Результат интеллектуальной деятельности: ТРАНСГЕННОЕ РАСТЕНИЕ ОСИНЫ, УСТОЙЧИВОЕ К ГЕРБИЦИДАМ

Изобретение относится к области генетической инженерии и биотехнологии растений, и может быть использовано для удешевления процедуры получения новых саженцев и повышения качества посадочного материала для нужд целлюлозно-бумажной промышленности.

Несмотря на то, что Российская Федерация обладает примерно ¹/₄ мировых запасов древесины, ее доступность в значительной степени ограничена. Доступная для переработки близость лесов является важным показателем для целлюлозно-бумажной промышленности. Интенсивные лесозаготовки при отсутствии вложений в восстановление лесов могут привести к полной потере конкурентоспособности отечественной ЦБП. Учитывая современное состояние лесного хозяйства и уровня развития генной инженерии растений, восстановление лесов должно производиться с использованием плантационного способа ведения лесного хозяйства, используя для этих целей высокопродуктивные формы лесных пород с новыми ценными признаками.

Осина является ценной лесной породой благодаря хорошей скорости роста и качеству древесины, причем последние годы ее ценность неуклонно возрастает, поскольку осина нетребовательна к климатическим условиям и к почвам.

Целью предлагаемого изобретения является внедрение в генотип осины трансгена, придающего растению устойчивость к гербициду, что позволит в значительной степени удешевить получение посадочного материала за счет обработки питомников осины гербицидами сплошного действия. Экономия достигается за счет снижения числа проходов сельхозтехники и уменьшения доли ручного труда. Качество трансгенного посадочного материала осины также будет выше по сравнению с диким генотипом за счет своевременного и массового устранения сорной растительности.

Поставленная цель достигается за счет следующего: механизм действия одного из самых распространенных гербицидов, используемых в сельском хозяйстве, фосфинотрицина, или глюфосината основан на прямом ингибировании фермента глутаминсинтетазу. Блокирование глутаминсинтетазы фосфинотрицином приводит к быстрому истощению запаса глутамина в клетках растения, накоплению аммиака в фотосинтезирующих тканях и отравлению растения (Чумиков И.А. Технология Либерти Линк новый инструмент для успешной борьбы с сорняками / И.А. Чумиков // ΑΓΡΟ XXI. - 2002. - №1. - С. 20-21). Ген bar кодирует фермент фосфинотрицинацетилтрансферазу, который ацетилируюет свободную NH₂ группу в молекуле фосфинотрицина, делая ее неактивной в отношении глутаминсинтетазы. Растения, в геном которых внедрен этот ген, начинают продуцировать фосфинотрицинацетилтрансферазу и, как следствие, обретают устойчивость к действию фосфинотрицина (Сингер М. Гены и геномы / М. Сингер, П. Берг. М.: Мир, 1998).

Суть изобретения состоит в том, что в геном осины был интегрирован ген bar (SEQ ID NO: 1). Для трансформации осины использовали штамм Agrobacterium tumefaciens СВЕ21 с Ti-плазмидой рСВЕ21. Агробактериальный штамм содержал бинарный вектор pBI-Bar, содержащий ген bar под контролем 35S промотора.

Анализ известных продуктов, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого продукта неизвестна из уровня техники, следовательно продукт соответствует условию патентоспособности изобретения - «новизна».

Предлагаемый продукт получают следующим образом.

Агробактериальная трансформация осины:

1. В 50 мл жидкой среды Luria-Bertoni (LB) (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl), дополнительно содержащей 50 мг/л канамицина, добавляли 100 мкл суспензии агробактериальных клеток и инкубировали при 27-28°С в течение суток. Суспензию наросших клеток осаждали центрифугированием, промывали и ресуспендировали в 50 мл жидкой среды MS (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497).

2. В чашки Петри заливали по 25 мл агаризованной среды MSm (соли MS + 20 мМ KNO₃+10 мМ NH₄NO₃) с добавлением 0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д).

3. Нарезали междоузлия микрорастений осины (экспланты) длиной 5-10 мм.

4. Экспланты заливали агробактериальной суспензией в среде MS и инкубировали 20 минут при комнатной температуре.

5. Затем экспланты подсушивали их на фильтровальной бумаге и помещали на среду MSm.

6. Экспланты инкубировали на свету в течение двух суток, после чего промывали их в дистиллированной воде с добавлением цефотаксима (1 г/л) в течение 20-30 минут.

7. Отмытые экспланты подсушивали на фильтрах и раскладывали на среду MSm, содержащую 0,5 мг/л зеатина, 30 мг/л канамицина и 500 мг/л цефотаксима. На данной среде производилась регенерация и селекция трансформантов.

Регенерировавшие растения, демонстрирующие нормальный рост в присутствии селективного агента канамицина, проверяли на наличие вставки гена bar с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), параллельно оценивая регенераты на наличие агробактериальной контаминации. Для этого из микрорастений выделяли тотальную растительную ДНК по стандартной методике Rogers и Benedich (Rogers S.O., Bendich A.J. (1994). Extraction of DNA from plant, fungal and algal tissues. In:, Gelvin SB, Schilperoort RA (eds) Plant Molecular Biology Manual. Boston, MA: Kluwer Academic Publishers, D 1: 1-8).

ПЦР анализ ДНК отдельных регенерантов проводили в следующих условиях: реакционная смесь содержала 16 мМ (NH₄)SO₂ 0,01% бычий сывороточный альбумин, 200 мкМ каждого дНТФ, 0,4 мкМ каждого праймера, 0,05 ед./мкл Taq-полимеразы, 1-5 нг/мкл растительной ДНК. Реакции проводили на амплификаторе MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler (BIO-RAD). Режим амплификации: 3 мин денатурация при 96°С, 45 сек денатурация при 94°С, 45 сек отжиг при 58°С, элонгация 1 мин при 72°С, 5 мин достройка при 72°С, 31 цикл амплификации. Все линии осины в первую очередь анализировались на наличие агробактериальной контаминации. Геномная ДНК анализировалась на присутствие агробактериального гена VirB. Для этого бралась пара праймеров Vir-B1 (SEQ ID NO: 2) и VirB2 (SEQ ID NO: 3). Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента 670 п. н. Результаты анализа показали, что все шесть анализируемых линий не были контаминированы агробактериями (фиг. 1).

После этого все шесть линий и две линии, проверенные на агробактериальную контаминацию ранее, были проанализированы на наличие вставки гена bar с использованием пары праймеров bar-1 (SEQ ID NO: 4) и bar-2 (SEQ ID NO: 5). Анализ препаратов геномной ДНК регенерировавших растений показал, что во всех линиях содержалась вставка гена bar (фиг. 2).

Трансформанты с подтвержденной вставкой гена bar были размножены в условиях in vitro и после укоренения адаптированы к естественным условиям окружающей среды. Через 6 месяцев после адаптации, трансгенные линии осины, а также нетрансформированная линия (Pt) были проанализированы в условиях закрытого грунта на устойчивость к полулетальной (5 мг/л) и летальной (10 мг/л) дозам фосфинотрицина (фиг. 3). Результаты анализа показали, что большинство линий приобрели различную устойчивость к действию фосфинотрицина. Наибольшая степень устойчивости к гербициду отмечалось у трансгенных линий ptXIBar23a и ptXIBar30a (Таблица 1), в то время как у линии ptXIBar31a устойчивость была очень низкой (1,8 и 2,3 балла), но поскольку она была все же выше, чем в контроле (2,2 и 2,9 балла) можно предположить, что низкий уровень экспрессии трансгена в этой линии связан с частичной инактивацией гена на транскрипционном или посттранскрипционном уровне.

На стадии регенерации, особенно в присутствии мощного синтетического ауксина 2,4-Д, возможно возникновение сомаклональных мутаций в геноме осины, большинство которых проявляется фенотипически. Для выявления потенциальных сомаклональных мутантов мы провели сравнительный анализ растений по высоте и форме листа. В результате анализа не было выявлено каких-либо отличий по высоте растений (таблица 2) или форме/размере листьев между нетрансгенным контролем и трансгенными линиями.

Таким образом, были получены трансгенные линии осины, фенотипически не отличающиеся от дикого типа и обладающие устойчивостью к гербицидам.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Результаты ПЦР-анализа шести трансгенных линий осины на присутствие агробактериального гена VirB

Размер ожидаемого амплифицируемого фрагмента 670 п. о. M - молекулярный маркер, К+ - геномная ДНК агробактерий (положительный контроль), К- - нетрансформированное растение (отрицательный контроль), H₂O - вода, 1-6 - трансгенные линии осины).

Фиг. 2. Результаты ПЦР-анализа шести трансгенных линий осины на присутствие гена bar

Размер ожидаемого амплифицируемого фрагмента 310 п. о. M - молекулярный маркер, К+ - плазмидная ДНК (положительный контроль), К- - нетрансформированное растение (отрицательный контроль), H₂O - вода, 1-8 - трансгенные линии осины).

Фиг. 3. Поражение верхних листьев растений осины летальной дозой фосфинотрицина (10 мг/л)

Поражение верхних листьев растений осины летальной дозой фосфинотрицина (10 мг/л)

Перечень последовательностей:

SEQ ID No: 1. Нуклеотидная последовательность гена bar: GAATCCGGACAGAATTCCCAACCCGCCCTTCGATTTTTCTGATCATGCAGTACCCTGTCCGGCCACGAGG

GGAGGCGGGATGCCGTCGGAACGTACAGAGGTGCAGGTCAGGTCGGGAGTCGAGGCCGACCTCAAAGCCC

TCACCGACATCTACAACCACTATGTACGTGAGACGCCCATCACATTCGATACCGCCGCCTTCACGCCGGA

AGAGCGCCGCCCTTGGCTGCTCTCCCACCCTGAAGACGGACCGCACCGGCTGATGGTTGCCACGGGCGCG

GACTCACAGGAGATTCTTGGGTACGCCACCAGCAGTCCTTTCCGCGCCAAGCCCGCCTACACCACCTCCG

TCGAGGTGACCGTCTACGTCGCCCCGGACGCGGCTGGCCGTGGCATCGGCACGCTCCTCTACGGCGCCCT

CTTCGAGGCGCTGGCGGGCGAGGATCTCCACCGCGCCTACGCGGGCATCGCCCAGCCCAACGAAGCGTCC

ACGCGGCTGCATGAACGCTTCGGGTTCCGGCATGTCGGCACCTACCGGGAGGTGGGCCGCAAGTTCGGAC

GGTACTGGGACGTGGCCTGGTACGAGAGGGAGCTGTAGCCGTACGCCGACCAGCAGCCGTACGCCGTTCA

GCCGAACTGCACCGACCGCTTCGCCAGCCCCAGCCAGAAGCCGTC

SEQ ID No: 2. Нуклеотидная последовательность праймера Vir-B1:

GGCTACATCGAAGATCGTATGAATG

SEQ ID No: 3. Нуклеотидная последовательность праймера Vir-B2:

GACTATAGCGATGGTTACGATGTTGAC

SEQ ID No: 4. Нуклеотидная последовательность праймера bar-1:

TGCACCATCGTCAACCACTA

SEQ ID No: 5. Нуклеотидная последовательность праймера bar-2:

ACAGCGACCACGCTCTTGAA