Штамм дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290, применяемый для получения этанола на каталитических гидролизатах целлюлозы

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой штамм термотолерантных дрожжей Kluyveromyces marxianus, депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под номером Y-4290. Штамм Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 предназначен для получения этанола путем ферментации смесей сахаров, являющихся продуктами каталитического гидролиза-дегидратации микрокристаллической целлюлозы. Штамм Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 обладает высокой термотолерантностью (до 50°С), специфической скоростью роста (0.40±0.05 ч^-1) и устойчивостью к соединениям, образующимся в результате каталитического гидролиза-дегидратации целлюлозы (в том числе 5-гидроксиметилфурфуоролу, фурфуролу и др.). При культивировании на каталитическом гидролизате микрокристаллической целлюлозы выход этанола составляет 83.9±5.0% от теоретического.

Биомасса является важным источником возобновляемого сырья для получения широкого спектра материалов и химических веществ. Ее состав включает в себя лигнин, гемицеллюлозу и целлюлозу. Наибольшее применение из них нашла целлюлоза, как биополимер, представляющий собой полисахарид, состоящий из мономерных звеньев ангидро-β-D-глюкопиранозы (глюкозы), которые соединены 1,4-гликозидными связями.

В настоящее время существуют промышленные технологии получения ряда химических веществ, получаемых путем переработки лигноцеллюлозных материалов, в том числе сахаров (глюкозы, ксилозы), лигнина и фурфурола. Но наибольшее применение в биотехнологии получило получение этанола путем сбраживания глюкозы, образующейся при гидролизе целлюлозы. При этом гидролиз осуществляется как с использованием кислот, например серной кислоты, так и с применением щелочей, аммиака или ферментов [1]. Существенным недостатком химических способов гидролиза, например кислотного, является образование определенного количества побочных соединений, в том числе кислот, например левулиновой 0.1-0.3%, муравьиной 0.03-0.1%, уксусной 0.2-0.5% и др., 5-гидроксиметилфурфурола (0.03-0.18%) и фурфурола (0.02-0.12%) [2]. Несмотря на то, что перечисленные соединения являются ценными веществами, применяемыми в химическом синтезе, их малые количества, получаемые в ходе процесса гидролиза целлюлозы, не позволяют использовать их как самостоятельные продукты. Другим недостатком химического гидролиза является образование большого количества отходов, представляющих собой продукт нейтрализации кислот и щелочей (гипса).

Применение ферментативного осахаривания делигнифицированной биомассы, несмотря на свою экологическую чистоту, осложнено ингибированием ферментов продуктами предшествующей реакции и их дороговизной.

Альтернативным методом деполимеризации целлюлозы является применение одностадийного процесса гидролиза-дегидратации с использованием твердых кислотных катализаторов, в ходе которого основными продуктами реакции являются 5-гидроксиметилфурфурол (5-ГМФ) и глюкоза. 5-ГМФ можно с высокой эффективностью экстрагировать из каталитического гидролизата целлюлозы с применением органических растворителей. Таким образом, получаемый экстракт содержит глюкозу и другие растворимые олигосахариды (фруктозу, маннозу, целлобиозу), а также небольшое количество органических кислот и фурановых производных (например, фурфурола) и может быть использован для ферментации.

Получаемые путем гомогенного кислотного (так и щелочного) гидролиза целлюлозы сахара подвергают ферментации преимущественно с использованием мезофильных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Использование этого вида дрожжей позволяет получить до 55-58 л этанола из 100 кг ферментируемых сахаров с использованием гидролизных смесей [2]. Однако существенными проблемами для применения дрожжей S. cerevisiae являются их низкая устойчивость к повышенным температурам и к соединениям, образующимся в процессе гидролиза целлюлозы, в том числе к 5-ГМФ (IC₅₀ 8 мМ) и фурфуролу (IC₅₀ 5.8 мМ) [3]. В основном Saccharomyces cerevisiae обладают способностью продуцировать этанол при температурах 25-37°С, что повышает стоимость его производства.

Альтернативным применению дрожжей Saccharomyces cerevisiae для получения этанола является использование термотолерантных дрожжей, в том числе относящихся к видам Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces bulgaricus, Kluyveromyces marxianus, Ogataea polymorpha, Ogataea parapolymorpha, Cryptococcus tepidarius, Pichia thermomethanolica, Candida krabiensis, Candida sithepensis. Показано, что данные дрожжи обладают способностью к росту при температурах свыше 37-40°С, что делает процесс получения этанола экономически более выгодным. Наиболее перспективными продуцентами этанола среди них являются дрожжи Kluyveromyces marxianus. В отличие от дрожжей Saccharomyces cerevisiae, термотолерантные дрожжи Kluyveromyces marxianus обладают способностью к потреблению помимо глюкозы также ксилозы, целлобиозы и арабинозы, причем показатели продукции биомассы на таких субстратах, как глюкоза, фруктоза и манноза у дрожжей Kluyveromyces marxianus оказываются выше. Такие свойства, высокий уровень потребления сахаров, входящих в состав гидролизата, а также высокая устойчивость к соединениям, образующимся в процессе гиролиза, являются необходимыми для получения эффективного альтернативного продуцента этанола.

Ранее проводившиеся исследования по получению этанола на гидролизатах делигнифицированной биомассы, полученных с использованием гомогенных катализаторов (кислот и ферментов), показали возможность продукции этого соединения штаммами дрожжей Kluyveromyces marxianus.

Например, в работе [4] при ферментации дрожжами Kluyveromyces sp.IIPE453 на ферментативно гидролизованном жмыхе багассы при температуре 45°С была достигнута продуктивность по этанолу 0.36 г л^-1 ч^-1 и 88% от теоретического выхода на смеси гексоз. В работе [5] была исследована ферментация гидролизатов японского кедра и эвкалипта, полученного путем ферментативного осахаривания мехактивированной биомассы. Показано, что при температуре 42°С для штамма Kluyveromyces marxianus DMB1 выход этанола составляет 0.602±0.094 г/г потребленных сахаров и способен расти при 48°С. Падение показателей эффективности продуктивности по этанолу связывают с наличием в гидролизате ингибиторов.

В патенте US 8906654 [6] описаны штаммы Kluyveromyces marxianus NRRL Y-50798 и Kluyveromyces marxianus NRRL Y-50799, полученные путем УФ-мутагенеза, способные к ферментации сахаров (пентоз и гексоз) и продукции этанола. В аэробных условиях штаммы ферментируют глюкозу (при 47°С) и ксилозу, а также растут анаэробно на средах, содержащих галактуроновую кислоту, пектин, глюкозу, арабинозу, ксилозу и галактозу при 46°С. Недостатком данного штамма является отсутствие данных о его культивировании на гидролизатах лигноцеллюлозы (целлюлозы).

Штамм дрожжей Kluyveromyces marxianus SSSJ-0, описанный в патенте US 8304219 [7], обладает способностью к утилизации сахаров, в том числе целлобиозы, глюкозы, маннозы, галактозы или их комбинаций. С его использованием была показана продукция этанола в количестве 125 мг/л этанола на отходах переработки бумаги (350 мг) при 43°С путем их прямой ферментации штаммом дрожжей Kluyveromyces marxianus SSSJ-0. Данное изобретение ориентировано на использование дрожжей Kluyveromyces marxianus путем ферментации гидролизатов, полученных путем применения гомогенных катализаторов (кислот или ферментов) для получения этанола, а не гетерогенных кислотных катализаторов.

В патенте US 8268600 [8] описан штамм дрожжей Kluyveromyces sp.IIPE453 МТСС 5314, который способен ферментировать сахара (в т.ч. глюкозу, мальтозу, ксилозу, сахарозу и крахмал) и осуществлять ферментацию гидролизата биомассы, полученного с использованием разбавленного раствора серной кислоты и предварительно очищенного с использованием ионообменных смол при 50-55°С, в этанол с выходом 10-58.75%. Недостатком штамма, используемого в этом изобретении, является то, что его культивирование проводят на гидролизате, полученном путем обработки лигноцеллюлозной биомассы гомогенным катализатором (серной кислотой), а также низкий выход этанола.

В патенте ЕР 1130085 В1 [9] описан штамм-продуцент этанола Kluyveromyces marxianus СЕСТ 10875 (полученный путем химического мутагенеза), который применили для сбраживания гидролизата лигеноцеллюлозной биомассы, полученной путем ферментативной обработки биомассы после парового взрыва в течение 72 ч при 42°С. Недостатком данного изобретения является использование для культивирования штамма Kluyveromyces marxianus СЕСТ 10875 ферментативного гидролизата биомассы, сопровождающееся необходимостью применения дорогостоящих гидролитических ферментов.

Недостатками всех перечисленных изобретений, использующих штаммы дрожжей Kluyveromyces marxianus для получения этанола, является отсутствие данных об их применении для ферментации каталитических гидролизатов лигноцеллюлозы (целлюлозы), получаемых как побочный продукт получения 5-ГМФ и фурфурола. В предлагаемом изобретении использование подобного субстрата для культивирования позволяет (по сравнению с другими способами гидролиза биомассы) сократить количество образующихся отходов, а также осуществлять переработку лигноцеллюлозы в этанол с использованием штамма термотолерантных дрожжей Kluyveromyces marxianus с высоким выходом.

Изобретение решает задачу получение штамма-продуцента термотолерантных дрожжей для применения в процессе получения этанола путем культивирования на каталитическом гидролизате целлюлозы.

Задача решается тем, что предлагается штамм термотолерантных дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290, обладающий способностью к росту и продукции этанола на гидролизате, полученного путем одностадийного каталитического гидролиза-дегидратации микрокристаллической целлюлозы. По сравнению с описанными выше штаммами Kluyveromyces marxianus и Saccharomyces cerevisiae использование штамма Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 является предпочтительным за счет его высокой скорости роста, устойчивости к соединениям, входящим в состав получаемого гидролизата, высокой термотолерантности, что позволяют эффективно применять его для ферментации каталитических гидролизатов целлюлозы в этанол.

Предлагаемый в изобретении штамм дрожжей Kluyveromyces marxianus получен из кефира на среде YPD с 20 мкг/мл стрептомицина при 30°С и выделен в чистую культуру при температуре 40°С. Идентификацию штамма проводили методом ПЦР по последовательности 18s рРНК и ITS 1. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под номером Y-4290. Отличительными особенностями штамма Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 являются его высокая термотолерантность (рост при температурах до 50°С), что позволяет при его использовании снизить затраты на охлаждение в процессе ферментации. При культивировании он способен ферментировать большую часть сахаров (в т.ч. глюкозу, маннозу, фруктозу), входящих в состав каталитического гидролизата целлюлозы. Штамм характеризуется высоким уровнем продукции этанола, скоростью роста, а также обладает высокой устойчивостью к соединениям, входящим состав каталитического гидролизата целлюлозы, в том числе к 5-ГМФ и фурфуролу, что позволяет вести процесс получения этанола с высокой эффективностью.

Культурально-морфологические признаки

При культивировании в течение 3 суток при 42°С в среде YPD культура штамма Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 образует круглые и овальные клетки размером 4-8 мкм, наблюдаются как единичные клетки, так и расположенные цепочками. При культивировании в суспензионной культуре образует осадок. Размножается почкованием, образует споры. Цвет колоний на YPD агаре тусклый кремовый, колонии плоские, круглые с ровным краем.

Физиологические и биохимические признаки

Сбраживает D-глюкозу, D-галактозу, сахарозу, рафинозу.

Ассимилирует D-галактозу, сахарозу, целлобиозу, рафинозу, D-маннитол, этанол, лактат, сукцинат, D-маннозу, D-рибозу, D-ксилозу, L-сорбозу, D-глюкуроновую кислоту, лактозу, мальтозу, янтарную кислоту, D-арабинозу, глицерин. Растет в безвитаминной среде и на среде с 50% глюкозы. Растет при температурах 25-50°С и при рН 3.0-7.0.

Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ним.

Пример 1. Культивирование штамма дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 при температурах 37-50°С.

Ночную культуру штамма дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 выращивают до оптической плотности 0.8 - 1.0 при 595 нм в минимальной среде YNB с рН 4.75 (содержащей г/л: KH₂PO₄ 1.0, MgSO₄ 0.5, NaCl 0.1, CaCl₂ 0.1, (NH₄)₂SO₄ 5.0) с 5.0 г/л пептона ферментативного, 3.0 г/л дрожжевого экстракта и 20 г/л глюкозы. 20 мкл клеток с конечной концентрацией 5×10⁶ клеток в 1 мл вносят в 180 мкл среды YNB и 1 г/л дрожжевого экстракта в лунку 96-луночного планшета с соответствующим моносахаридом (глюкоза, манноза, сахароза или целлобиоза) в концентрации 20 г/л. Культиривирование проводят при 350 об/мин в течение 16 ч при температуре 42-48°С.

На Фиг. 1 приведены значения оптической плотности культуры после окончания культивирования. Штамм Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 обладает наибольшим ростом на средах с глюкозой, маннозой и фруктозой.

Количественное определение параметров роста штамма Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 проводят путем аэробного культивирования в глубоких 96-луночных планшетах в системе "Microflask" (Applikon Biotechnology). Клетки предварительно выращивают в среде YNB с 5 г/л пептона ферментативного, 3 г/л дрожжевого экстракта и 20 г/л глюкозы, затем их отделяют центрифугированием при 500×g 10 мин, двукратно отмывают, добавляют среду YNB с 2% глюкозой и 1 г/л дрожжевого экстракта до концентрации 5×10⁵ клеток в 1 мл. Культивирование проводят при 400 об/мин в течение 8-10 ч, при температуре 37-50°С, параллельно определяют оптическую плотность при 595 нм и измеряют количество глюкозы в культуральной жидкости глюкозооксидазным методом.

Проводят расчет специфической скорости роста (μ ч^-1), выхода биомассы по глюкозе (Y_b/s, г г^-1), биомассы (г Л^-1), результаты приведены в таблице 1.

Максимальной специфической скоростью роста (μ) и продукцией биомассы штамм Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 обладает при 42°С.

Пример 2. Устойчивость штамма дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 к ингибиторам ферментации.

Проводят аэробное культивирование дрожжей в 96-луночных планшетах, как описано в примере 1, в присутствии соединений, входящих в состав каталитического гидролизата целлюлозы или образующихся в процессе ферментации, в том числе 5-ГМФ, фурфурола, уксусной кислоты, муравьиной кислоты, молочной кислоты, гликолевой кислоты, винной кислоты, этанола, при 42°С в течение 8-10 ч при достижении стационарной фазы роста. Ингибирующее влияние веществ оценивают как индекс IC₅₀, соответствующий концентрации вещества, соответствующе 50% снижению роста биомассы, данные приведены в таблице 2.

Штамм Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 обладает высокой устойчивостью к 5-ГМФ и фурфуролу по сравнению со значениями, полученными для дрожжей Saccharomyces cerevisiae [3], а также штамм обладает устойчивостью к прочим соединениям, входящим в состав каталитического гидролизата целлюлозы.

Пример 3. Продукция этанола и биомассы штамма дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 на смесях сахаров, входящих в состав каталитических гидролизатов.

Для проведения ферментации культуру дрожжей выращивают на плотной агаризованной среде, содержащей 20 г/л пептона ферментативного, 10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л глюкозы, при 42°С в течение 2 суток, одну колонию вносят в 10 мл среды с рН 4.75, содержащей 5.0 г/л пептона ферментативного, 3.0 г/л дрожжевого экстракта и смесь сахаров (глюкоза 20 г/л, манноза 1,6 г/л, фруктоза - 0.8 г/л, целлобиоза 1,3 г/л), добавляют соли из среды YNB, дрожжевой экстракт 1.0 г/л и пептон ферментативный 5 г/л, затем культивируют аэробно при 42°С, 250 об/мин до достижения оптической плотности 1.0 при 565 нм. Затем клетки отделяют центрифугированием при 500×g 10 мин и вносят их в количестве, соответствующем 1.0 г/л сухой биомассы, в 10 мл той же среды, но не содержащей пептона ферментативного. Ферментацию проводят анаэробно при перемешивании 100 об/мин, при 42°С. В течение эксперимента оценивают ОП клеток при 595 нм и анализируют состав культуральной жидкости. Состав продуктов в образцах определяют методом ВЭЖХ с использованием хроматографа Shimadzu LC-20AD XR LC на колонке Rezex ROA-Organic Acid Н+ 300×7.8 мм (Phenomenex). В качестве мобильной фазы используют 0.005 Н серную кислоту в воде. Скорость потока подвижной фазы составляет 0.6 мл мин^-1, время анализа - 50 мин, температура колонки - 65°С.

Результаты приведены на Фиг. 2.

При культивировании штамма Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 выход этанола по ферментируемым сахарам (глюкозе, маннозе, фруктозе) составляет 0.44±0.02 г/г, специфическая скорость роста равна 0.29±0.01 ч^-1. Выход этанола в процентах от теоретического (максимальный теоретический выход этанола был принят как 0.521 г/г ферментируемых сахаров, в т.ч. глюкозы, маннозы и фруктозы) составляет 84.0±4.2%.

Пример 4. Продукция биомассы штаммом дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 на каталитическом гидролизате микрокристаллической целлюлозы.

Для гидролиза мехактивированной микрокристаллической целлюлозы используют окисленный влажным воздухом катализатор «Сибунит-4» [10]. Реакцию гидролиза проводят при температуре 180°С и давлении аргона 1 МПа, в автоклаве при перемешивании 1500 об/мин в течение 5 ч. Полученный раствор предварительно фильтруют, затем упаривают при температуре 70°С, после чего добавляют один объем изобутанола, тщательно перемешивают и отбирают водную часть, экстракцию повторяют три раза. Полученный раствор повторно упаривают, проводят нейтрализацию раствора до значения рН 4.75. После нейтрализации добавляют соли среды YNB и дрожжевой экстракт до концентрации 1 г/л. Для нейтрализации используют аммиак, NaOH или Са(ОН)₂. В случае Са(ОН)₂ нейтрализацию проводят путем добавления Са(ОН)₂ до рН 9.0, затем титруют соляной кислотой до рН 4.75.

Результаты определения эффективности роста биомассы при различных методах нейтрализации приведены в таблице 3.

Пример 5. Продукция этанола штаммом дрожжей Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 на каталитических гидролизатах микрокристаллической целлюлозы.

Получение каталитического гидролизата целлюлозы проводят как в примере 4, за исключением того, что для нейтрализации используют аммиак. Культивирование проводят анаэробно в 96-луночных глубоких планшетах, в системе "Microflask" (Applikon Biotechnology). Клетки предварительно выращивают в среде YNB с 5 г/л пептона ферментативного и 3 г/л дрожжевого экстракта с 2% глюкозой, отделяют центрифугированием при 500×g 10 мин, затем двукратно отмывают, добавляют 1 мл нейтрализованного гидролизата с 1 г/л дрожжевого экстракта до концентрации клеток 1 и 2 г/л. Культивирование проводят при 400 об/мин в течение 48 ч, при температуре 42°С. По окончании культивирования определяют оптическую плотность при 595 нм и анализируют продукты методом ВЭЖХ.

Данные приведены в таблице 4.

Максимальный выход этанола в 83.9±5.0% от теоретического наблюдается при начальной плотности клеток Kluyveromyces marxianus ВКПМ Y-4290 1.0 г/л.

Литература

[1] Громов Н.В., Таран О.П., Сорокина К.Н., Мищенко Т.И., Утанди Ш., Пармон В.Н. Новые методы одностадийной переработки полисахаридных компонентов лигноцеллюлозной биомассы (целлюлозы и гемицеллюлоз) в ценные продукты. Часть 1. Методы активации биомассы // Катализ в промышленности. 2016. Т. 16. №1. Р. 74-83.

[2] Холькин Ю. И. Технология гидролизных производств / - Москва: "Лесная промышленность", 1989. - 496 с.

[3] Jayakody L.N., Horie K., Hayashi N., Kitagaki H. Molecular mechanisms for detoxification of major aldehyde inhibitors for production of bioethanol by Saccharomyces cerevisiae from hotcompressed water-treated lignocellulose Mendez-Vilaz A. Material and process for energy: communicating current research and technological developments. Formatex Research Center, Badajox, Spain. 2013. P. 302-311.

[4] Dasgupta D., Ghosh P., Ghosh D., Suman S.K., Khan R., Agrawal D., Adhikari D.K. Ethanol fermentation from molasses at high temperature by thermotolerant yeast Kluyveromyces sp.IIPE453 and energy assessment for recovery // Bioprocess Biosyst Eng. 2014 V. 37 №10. P. 2019-2029.

[5] Goshima T, Tsuji M, Inoue H, Yano S, Hoshino T, Matsushika A. Bioethanol production from Lignocellulosic biomass by a Kluyveromyces marxianus II Biosci. Biotechnol Biochem. 2013. V. 77. №7. P. 1505-1510.

[6] Патент US 8906654, C12N 1/16, 09.12.2014.

[7] Патент US 8304219, C12N 1/16, 06.11.2012.

[8] Патент US 8268600, C12N 1/16, 18.09.2012.

[9] Патент ЕР 1130085, B1. C12P 7/10, C12N 1/16, 05.10.2005

[10] Патент RU2583953, C07C 307/40, 01.05.2016.