Результат интеллектуальной деятельности: Способ изготовления комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллёзом животных

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и иммунологии, в частности к способу выделения О-цепи полисахаридов бруцелл из штаммов Br.abortus 19 и Br.melitensis 16М, используется в иммунологии, диагностике в т.ч. дифференциальной диагностике вакцинированных и больных бруцеллезом животных.

Известен способ получения частично очищенных О-ПС (K. Nielsen, J. Cherwonogrodzky et al., 1989), включающий автоклавирование бактериальных клеток в 2%-ной уксусной кислоте с 10%-ным раствором хлористого натрия в течение 1 часа при 120°С. Осадок растворяли в 1%-ном растворе уксуснокислого натрия и подвергали ферментативному перевариванию дезоксирибонуклеазой, рибонуклеазой и протеиназой.

После ферментативного переваривания проводили ультрацентрифугирование при 100000 об/мин в течение 18 часов. Затем супернатантный раствор подвергали фенольно-водной экстракции при 22°С, и фенольный слой отбирали и диализировали против 1%-ного раствора ацетата натрия. Окончательную очистку осуществляли на колонке с гелем Сефадекса.

К недостаткам способа можно отнести его трудоемкость, сложность и длительность.

Известен способ получения противобруцеллезного антигенного иммуноферментного конъюгата (ИФК) для дифференциальной диагностики больных бруцеллезом животных от вакцинированных, характеризующийся тем, что вирулентный штамм бруцелл вида В. abortus 54 инактивируют гамма-лучами 60Со в дозе 3,0-3,5×104 Гр, лизируют в растворе, приготовленном на 0,062-0,125 М трис HCL-буфере, рН 6,8, содержащем 2-5% додецилсульфата натрия и 5% меркаптоэтанола, наносят пробы в лунки концентрирующего геля в количестве 50-100 мкг по белку, проводят электрофорез при силе тока 40 мА на две пластины геля до вхождения красителя в гель и затем при силе тока 80 мА на две пластины 3-3,5 ч, фиксируют пластины в растворе, содержащем 40% изопропилового спирта и 10% уксусной кислоты в течение 1 ч, окрашивают в 0,1%-ном растворе "кумасси" бриллиантовым голубым R-250, затем фракции полипептидов окрашивают серебром с использованием раствора формальдегида, денситометрируют пластины геля на сканере SHARP-330Y х в проходящем свете, определяют молекулярную массу и иммунологическую компетентность фракций методом иммуноблотинга, полипептидную антигенную фракцию вирулентного штамма бруцелл В. abortus 54 с молекулярной массой 41,8 кДа конъюгируют с ферментной меткой - пероксидазой хрена из расчета 1 мг белка на 20 мг пероксидазы при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 20 мин (RU 2300107, кл. G01N 33/535, A61K 39/10 от 11.01.2005).

К недостаткам способа можно отнести его трудоемкость, сложность и длительность.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, является известный способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных, включающий экстракцию липополисахарида из бруцелл вида abortus обработкой 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10%-ного раствора NaCl при автоклавировании, отделение экстракта центрифугированием, фракционирование супернатанта спиртом, выделение О-полисахарида из полученного осадка с последующей его очисткой, при этом выделение О-полисахарида осуществляют трихлоруксусной кислотой на холоду в течение 15 мин, а очистку проводят гель-фильтрацией в агарозе (RU 2035188, кл. А61K 39/10, от 21.02.1992).

Недостатком данного способа является его трудоемкость, сложность и длительность. Необходимость использования трудоемкого процесса гельфильтрации в 1,6%-ной агарозе и дополнительное осаждение белков трихлоруксусной кислотой значительно понижали выход конечного продукта (О-ПС антигена). Кроме того, очистка антигена с помощью гельфильтрации требует громоздкого и дорогостоящего оборудования и реактивов, что существенно повышает стоимость конечного продукта.

Техническая задача - получить высокоочищенный антиген на основе О-цепи полисахарида бруцелл, пригодный для дифференциации вакцинированных и больных животных с такой очисткой от примесей, которая обеспечивает получение высокоочищенного антигена на простом и более дешевом оборудовании и с помощью недорогих реактивов.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения комплексного антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных, включающем экстракцию липополисахаридов бруцелл вида Brucella abortus и Brucella melitensis, для чего их берут в равном соотношении и обрабатывают 2%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии 10% NaCl при автоклавировании, затем отделяют экстракт центрифугированием, фракционируют супернатант спиртом и выделяют О-полисахарида центрифугированием.

Антиген, полученный предлагаемым способом, имеет высокий выход (500 мг из 100 г сырой клеточной массы бруцелл) при малом количестве примесей (порядка 2%).

Пример: 100 г сырой клеточной смешанной массы бруцелл из штамма 19 (Brucella abortus, 19) и из штамма 16М (Brucella melitensis, 16М), смешанных в соотношении 1:1 ресуспендировали в 250 мл 2%-ной уксусной кислоты, содержащей 10% NaCl и автоклавировали 30 минут при 120°С. Суспензию охлаждали и центрифугировали 30 минут при 3000 об/мин при 4°С. Осадок отбрасывали, супернатант нейтрализовали 0,5М NaOH, охлаждали до 0°С и добавляли 1,3 л охлажденного этанола, оставляли на ночь для формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут при 4°С и растворяли в 15 мл 5%-ного раствора NaCl. Растворенный осадок диализировали в 100-кратном объеме 5%-ного раствора NaCl с двукратной сменой раствора в течение 2 суток. Получили около 500 мг свободной О-цепи полисахаридов бруцелл. Препарат содержал 98% О-цепи полисахарида и около 2% примеси, представленных остатками нуклеиновых кислот. Количество белков и нуклеиновых кислот определяли по Лоури и спектрофотометрически.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить высокоочищенный антиген для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных простым и экономичным способом, за более короткий срок и без применения дорогостоящих реактивов и оборудования.