Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ У ШОРЦЕВ - КОРЕННЫХ ЖИТЕЛЕЙ ГОРНОЙ ШОРИИ, ИМЕЮЩИХ ПОЧЕЧНУЮ ДИСФУНКЦИЮ

Изобретение относится к медицине, в частности к терапии, и найдет применение в оценке прогноза развития артериальной гипертензии (АГ) среди шорцев, имеющих почечную дисфункцию (ПД).

АГ является самым распространенным заболеванием сердечнососудистой системы (Артериальная гипертония у больных с метаболическими нарушениями: особенности и тактика лечения / Ю.В. Жернакова, Г.Х. Шарипова, И.Е. Чазова // Системные гипертензии. - 2015. - Том 12. - №4. - С. 52-56). Роль почек в патогенезе и развитии АГ является предметом интенсивной дискуссии, остроту которой придает наличие длительного периода латентно протекающей ПД, не диагностируемой при рутинном клиническом обследовании (Взаимосвязи функционального состояния почек и эндотелиальной дисфункции у больных артериальной гипертензией / А.П. Ребров, А.Л. Куклина // Клиническая нефрология. - 2012. - №5-6. С. 19-23). В связи с масштабом фатальных исходов кардио-ренального континуума необходимо выявление лиц с ПД, у которых определяется высокий риск развития АГ для своевременного проведения профилактических мероприятий.

Известен способ прогнозирования гипертонической болезни по полу, массе тела, возрасту, окружности груди, окружности талии и окружности бедер, с расчетом соматического индекса по формуле Риса-Айзенка (Способ прогнозирования возможности развития гипертонической болезни для коренных сельских жителей-телеутов юга Кузбасса. Патент RU №2307577, МПК А61В 5/00, Бюл. №28, 10.10.2007. Авторы: О.В. Овсянникова, В.М. Подхомутников, А.В. Колбаско).

Недостатком данного способа является ограниченность критериев лишь конституциональными особенностями организма, следовательно, он обладает недостаточной информативностью в частности генетической предрасположенности к АГ.

Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности признаков является способ прогнозирования АГ по выявлению следующих признаков: возраст, масса тела, окружность талии, индекс «талия-бедро», доход, образование, семейное положение, курение, злоупотребление солью, гиперхолестеринемия, гипертриглицеридемия, уровень ХС-ЛПНП, индекс атерогенности, гиперурикемия, система резус и система MN. (Способ прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у тубаларов - коренных жителей республики Алтай. Патент RU №2505814, МПК G01N 33/49, А61В 5/00, Бюл. №3, 27.01.2014. Авторы: А.В. Колбаско, Т.А. Мулерова, С.Н. Филимонов, Е.Г. Онищенко).

Однако способ имеет ряд недостатков:

- используется ограниченный набор факторов риска развития АГ, не включающий наличия поражения почек, которые принимают важное участие в реализации кардио-ренального континуума, а так же измерение роста, значение которого необходимо учитывать при оценке функции клубочкового аппарата;

- предлагается внедрение систем резус и MN для прогнозирования риска развития АГ, однако перечисленные маркеры не являются генами, связанными с развитием данного заболевания в отличие от полиморфизмов генов АСЕ, eNOS, MTHFR, которые непосредственно влияют на развитие сердечно-сосудистых заболеваний.

Задача данного изобретения - прогнозировать риск развития артериальной гипертензии у шорцев - коренных жителей Горной Шории, имеющих почечную дисфункцию, используя генетические маркеры и факторы риска, способствующие развитию артериальной гипертензии, для выявления лиц с высоким потенциалом развития сердечно-сосудистых заболеваний и проведения своевременных профилактических мероприятий.

Способ решения этой задачи включает учет возраста, массы тела, окружности талии (ОТ), отношения окружности талии к окружности бедер (ИТБ), наличия гиперурикемии, злоупотребления солью, уровня общего холестерина (ОХС), уровня триглицеридов (ТГ), уровня холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС-ЛПНП). Дополнительно определяют маркеры: рост, уровень альбуминурии (АУ), уровень холестерина высокой плотности (ХС-ЛПВП), генетические маркеры: гены систем эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ), метилен-тетрагидрофолатредуктазы (MTHFR).

Затем для каждого фактора устанавливают прогностический коэффициент (ПК) в баллах, а именно: в системе возраст при маркере в возрасте от 18 до 44 лет устанавливают ПК равным (-11), в возрасте от 45 до 64 лет - равным (-1), в возрасте старше 65 лет - равным (+5). В системе масса тела при маркере НМТ устанавливают ПК равным (-1), при маркере ИМТ - равным (+2), при маркере ОЖ - равным (+2). В системе рост при маркере рост ниже 160 см устанавливают ПК равным (+1), рост выше или равен 160 см - равным (-2). В системе ИТБ при маркере повышенный ИТБ устанавливают ПК равным (+1), при маркере нормальный ИТБ - равным (-3). В системе ОТ при маркере повышенная ОТ устанавливают ПК равным (+2), при маркере нормальная ОТ - равным (-1). В системе уровень альбуминурии при маркере повышенный уровень устанавливают ПК равным (+2), при маркере нормальный уровень - равным (-1). В системе гиперурикемия при маркере наличие гиперурикемии устанавливают ПК равным (+1), при маркере отсутствие гиперурикемии - равным (0). В системе злоупотребление солью при маркере досаливает блюда устанавливают ПК равным (+2), при маркере недосаливает - равным (-2). В системе уровень общего холестерина при маркере повышенный ОХС устанавливают ПК равным (+1), при маркере нормальный ОХС - равным (-2). В системе уровень триглицеридов при маркере повышенный уровень ТГ устанавливают ПК равным (+1), при маркере нормальный уровень ТГ - равным (0). В системе уровень ХС-ЛПНП при маркере повышенный уровень ХС-ЛПНП устанавливают ПК равным (+1), при маркере нормальный уровень ХС-ЛПНП - равным (-2). В системе уровень ХС-ЛПВП при маркере пониженный уровень ХС-ЛПВП устанавливают ПК равным (+1), при маркере нормальный уровень ХС-ЛПВП - равным (0). В системе гена eNOS при наличии генотипа 4b/4b устанавливают ПК равным (-1), при наличии генотипа 4а/4b - равным (+2), при наличии генотипа 4а/4а - равным (0). В системе гена АСЕ при наличии генотипа II устанавливают ПК равным (0), при наличии генотипа ID - равным (-2), при наличии генотипа DD - равным (+9). В системе гена MTHFR при наличии генотипа СС устанавливают ПК равным (-1), при наличии генотипа СТ - равным (+4), при наличии генотипа ТТ - равным (0). И при значении суммы ПК (+6) баллов и выше прогнозируют предрасположенность к развитию АГ у шорцев - коренных жителей Горной Шории, имеющих почечную дисфункцию.

Новизна способа заключается в определении таких маркеров как: рост, уровень альбуминурии (УА), ХС-ЛПВП, генотипы генов сердечнососудистых заболеваний АСЕ, eNOS, MTHFR. Так, наличие D-аллеля в гене АСЕ ассоциируется с АГ. Генотип DD обусловливает прогрессию гипертонической болезни, а также является фактором, предрасполагающим к развитию хронической почечной недостаточности в исходе заболеваний почек. Генотипы 4а/4а, 4а/4b гена eNOS связаны с нарушением экспрессии гена, вследствие чего уменьшается выработка NO, что приводит к нарушению перфузии тканей почки, маркеры 4а/4а, 4a/4b eNOS предрасполагают к появлению протеинурии. Генотип ТТ гена MTHFR ассоциирован с трехкратным повышением риска сердечно-сосудистых заболеваний в результате повышения концентрации гомоцистеина. Маркеры СТ и ТТ связаны с тромбозами мелких сосудов почек.

У коренных жителей Горной Шории произведен анализ антропометрических и биохимических показателей, а также генетических маркеров. Данный регион располагается на юге Кемеровской области, в северных предгорьях Алтайской горной системы. Шорцы являются представителями центрально-азиатского и переходного южно-сибирского типа монголоидной расы и входят в перечень коренных малочисленных народов Российской Федерации. В труднодоступных районах Горной Шории продолжают оставаться неурбанизированные поселения, живущие натуральным хозяйством.

Впервые разработан способ прогнозирования АГ у шорцев, имеющих ПД, для проведения системы комплексных мероприятий по профилактике сердечно-сосудистых заболеваний среди малочисленного и уникального народа.

Использовался метод Байеса, с помощью которого вычисляют прогностический коэффициент (ПК) и прогнозируют предрасположенность или резистентность к развитию АГ по итоговой сумме всех ПК. Выявлен удельный вес каждого признака по данным произведенных вычислений, факторы с отрицательным значением уменьшают, с положительным - увеличивают риск развития заболевания. Предрасположенность к развитию АГ прогнозируют при значении суммы ПК (+6) баллов и выше.

Условием репрезентативности выборки, по данным Ю.П. Лисицина (1999 г.) является исследование не менее 30% населения для экстраполяции полученных данных на всю генеральную совокупность. Такой объем выборки позволяет учитывать даже редкую наследственную патологию, встречающуюся с частотой менее 1:10000. При построении прогностической системы нами посредством выездных экспедиций в труднодоступные районы Горной Шории было обследовано 720 шорцев, из них в п. Ортон, п. Усть-Кабырза - 390 шорцев, а так же 330 шорцев п. Шерегеш и отдаленных от него поселений (более 80% коренного населения данного региона). Выборка производилась сплошным методом на основании поименных списков в 2013-2016 гг. и включала лиц от 18 лет и старше. Средний возраст обследуемых составил 48,43±0,6 лет, из них мужчин - 254 (35,2%), женщин - 467 (64,7%). Из них была отобрана группа лиц, имеющих ПД, которая составила 266 человек.

Программа обследования коренного населения состояла из следующих блоков: блок 1 - анкетирование (опросник включал в себя следующие критерии: пол, возраст, национальность, анамнестические данные, наличие хронических заболеваний, прием лекарственных препаратов (в том числе гипотензивных); блок 2 - сбор жалоб и клинический осмотр с занесением информации в индивидуальную карту пациента; блок 3 - сведения о наличии вредных привычек; блок 4 - забор биологических материалов для оценки параметром, необходимых для выявления заболеваний.

При наличии досаливания традиционно приготовленной пищи отмечали привычку злоупотребления солью.

С помощью медицинских рычажных весов в положении обследуемого стоя проводили измерение массы тела; для этого обследуемые снимали обувь и без верхней одежды становились на весы. Точность измерения массы тела - до 0,1 кг.

Измерение АД проводили после десятиминутного отдыха двукратно на обеих руках по методике ВОЗ (1980) с интервалом в пять минут. Использовали аускультативные сфигмоманометры отечественного производства, валидизированные по стандартным протоколам, и 3 вида манжет: для плеча окружностью в 27-34 см - манжета 13×30 см, для плеча окружностью в 35-44 см - манжета 16×38 см; для плеча окружностью 45-52 см - манжета 20×42 см. В анализ включали средний результат двух измерений. При разнице между двумя измерениями более 5 мм рт.ст., АД измеряли третий раз, с последующим расчетом среднего. Артериальную гипертензию определяли по критериям ВНОК 2010 года: САД больше или равно 140 мм рт. ст., ДАД больше или равно 90 мм рт. ст. Диагноз АГ устанавливали на фоне приема гипотензивных препаратов независимо от уровня АД.

Измерение роста проводили в положении стоя при помощи ростомера, точность измерения длины тела - до 0,5 см. Измерение проводили без обуви; пятки, плечи и затылок касались ростомера, а глазная ось располагалась горизонтально, при этом верхний край наружного слухового отверстия находился на одном уровне с нижним краем глазницы. Планка ростомера находилась на уровне верхней точки головы перпендикулярно стене, у которой был размещен ростомер.

Индекс массы тела определяли по формуле: ИК=М/Р²,

где ИК - индекс Кетле; М - значение массы тела в кг; Р² - значение роста в метрах, возведенное в квадрат.

Согласно классификации ВОЗ (1997), дефицит массы тела (ДМТ) определяли при ИК менее 18,5 кг/м; нормальная масса тела (НМТ) - при значениях ИК 18,5-24,9 кг/м²; избыточная (ИМТ) - 25,0-29,9 кг/м; ожирение (ОЖ) - при ИК 30,0 кг/м² и более.

Окружность талии измеряли сантиметровой лентой с точностью до ближайшего сантиметра на уровне максимальной окружности живота в положении обследуемого стоя. За абдоминальное ожирение принимали значения ОТ>94 см у мужчин и >80 см у женщин.

Также сантиметровой лентой проводили измерение окружности бедер (ОБ) на уровне их максимальной окружности в положении обследуемого стоя. Индекс «талия-бедро» определяли по формуле: ОТ(см)/ОБ(см). За нормальное значение принимали отношение окружности талии к окружности бедер <0,9 у мужчин и <0,8 у женщин.

Кровь для биохимических исследований брали из кубитальной вены в утренние часы натощак, затем ее центрифугировали, сыворотка подвергалась заморозке, хранилась в условиях отрицательной температуры. В лабораторию материал доставляли в контейнерах с жидким азотом, не допуская размораживания.

С помощью автоматического биохимического анализатора Selectra junior, Vitalab, фирмы Vital Scientific (Нидерланды) ферментативным колориметрическим методом по конечной точке с помощью набора реактивов фирмы «Вектор-Бест» исследовали уровни общего холестерина (ОХС) и триглицеридов (ТГ). Холестерин липопротеидов высокой плотности (ХС-ЛПВП) определяли прямым иммунологическим методом с помощью реагента Diasys Diagnostic Systems GMBH (Германия).

Уровень холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС-ЛПНП) и индекса атерогенности (ИА) вычисляли расчетными методами по нижеперечисленным формулам.

Содержание ХС-ЛПНП рассчитывалось по формуле W. Friedewald с соавторами (1972): ХС-ЛПНП=ОХС-(ХС-ЛПВП+ТГ/2,2) (при уровне ТГ менее 4,0 ммоль/л).

ИА определялся по формуле: ИА (ед)=(ОХС-ХС-ЛПВП)/ХС-ЛПВП.

Дислипидемию выявляли в соответствии с Российскими рекомендациями V пересмотра 2012 г. (табл. 1).

С помощью селективного биохимического анализатора «КонеЛаб 601» (Финляндия) фотометрическим методом исследовали уровень альбумина мочи. Показатель альбуминурии более 30 мг/сут принимали за повышенный.

Колориметрическим методом по конечной точке определяли уровень мочевой кислоты. За нормальные величины принимали показатели 140-360 мкмоль/л для женщин и 200-420 мкмоль/л для мужчин. Кинетическим методом устанавливали уровень креатинина сыворотки. Рассчитывали клиренс креатинина по формуле Кокрофта-Голта ((140-возраст) × вес × 88/72 × уровень креатинина крови для мужчин, данные умножали на 0,85 для женщин). Для определения расчетной скорости клубочковой фильтрации (рСКФ) полученные значения приводили к средней площади поверхности тела человека (1,73 м²). Критерием наличия (ПД) считали уровень рСКФ, стандартизованный к площади поверхности тела, ниже 90 мл/мин/1,73 м².

Методом фенол-хлороформной экстракции производили выделение ДНК из крови. К образцу крови добавляли 2-3 объема буфера А (10 мМ трис-HCl, рН=7,5; 10 мМ NaCl; 3 мМ MgCl₂) и перемешивали на вортексе. Полученные центрифугированием при 2500 g осадки промывали дважды буфером А и ресуспензировали в 0,5 мл буфера В (10 мМ ЭДТА; 100 мМ NaCl; 50 мМ трис-HCl, рН=8,5). Далее добавляли SDS до 0,5% и протеиназы К до 200 мкг/мл смесь инкубировали в течение ночного времени при температуре 37 градусов. Последовательно производили депротеинацию водонасыщенным фенолом, смесью фенол-хлороформа (1:1), затем хлороформом. Потом добавляли изопропиловый спирт, смешивая до образования клубочка, затем охлаждали при условиях отрицательной температуры (-20°C) в течение 60 минут. Полученный в результате центрифугирования осадок дважды промывали 70% этанолом, просушивали и растворяли в водной среде до концентрации ДНК 0,5 мкг/мкл.

Полиморфизмы генов АСЕ (I/D), eNOS (4a/4b) и MTHFR (С677Т) тестировали с помощью ПЦР по перечисленным далее методикам: Snapir А., 2003; Lima J.J., 2007; Salimi S., 2006.

При выявлении полиморфизма (4a/4b) гена eNOS использовали фланкирующие праймеры: прямой - 5-AGGCCCTATGGTAGTGCCTT-3', обратный - 5'-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC-3'. Генотипирование инсерционного полиморфизма гена АСЕ проводили через синтез соответствующего фрагмента ДНК гена АСЕ методом ПЦР и анализ длины продуктов. Структура праймеров: прямой - 5'-GCCCT-GCAGG-TGTCT-GCAGC-ATGT-3', обратный - 5'-GGATG-GCTCT-CCCCG-CCTTG-TCTC-3'.

Детекцию полиморфизма С677Т гена MTHFR проводили при помощи ПЦР с последующим расщеплением продукта рестриктазой HinfI. Структура праймеров: прямой - 5-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3, обратный - 5-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3.

На основе частоты встречаемости маркеров у лиц, имеющих и не имеющих АГ, ПК вычисляли по формуле: ПК=10 lg (Р1/Р2), где Р1 - частота (в процентах) данного маркера среди лиц, имеющих AT; Р2 - частота этого же маркера у лиц без АГ. ПК с положительным значением увеличивает риск развития АГ, с отрицательным - уменьшает, при этом информативность ПК возрастает с увеличением его абсолютного значения. ПК неинформативных маркеров равен нулю (Гублер Е.В., 1978; Левченко В.Г., 1987). Все значимые факторы приведены в таблице 2.

В результате расчета установлено, что наибольший риск развития АГ у лиц с ПД связан с возрастом старше 65 лет, избыточной массой тела, ожирением, повышенной ОТ, повышенным уровнем альбуминурии, злоупотреблением солью, генотипом 4а/4b гена eNOS, генотипом DD гена АСЕ, генотипом СТ гена MTHFR, наименьший же риск ассоциирован с возрастом от 18 до 44 лет, ростом выше 160 см, нормальным ИТБ, отсутствием злоупотребления соли, нормальным уровнем ОХС, нормальным уровнем ХС-ЛПНП и генотипом ID гена АСЕ.

Способ осуществляют следующим образом: проводят однократное определение маркеров, по вышеперечисленным методикам исследуют 15 признаков, результаты оценивают в соответствии с таблицей 2. Алгоритм работы с таблицей основан на сложении всех рассчитанных ПК с учетом знака, при значении суммы (+6) баллов и выше прогнозируется риск развития АГ для обследуемого.

Пример 1

Обследуемая М., 50 лет, предъявляет жалобы на повышенную утомляемость. При клиническом обследовании выявлено: рост - 164 см, масса тела - 78 кг, ОТ - 102 см, ОБ - 114 см, АД 134/82 мм рт. ст. Произведен расчет: ИК - 29,0 кг/м², ИТБ - 0,89 (повышен). Пищу не досаливает. Получены результаты лабораторных анализов: креатинин - 96 мкмоль/л, уровень АУ - 32 мг/сут, мочевая кислота - 280 мкмоль/л, ОХС - 6,9 ммоль/л, ТГ - 3,2 ммоль/л, ХС-ЛПВП - 1,28 ммоль/л. Вычислены: рСКФ - 68 мл/мин/1,73 м², ХС-ЛПНП - 4,16 ммоль/л, ИА - 4,4 (повышен). Проведено генетическое обследование: ген eNOS - генотип 4а/4а, ген АСЕ - генотип DD, ген MTHFR - генотип ТТ. Сумма ПК составила: (-1-2+2+1+2+2+0-2+1+1+1+0+0+9+0)=+14.

В результате установлен повышенный риск развития АГ для обследуемой М., 50 лет.

Пример 2

Обследуемый С., 43 лет, на момент осмотра жалоб не предъявляет. При клиническом обследовании выявлено: рост - 170 см, масса тела - 84 кг, ОТ - 98 см, ОБ - 106 см, АД 118/80 мм рт. ст. Произведен расчет: ИК - 29,1 кг/м, ИТБ - 0,92 (повышен). Пищу досаливает. Получены результаты лабораторных анализов: креатинин - 105 мкмоль/л, уровень АУ - 8 мг/сут, мочевая кислота - 438 мкмоль/л, ОХС - 4,7 ммоль/л, ТГ - 1,6 ммоль/л, ХС-ЛПВП - 1,6 ммоль/л. Вычислены: рСКФ - 84 мл/мин/1,73 м, ХС-ЛПНП - 2,37 ммоль/л, ИА - 1,94 (нормальный). Проведено генетическое обследование: генотип eNOS - 4a/4b, генотип АСЕ - II, генотип MTHFR - СС. Сумма ПК составила: (-11+2-2+1+2-1+1+2-2+0-2+0+2+0-1)=-9, следовательно на данный момент обследования нет предрасположенности к развитию АГ.

Предложенный способ позволяет выявить риск развития АГ в более ранние сроки у лиц, имеющих почечную дисфункцию, для своевременного начала нефропротективной терапии, включающей в себя препараты групп ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента и блокаторов рецепторов ангиотензина-2 с целью профилактики прогрессировать хронической почечной недостаточности.