНИРОВАННОГО РАДИАЦИОННО-ТЕРМИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ОРГАНИЗМА

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности к производству и использованию препаратов, предназначенных для лечения радиационно-термического поражения организма.

Известен способ лечения комбинированных радиационно-термических поражений организма путем внутрибрюшинного введения противовоспалительного цитокина-пентоксифилина в дозе 5 мг/кг и моноклональных антител из расчета 10 мкг/моль (см. статью Р.С. Будагова и Л.П. Ульяновой «Эффекты модуляторов уровня цитокинов на выживаемость мышей и крыс при радиационно-термических поражениях» // Рад. биология, радиоэкология, 2004. - Т. 44. - №4. - С. 302-347).

Известен способ лечения комбинированных радиационно-термических поражений организма путем подкожного введения убитых прогреванием Lactobacillus acidophilus в дозе 0,1 мл препарата, содержащего 108 КОЕ/мл (см. статью Р.С. Будагова и Л.П. Ульяновой «Влияние средств микробного происхождения на уровень цитокинов в сыворотке крови, гематологический статус и выживаемость мышей при комбинированных радиационных поражениях» // Рад. биология, радиоэкология, 2001. - Т. 41. - №1. - С. 31-42).

Недостатком обоих способов лечения является то, что моделирование радиационного и термического поражения организма было неадекватным, поскольку облучение проводилось в дозе, вызывающей минимально летальную дозу (7,0 Гр) и, во-вторых, термический ожог наносится с интенсивностью, вызывающей I-ю и II-ю степень ожога.

Известен способ лечения радиационных поражений путем подкожного введения противолучевой сыворотки млекопитающих в дозе 10-12 мг/кг в течение первых 10 суток после облучения (Патент RU №2169572 МПК А61K 35/38, опубл. 27.06.2001 г.).

Известен также способ лечения радиационных поражений организма путем подкожного введения облученного в дозе 14 Гр бифидумбактерина в дозе 1,43×10⁶ КОЕ/кг (см. автореферат дисс. Хафизова А.Ш. «Изыскание

радиозащитных средств из класса веществ микробного происхождения». - Казань, 2007 г. - 19 с.).

Недостатком обоих способов является отсутствие противоожогового эффекта - способы не защищают животных от радиационно-термического поражения.

Наиболее близким к предлагаемому является способ лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма путем однократного подкожного введения облученного гамма-лучами в дозе 14,0 Гр бифидумбактерина в дозе 1,43⋅10⁶ КОЕ/кг с последующим нанесением на обожженный участок 10%-ного зверобойного масла, а затем через 3-4 сут 10%-ной мази из зверобоя, (пат. RU №2549451, МПК A61K 35/36, A61K 36/38 опубл. 27.04.15 г. БИ №12).

Недостатком способа является недостаточная антитоксическая эффективность бифидобактерий по отношению к радиотоксинам и термотоксинам, которые играют ключевую роль в патогенезе развития острой лучевой болезни (ОЛБ) и ожоговой болезни (ОЖБ), ведущие к финальной стадии полимикробной септикотоксемии с летальным исходом. Кроме того, в крови облученных и обожженных животных резко повышается содержание недоокисленных продуктов обмена (уксусной, молочной, муравьиной, пировиноградной и др. органических кислот), синтез которых на фоне применения бифидобактерий еще более усиливается, что ведет к ожоговому истощению благодаря преобладанию анаэробного гликолиза на фоне радиационно-ожоговой интоксикации. Кроме того, лечение комбинированного радиационно-термического поражения при известном способе предусматривало нанесение ожога III степени, что снижает эффективность способа при нанесении ожога IV степени тяжести.

Между тем, из радиационной иммунологии и патогенеза ожоговой болезни известно, что радиоиндуцированная и ожоговая травма сопровождается дисфункцией иммунитета, выражающейся развитием аутоинтоксикации (самоотравление ядовитыми веществами собственного организма) продуктами обмена веществ и тканевого распада. Ключевую роль в развитии радиоиндуцированной и термоиндуцированной аутоинтоксикации играют аутоантигены - компоненты клеток и тканей собственного организма, ставшие под действием радиационно-термического или других экстремальных факторов чужеродными. В результате взаимодействия аутоантигенов с нормально существующими противотканевыми антителами образуются токсические иммунные комплексы (ЦИК), активирующие систему комплемента. Активация комплемента сопровождается фрагментацией компонентов системы комплемента, фрагменты которой приобретают свойства анафилотоксинов (радиотоксинов, термотоксинов). Именно эти продукты обуславливают развитие характерных для первичных реакций радиационного и термического поражения организма (см. ст. А.А. Иванова «Влияние радиации на систему иммунитета и иммунологические методы модификации радиорезистентности»» // В кн. Лучевые поражения. М.: Из-во МГУ, 1987. С.1 54-160; см. ст. Аутоинтоксикация. - БМЭ, М.: Из-во «Советская энциклопедия». 1981. - Е. 17. С. 379-381).

Практически значимым выводам указанного концептуального положения в борьбе с комбинированной радиационно-термической травмой является возможность повлиять на радио- и терморезистентность организма путем воздействия на систему иммунитета (иммунопатологию) иммунотропными препаратами (кровь, плазма, сыворотка, иммуноглобулины, кровезаменители), а также повысить лечебное действие препарата (резко повысить антибактериальную активность и ранозаживляющий эффект).

Вышесказанное явилось основанием для использования противолучевой сыворотки млекопитающих в качестве дезинтоксикационного средства, направленного на коррекцию гомеостаза и метаболизма, на коррекцию гомеостаза и метаболизма, на борьбу с пострадиационной и ожоговой эндогенной инфекцией, интоксикацией ядовитыми продуктами радиолиза и ожоговой травмы с осложнениями, встречающимися в этом периоде, главным образом, с сепсисом. Для усиления противоинфекционной защиты иммунотропного препарата -противолучевой сыворотки на фоне радиационно-термического поражения, представляется целесообразным введение в состав лечебного средства бифидогенного компонента - культуральной жидкости, полученной при выращивании на жидкой питательной среде - среда Блаурокка. Использование безмикробной фракции бифидогенных факторов в заявленном обусловлен тем, что сочетание иммунной сыворотки с микроорганизмами противопоказано, поскольку при этом образуется комплекс, «антиген-антитело», приводя к инактивации как иммунной сыворотки, так и бифидобактерий. Потому в заявленном способе применяют иммунотропный препарат (противорадиационную сыворотку) в сочетании с культуральной жидкостью, содержащей бифидогенные факторы, экспрессируемые бифидобактериями в культуральную жидкость в процессе выращивания микроба в жидкой питательной среде.

Для усиления противоожогового, антибактериального и ранозаживляющего эффекта, предложенный способ лечения термического ожога на фоне радиационного поражения предусматривает использование в составе мази хитинсодержащих продуктов пчеловодства, которые, наряду с вышеуказанными свойствами, обладают и пленкообразующими свойствами, что исключает применение мазевых повязок, используемых с целью защиты обожженной поверхности от вторичного инфицирования и травмирования. Применение предложенной мази препятствует развитию влажного некроза и обеспечивает длительный контакт антибактериальных средств с тканями.

Покрытия на основе хитиновых соединений занимают особое место в лечение ран и ожогов. Установлено, что хитинсодержащие препараты продуктов производства обладают гемопротекторным, противоязвенным, антитоксическим, иммуностимулирующим, антиоксидантным, аутофлоронормализующим, радиопротекторным, радиозаживляющим (стимулирующим заживлению ран, язв и ожогов) свойствами (Muzzarelli. «Chitin - Oxford: Pergamon Press, 1977»).

Известен способ лечения ожогов путем использования мази, содержащий пчелиный подмор, зверобойное масло, прополис и воск, вазелин и ланолин при следующем соотношении компонентов, масс. %: подмор пчел - 21-23; зверобойное масло - 12-14; прополис - 10-12; воск - 7-9; мазевая основа (вазелин-ланолин 1:1), остальное (Патент RU №2523551, МПК А61K 35/64, опубл. 20.07.2014 г., БИ №20.).

Наличие в составе мази хитинсодержащих продуктов (пчелиный подмор, прополис, воск) значительно повышает лечебное действие препарата (резкое повышение антибактериальной активности, высокий ранозаживляющий эффект) по сравнению с известным, использующим 10%-ное зверобойное масло, а затем через 3-4 суток - 10%-ной мази из зверобоя (Патент RU №2549451, МПК А61K 35/66, опубл. 27.04.2015 г., БИ №12).

Задачей настоящего изобретения является разработка способа, обладающего широким спектром лечебного действия при комбинированном радиационно-термическом поражении организма с высокой выживаемостью животных, с высокой степенью антикомплементарной активности и дезинтоксикационной эффективности.

Поставленная задача решается за счет получения продуктов метаболизма бифидобактерий путем выращивания бифидобактерий во флаконах емкостью 400-500 см³ со средой Блаурокка (казеиново-дрожжевая среда) в течение 3-4 суток, определения концентрации микробов со стандартизацией их количества до 1×10⁸ КОЕ/см, хранения при температуре 4-6°С, тщательного взбалтывания, переливают в центрифужные пробирки емкостью 50-100 см³ и центрифугирования при 5000 об./мин в течение 30 минут, декантирования полученного супернатанта, определения содержания сухого вещества и доведения до концентрации 10-15 мг/мл физиологическим раствором, стерилизации фильтрацией, разлива во флаконы и хранения в холодильнике при температуре 4-6°С, и введения в организм противолучевой сыворотки млекопитающих в смеси с полученными продуктами метаболизма бифидобактерий, содержащимися в культуральной жидкости в соотношении 0,5:0,5, которую вводят 3-кратно с интервалом 24, 48 и 168 часов после нанесения радиационно-термической травмы, подкожно, в дозе 18,5-28 мг/кг по белку и с последующим нанесением через 24, 48 и 168 часов на пораженный участок мази на основе продуктов пчеловодства (подмор пчел, прополис, воск, вазелин, ланолин) и зверобойного масла.

Такое лечение организма, пораженного радиационно-термическим облучением смесью противолучевой сыворотки и полученной культуральной жидкости с продуктами метаболизма бифидобактерий, взятой в соотношении 0,5:0,5, позволяет увеличить выживаемость облученных животных в 1,74 раза по сравнению с известным и значительно (на 50%) уменьшить расход дорогостоящего и дефицитного препарата - противорадиационного иммуноглобулина при сохранении его фармакологического эффекта.

Способ осуществляется следующим образом:

Противолучевую сыворотку получают путем 2-кратного облучения крупных животных (свиней, овец, лошадей и т.д.) на гамме-установке. Облучение доноров осуществляют в 2 стадии: сначала в сублетальной дозе (0,5-1,0 Гр), а затем (через 30 дней) - в летальной дозе (3,5-4,5 Гр) и через 3-4 дня после повторного облучения проводят эксфузию крови донора с последующим отделением сыворотки общепринятым методом (см. кн. «Руководство по вакцинному и сывороточному делу» / под ред. П.Н. Бургасова. - М.: Медицина, 1978 - 439 с.), определяют в ней содержание белка общепринятым методом (см. кн. «Экспериментальная иммунохимия» / под ред. П.Н. Бургасова. - М.: Медицина, 1968 - 665 с.), доводят его содержание стерильным физиологическим раствором до концентрации 25-30 мг/мл, затем подвергают стерилизующей фильтрации, разливают во флаконы и хранят в холодильнике при температуре 4-6°С.

Для получения продуктов метаболизма пробиотического микроорганизма - бифидобактерий, B. bifidum выращивают во флаконах, емкостью 400-500 см³ со средой Блаурокка (казеиново-дрожжевая среда) в

течение 3-4 сут. Выросшую культуру тщательно взбалтывают и переливают в центрифужные пробирки емкостью 50-100 см³ и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. По истечении указанной экспозиции супернатант (культуральную жидкость) декантируют, определяют в нем общепринятым методом (см. кн. Дж. Майнелл, Э. Майнелл «Экспериментальная микробиология», / Пер. с англ. Под ред. А.С. Кривиского и В.Ю. Урбаха. М.; 1967. - С. 14) содержание сухого вещества, включающего биологически активные компоненты (аминокислоты, ферменты, витамины, микроэлементы, антибиотики, цитокины, суперфрактанты (см. кн. Е.В. Зинченко, А.П. Панин «Иммунопробиотики в ветеринарной практике». - Пущино, 2000. - 160 с.)). Содержание сухого вещества в супернатанте доводят физиологическим раствором до концентрации 10-15 мг/мл, затем подвергают стерилизующей фильтрации, разливают во флаконы и хранят в холодильнике при температуре 4-6°C.

На следующем этапе работы получают противолучевую мазь на основе продуктов пчеловодства и зверобойного масла. Для приготовления мази, в асептических условиях при нагревании 50-55°C и постоянном перемешивании смешивают 25 мас. % вазелина и 25 мас. % ланолина, в эти смесь вносят 12-14 мас. % зверобойного масла и после полной гомогенизации поочередно вносят воск (7-9 мас. %), прополис (6 мас. %), а затем - пчелиный подмор (21-23 мас. %). Смесь перемешивают с одновременной гомогенизацией.

Степень гомогенизации оценивают визуально - и микроскопически. Мазь должна быть визуально гомогенна со средней степенью дисперсности 60-90 мкм. Фасовка мази проводится на фасовочном автомате в пластиковые тубы по 50-100 г.

Способ лечения комбинированного радиационно-термического поражения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение оптимального соотношения противолучевой сыворотки и культуральной жидкости, содержащей продукты метаболизма бифидобактерий (ПМББ). Для этого готовят смеси противолучевой сыворотки (ПРЛС) и культуральной жидкости (КЖ), содержащей продукты метаболизма бифидобактерий (ПМББ) в следующих соотношениях ПРЛС:ПМББ: 0,9:0,1; 0,8:0,2; 0,7:0,3; 0,6:0,4; 0,5:0,3; 0,4:0,6; 0,3:0,7; 0,2:0,8; 0,1:0,9. Указанные смеси компонентов однократно подкожно в дозе 0,2 см² вводили белым крысам, подвергнутым комбинированному радиационно-термическому воздействию (гамма - облучения в дозе 8,0 Гр (ЛД₉₀) + нанесения ожога III степени).

В качестве критерия оптимального критерия оптимального соотношения компонентов служила антикомплементарная активность испытуемых смесей через 24 часа после введения их облученным и обожженным животным по титру комплемента в реакции потребления комплемента (РПК). Реакцию проводили согласно модифицированной А.А. Ивановым методике (см. ст. А.А. Иванова «Система комплемента. Структура, функция и средства угнетения», - 1977. - Т. 13. - С. 251-264).

Результаты проведенных иммунологических исследований представлены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что введение облученным и обожженным животным смесей ПРЛС:ПМББ во всех случаях приводит к декомплементарному эффекту, снижая уровень комплемента в сыворотке крови от 1,02 до 1,29 раза в зависимости от соотношения компонентов. При этом введение смеси ПРЛС:ПМББ в соотношении 0,5:0,5 оказывало наиболее высокое антикомплементарное воздействие, снижая уровень комплемента в 1,24 раза (р<0,05).

Следовательно смесь, содержащая 50% противолучевой сыворотки и 50% культуральной жидкости бифидобактерий при содержании сухого вещества 17,5-22 мг/мл, обладает высокой степенью антикомплементарной активности при радиационно-термическом поражении, которая является одним из механизмов противолучевой и противоожоговой защиты организма.

Пример 2. Дезинтоксикационную активность предлагаемой сывороточно-бифидогенной композиции проверяют в сравнении с радиобифидумбактерином (прототип) в остром течении болезни у облученных и обожженных 20 белых мышах. С этой целью белых мышей облучают г-лучами в дозе 7,0 Гр и подвергают термическому ожогу галогеновыми лампами с интенсивностью ожога III степени тяжести. Через 24 ч после радиационно-термического воздействия, животным (10 голов) однократно подкожно вводят сывороточно-бифидогенную композицию в дозе 0,1 см. В динамике (на 3, 7, 14 день ожога) у животных берут кровь и в сыворотке определяют радиоиндуцированные и термоиндуцированные продукты радиолиза (радиотоксины РТ) и ожоговые антигены (ОЖА) с использованием реакции бентонитовой флокуляции (РБФ). Для индикации радиотоксинов в РБФ тест-системе используют сенсибилизированные антирадиотоксическими антителами микрочастицы бентонита (антительный вариант бентонитового диагностикума - АТБД), а для индикации термотоксинов - сенсибилизированные антиожоговыми антителами частицы бентонита (АТОБД). Получение диагностикумов и проведение реакции бентонитовой флокуляции для индикации радио- и ожоговых токсинов проводят в соответствии с методическими рекомендациями P.P. Гайнуллина (см. автореф. дисс. P.P. Гайнуллина «Разработка бентонитового диагностикума для индикации радиоиндуцированных токсических соединений», - Казань, 2009. - 23 с.).

Результаты исследований по индикации радио- и термотоксинов на фоне применения испытуемых противолучевой-бифидогенной композиции приведены в таблице 2.

Из данных таблицы видно, что радиационно-термическая травма сопоровождается токсинемией со значительным накоплением термических продуктов радиолиза и термогенеза, когда содержание их в сыворотке крови возрастает от 3,53±0,58 log₂ до 5,27 log₂. Однократное подкожное введение предлагаемой композиции ингибировало синтез радио и термотоксинов: на 3 сутки содержание их было в 1,56 раза, на 7-е сут - в 1,82 и на 17-е сут в 2,04 раза меньше, чем в контрольной (облучение + ожог) группе.

Использование известного (радиобифидумбактерина) средства оказывало дезинтоксикационное действие, но оно уступало таковому предлагаемого в 1,36 (на 3-сут опыта), 1,44 (на 7-е сут) и в 1,63 раза (на 14-е сут опыта), что свидетельствует о слабой дезинтоксикационной эффективности известного.

Пример 3. На 24 белых мышах, облученных в дозе 7,0 Гр и подвергнутых ожоговой травме III степени, изучали коррекцию метаболических и гематологических нарушений организма на фоне применения известного и предлагаемого средств борьбы с радиационной и ожоговой травмой. В качестве гомеостатических показателей при этом служили диспротеинемия, гемоглобинемия и эритропения, которые наиболее ярко характеризуют такие поражения.

Результаты гематологических и биохимических исследований, проведенных с использованием общепринятых методов исследований (см. кн. Е.А. Жербина и А.Б. Чухловина «Радиационная гематология». - М.: Медицина, 1989. - 175 с.) представлены в таблице 3.

Из данных таблицы видно, что применение средства оказывало более выраженное коррегирующее действие на показатели гомеостаза, предупреждая гипопротеинемию, гемоглобинемию, эритропению, и тромбопению, вызванных радиационно-термической травмой. При этом установлено, что предлагаемое средство оказывало более выраженное гомеостазкоррегирующее действие, значительно превосходя изучаемые показатели известного (в 1,57; 1,65; 1,90 и 1,45 раза на 14-е сут опыта).

Пример 4. Проверка эффективности предлагаемого способа лечения радиационно-термического поражения организма.

Для оценки эффективности композиции, состоящей из противолучевой сыворотки (ПРЛС) и продуктов метаболизма бифидумбактерий (ПМББ) в сочетании с противолучевой мазью (ПРОМ), опыты проводили на 24 белых крысах, разделенных на 4 группы по 6 животных в каждой. Через 1 сут после облучения в дозе 8,5 Гр (ЛД₉₀) и нанесения ожога IV степени, животным 1-й группы 1- и 3-кратно подкожно вводили в дозе 0,2 мл испытуемую композицию на основе противолучевой лечебной сыворотки (ПРЛС) и продуктов метаболизма бифидобактерий (ПМББ) с последующим нанесением противоожоговой мази (ПРОМ) через 1, 3 и 7 сут после нанесения комбинированной радиационно-термической травмы. Животные 2-й группы в тех же условиях 1- и 3-кратно подкожно вводили радиобифидумбактерин с последующим 2-кратным нанесением зверобойного масла и зверобойной мази. Животных 3-й группы подвергали комбинированному радиационно-термическому воздействию без применения лечебных средств (контроль облучения и ожоговой травмы). За животными вели наблюдение в течение месяца, регистрируя павших, выживших, а также наблюдая за процессом заживления ожоговых ран.

Результаты испытания и проведенного и известного способов приведены в таблице 4.

Из представленных в таблице данных, видно, что оптимальным является III вариант лечения, предполагающий 3-х кратное (через 24, 48 и 168 ч после лечения трам) подкожное введение композиционной смеси ПРЛС - ПМББ в дозе по 0,2 мл и 3-х кратное нанесение противолучевой мази на основе продуктов пчеловодства и зверобойного масла, которое обеспечивало выживаемость 87,5% смертельно облученных г-лучами и подвергнутых термическому ожогу IV степени животных. Снижение кратности введения сывороточно - бифидогенного препарата и нанесение противолучевой мази приводит к снижению лечебного эффекта предполагаемого способа лечения (варианты I и II).

Таким образом, предположенный способ лечения позволяет увеличить выживаемость облученный животных в 1,74 раза по сравнению с известным (прототипом), повысить естественную резистентность и иммунобиологическую реактивность организма, усилить обезболивающее, антибактериальное, бактерицидное, противовирусное, антимикотическое действие, стимулировать физиологическую и репаративную регенерацию пораженных тканей.