Результат интеллектуальной деятельности: Набор lux-биосенсоров для детекции токсичных продуктов неполного окисления несимметричного диметилгидразина в среде

Изобретение относится к оценке степени загрязнения окружающей среды несимметричным диметилгидразином (НДМГ) и генотоксичными продуктами его окисления, а также может быть использовано в исследованиях биологических объектов.

Известен способ определения НДМГ и продуктов его окисления в окружающей среде физико-химическими средствами [1-3]. Сущность этого способа заключается в проведении фотометрического анализа продуктов распада НДМГ или высокоразрешающего хроматографического (газовая хроматография) разделения химических соединений с масс-спектрометрическим детектированием [1], и идентификации НДМГ и его продуктов распада с помощью методов ЯМР и инфракрасной спектроскопии [2]. Недостатком химических методов является необходимость использования дорогостоящей аппаратуры, а также сложность проведения анализа в связи с высокой нестабильностью НДМГ [3].

В настоящее время широкое распространение для определения загрязнения окружающей среды токсичными веществами получили методы биотестирования с использованием lux-биосенсоров. Известны методы, основанные на тушении биолюминесценции токсикантами, в которых используется механизм ингибирующего действия ядовитых веществ на метаболизм клетки, в основном на дыхательную цепь, что опосредованно влияет на люциферазную реакцию, вызывая ослабление интенсивности биолюминесценции клеток. В этой серии методик, используемых в качестве экспресс-контроля токсичности природных сред, наибольшее распространение в странах Европы и в США получил т.н. «Микротокс» (Microtox 5ТМ), в котором в качестве биосенсора используются лиофилизированные морские бактерии Photobacterium phosphoreum. В России в подобных тестах используется генно-инженерный штамм Escherichia coli, с генами lux-оперона морских люминесцирующих бактерий Photobacterium leiognathi («Эколюм-08») [4]. Недостатком метода является неспецифичность реакции и невысокая чувствительность. Для идентификации химического соединения, вызвавшего уменьшение интенсивности свечения клеток, требуется дополнительный анализ.

Известно также обнаружение токсикантов с использованием lux-биосенсоров на основе бактерий Е. coli, содержащих плазмиды с lux-генами под контролем индуцируемых стрессовых промоторов [5]. Эти lux-биосенсоры, как указано в приведенном патенте США, были использованы для определения нитратов, фенолов, бензина и других токсикантов, но не использовались для обнаружения в среде НДМГ или продуктов его окисления.

Для определения в среде НДМГ использовался набор lux-биосенсоров в патенте РФ 2297450 [6]. НДМГ, являясь сильным восстановителем, при попадании в окружающую среду взаимодействует с атмосферным кислородом с образованием стабильных продуктов окисления, некоторые из которых являются генотоксичными [7, 8, 9]. Важной составляющей генотоксичности производных окисления НДМГ составляет алкилирующее соединение N-нитрозодиметиламин (НДМА). В патенте РФ 2569156 [10] для детекции алкилирующей активности продуктов неполного окисления НДМГ, к которым относится НДМА, использовался P_alkA промотор, транскрипционно-слитый с luxCDABE кассетой, остальные биосенсоры были теми же, что и в патенте [6].

Техническим результатом предложенного изобретения является возможность быстрой детекции малых концентраций НДМГ и его токсичных производных в окружающей среде. Чувствительность предложенного набора к токсичным продуктам неполного окисления НДМГ по сравнению с прототипом возросла примерно в 5 раз. Измерения не требуют дорогой и сложной аппаратуры, возможны как в стационарных, так и в полевых условиях.

Для достижения этого результата предложено использовать набор lux-биосенсоров на основе бактерий Е. coli, трансформированных гибридными плазмидами с lux-генами под контролем индуцируемых стрессовых промоторов P_oxyR, P_colD, P_alkA, P_soxS и P_grpE. В предложенном наборе промоторы P_oxyR, Р_colD используются вместо P_katG и Р_rесА соответственно, остальные промоторы, как в патенте [10], а именно P_alkA, P_soxS и P_grpE - В результате трансформации клеток Е. coli гибридными плазмидами, содержащими lux-гены под контролем вышеописанных промоторов получены цельноклеточные биосенсоры: Е. coli pAlkA-lux, Е. coli pOxyR-lux, E.coli pSoxS-lux и E.coli pColD-lux, E.coli pGrpE-lux.

В предложенном изобретении для определения токсичных продуктов неполного окисления НДМГ использована группа биосенсоров, обладающих большей чувствительностью к малым концентрациям токсикантов, чем биосенсоры, применяемые ранее. При попадании токсиканта в среду сигнал (биолюминесценция) клеток индуцируется (увеличивается).

Сущность изобретения поясняется прилагаемыми графиками, где на фиг.1 показано сравнение люминесценции биосенсоров Е. coli pOxyR-lux и Е. coli pKatG-lux в зависимости от времени их инкубирования, в среде с присутствием перекиси водорода в концентрации, близкой к пороговой, 3 мкМ. На фиг.2 - приведена зависимость люминесценции биосенсоров Е. coli pOxyR-lux и Е. coli pKatG-lux от количества продуктов неполного окисления НДМГ во влажной почве. На фиг. 3 показано сравнение реакции биосенсоров Е. coli pRecA-lux и Е. coli pColD-lux на митомицин С. На фиг. 4 показана реакция биосенсора Е. coli pSoxS-lux, на продукты неполного окисления НДМГ атмосферным кислородом (в зависимости от времени действия и концентрации НДМГ). На фиг. 5 приведена зависимость эффективности действия продуктов неполного окисления НДМГ от степени окисления НДМГ перекисью водорода для биосенсора с промотором Р_AlkA.

В процессе действия продуктов неполного окисления НДМГ на клетку происходит индукция биолюминесценции у биосенсоров Е. coli pAlkA-lux, Е. coli pOxyR-lux, Е. coli pSoxS-lux и E.coli pColD-lux, но не для биосенсора Е. coli pGrpE-lux, являющегося контрольным (поэтому данные для биосенсора PgrpE::lux не приводятся). Как видно из графиков, представленных на фиг. 2, 4, 5, при выдерживании проб с НДМГ и продуктами его неполного окисления наблюдается со временем значительное усиление (примерно в 10-100 раз) интенсивности биолюминесценции клеток - биосенсоров. На фиг. 1 показана люминесценция биосенсоров Е. coli pOxyR-lux и Е. coli pKatG-lux при добавлении клеткам биосенсора (180 мкл культуры) 20 мкл перекиси водорода до конечной концентрации, близкой к пороговой, 3 мкМ. Как видно из фиг. 1, биосенсор Е. coli pOxyR-lux показывает существенно более высокую амплитуду индукции. Как видно из данных, приведенных на фиг. 2, люминесценция биосенсоров Е. coli pOxyR-lux и Е. coli pKatG-lux от количества продуктов неполного окисления НДМГ во влажной почве существенно различается. Биосенсор Е. coli pOxyR-lux обладает более высокой чувствительностью и амплитудой индукции к малым концентрациям производных НДМГ. Для этих измерений образцы влажной почвы (1/1 - почва/вода) инкубировались в присутствии НДМГ в различных концентрациях. Затем аликвоты надосадочной жидкости из полученных образцов добавлялись в кювету с биосенсорными штаммами. По оси абсцисс на фиг. 2 отложена концентрация НДМГ в кювете (имея в виду, что в реальности после инкубации в основном в образцах присутствуют продукты неполного окисления НДМГ, а не сам НДМГ). На фиг.3 продемонстрирована люминесценция биосенсоров Е. coli pRecA-lux и Е. coli pColD-lux на митомицин С (10^-6 М/л в пробе). По полученным данным можно судить, что Е. coli pOxyR-lux и Е. coli pColD-lux обладают повышенной чувствительностью к специфическим токсикантам и, следовательно, способны к детекции более низких концентраций продуктов неполного окисления НДМ. Результаты, приведенные на фиг.5, показывают, что биосенсор Е. coli pAlkA-lux увеличивает люминесценцию в зависимости от степени окисления НДМГ перекисью водорода. Согласно данным масс-спектрометрического анализа при обработке НДМГ перекисью водорода возникает алкилирующее соединение N-нитрозодиметиламин [8]. Как видно из приведенных на фиг.5 данных, амплитуда ответа биосенсора Е. coli pAlkA-lux зависит от количества алкилирующих соединений, возникающих при окислении НДМГ [10].

У бактерий можно выделить регуляторные системы, специфически реагирующие на токсиканты, действующие на: 1) клеточные мембраны, 2) белки, 3) хромосому (ДНК), а также 4) индуцирующие в клетке окислительный стресс. В качестве биосенсора на токсиканты, действующие на клеточные белки, предложено использовать промотор P_grpE. Этот промотор в бактериальном геноме расположен перед генами «теплового шока» и открывается лишь при появлении в клетке модифицированных, денатурированных белков. В роли биосенсора на ДНК-тропные агенты используется SOS-промотор P_ColD и промотор, отвечающий за экспрессию гликозилазы Р_AlkA. Промотор Р_ColD открывается лишь при индукции повреждений в геноме, т.е. в молекулах ДНК, останавливающих репликационную вилку. Для детекции алкилирования ДНК (данные повреждения зачастую не останавливают репликационную вилку и не вызывают индукцию SOS ответа) был использован промотор Р_AlkA. Для детекции веществ, индуцирующих в клетке окислительный стресс (образующих в клетке гидроксильный радикал, супероксид-ион-радикал, перекись водорода) были использованы промоторы P_oxyR и P_soxS. Промотор P_oxyR специфически реагирует на перекись водорода, органические пероксиды. Промотор P_soxS открывается при появлении в среде супероксид-анион-радикала.

Следует отметить, что появление в клетке активных форм кислорода, фиксируемых промоторами P_oxyR и P_soxS, приводит к окислительным повреждениям ДНК. Таким образом, супероксид анион радикал и перекись водорода, возникающие при восстановлении атмосферного кислорода несимметричным диметилгидразином, являются существенной стороной генотоксичного воздействия на клетку продуктов окисления НДМГ [7].

В данном изобретении сконструированы основанные на этих индуцируемых промоторах специфические lux-биосенсоры. Все используемые промоторы с соответствующими регуляторными участками были получены из генома бактерий Escherichia coli К12 MG1655 с помощью метода ПЦР с использованием специальных, синтезированных праймеров. В качестве вектора использовали беспромоторный вектор с репликоном ColE1 и геном blа, определяющим резистентность к ампициллину (селективный маркер). Встраивание промоторной области в плазмиду проводили по сайтам ЕсоRI-ВаmHI. В качестве lux-кассеты был выбран lux-оперон Photorhabdus luminescens, состоящий из пяти генов, luxCDABE. Данная кассета имеет два преимущества: во-первых, люцифераза Ph. luminescens (гены luxAB) отличается сравнительно высокой термостабильностью, а, во-вторых, к суспензии клеток не надо добавлять субстрат люциферазной реакции - алифатический альдегид, так как он синтезируется в клетке при помощи белков, кодируемых генами luxCDE [11].

Полученными конструкциями трансформированы клетки Escherichia coli методом электропорации [12]. В результате получены следующие цельноклеточные биосенсоры: Е. coli pAlkA-lux, Е. coli pOxyR-lux, Е. coli pSoxS-lux и E.coli pColD-lux, E.coli pGrpE-lux.

Методика измерения влияния токсиканта на биолюминесценцию биосенсора была примерно одинаковой для всех lux-биосенсоров.

Определение генотоксичных продуктов неполного окисления НДМГ в среде с помощью lux-биосенсоров требует проведения следующих операций.

1. Приготовление проб, содержащих соответствующие биосенсоры;

- выращивание клеток Е. coli, являющихся биосенсорами, до экспоненциальной фазы (OD=0,2-0,4);

- отбор проб по 200 мкл в виалы (6-8 виал для каждого биосенсора).

2. Добавление к пробам НДМГ или жидкой среды с НДМГ в различных концентрациях;

- приготовление для каждого биосенсора положительного и отрицательного контролей. В качестве положительного контроля используют НДМГ (разведенный в воде) в концентрации 20 мкг/мл (отрицательный контроль - дистиллированная вода);

- добавление по 20 мкл исследуемой среды к каждой пробе каждого биосенсора;

(Все пробы следует приготовить в двойном или тройном экземплярах и затем использовать средние значения полученных экспериментальных величин).

3. Измерение интенсивностей биолюминесценции проб в течение 1-2 часов для биосенсоров Е. coli pOxyR-lux, Е. coli pSoxS-lux и Е. coli pGrpE-lux. Для биосенсора Е. coli pColD-lux и Е. coli pAlkA-lux измерение следует проводить 2,5-3 часа. Однако наличие высоких концентраций токсичных производных в среде фиксируется уже через 15-20 минут.

4. Обработка полученных результатов. Полученные графики на контрольных образцах сравнивают с исследуемым образцом.

Культуру клеток, содержащих гибридную плазмиду с соответствующим промотором и lux-кассетой, растили при 28°С или 37°С на качалке до ранней или средней экспоненциальной фазы (OD=0,2-0,4). Аликвоты этой культуры (по 200 мкл) переносили в стерильные виалы и добавляли в них по 10 мкл тестируемого вещества требуемой концентрации. Для приготовления образцов с продуктами неполного окисления НДМГ в почве применяли следующую методику. Образцы влажной почвы (1/1 - почва/вода) инкубировались в присутствии НДМГ в различных концентрациях при комнатной температуре 7 дней. Затем аликвоты надосадочной жидкости из полученных образцов добавлялись в кювету с биосенсорными штаммами. В контрольную пробирку добавляли 10 мкл дистиллированной воды. Затем пробы инкубировали без перемешивания при 30°С и через каждые 15 мин измеряли интенсивность биолюминесценции при комнатной температуре. Усиление сигнала фиксировалось уже через 15-20 мин - время, необходимое для синтеза люциферазы. Максимальный ответ биосенсора, как правило, наблюдался через 40-60 мин (в случае промоторов Р_ColD и Р_alkA максимальный сигнал фиксировался через 90-120 мин) и при оптимальной концентрации токсиканта превышал начальный сигнал в 100-1000 раз.

В результате наших исследований было показано, что основными промоторами, открывающимися при воздействии на клетки генотоксичных продуктов неполного окисления НДМГ, являются промоторы P_alkA, P_oxyR, P_soxS, Р_соlD. Биосенсор с промотором P_grpE не изменял интенсивность биолюминесценции. Поэтому данные по данному промотору не приведены на фиг. 1-5.

В табл.1 приведены данные о минимальных (пороговых) концентрациях стандартных, специфических для данного промотора веществ, индуцирующих заметный (в 2-3 раза) эффект усиления биолюминесценции, в конструированных lux-биосенсорах (митомицин С индуцирует повреждения в ДНК, этанол - в белках, перекись водорода и паракват как генератор супероксид-ион-радикалов индуцируют окислительный стресс, нитрозогуанидин (N'-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин H₂NC(=NH)NHNO) (МННГ) алкилирует ДНК).

НДМГ, по всей видимости, в отличие от представленных в табл. 1 соединений, не обладает высокой специфичностью к тому или другому биосенсору, так как в связи с высокой реакционной активностью (очень сильный восстановитель) способен повреждать макромолекулы. В результате появляется большой набор продуктов окисления НДМГ, а также органических соединений из водной среды и почвы, взаимодействующих с внесенным НДМГ. Поэтому оптимальным решением проблемы фиксации токсичных производных неполного окисления НДМГ в среде является использование всех вышеуказанных luх-биосенсоров.

Так как промотор P_oxyR открывается лишь при воздействии перекиси водорода на белок-регулятор OxyR (окисление активного центра [Fe-S]), а промотор P_soxS открывается лишь при воздействии супероксид-анион-радикала, то можно считать доказанным, что действие НДМГ на бактериальную клетку в основном определяется формированием активных форм кислорода, в частности, гидроперекиси и супероксид-анион-радикала (в результате восстановления кислорода воздуха до перекиси водорода).

Гидроперекись, образованная в результате химических реакций НДМГ H₂NN(CH₃)₂ в основном с кислородом O₂, открывает промотор Р_охуR, причем столь же эффективно, как и перекись водорода, используемая в качестве стандарта:

O₂+H₂NN(CH₃)₂= (супероксид-радикал) + HNN(CH₃)₂, причем супероксид-радикал быстро переходит в перекись водорода:

=Н₂O₂+O₂,

Превращение супероксид-анион-радикала в перекись водорода происходит как спонтанно, так и в результате действия клеточного фермента супероксид-дисмутазы.

Действие НДМГ на ДНК и, соответственно, на промотор P_colD, в начальной стадии носит косвенный характер и определяется в основном формирующимися активными формами кислорода. Этот вывод следует из данных о влиянии перекиси водорода на биосенсор pColD-lux, а также из данных по снижению активации промотора P_colD в присутствии каталазы [7]. Дальнейшее окисление НДМГ приводит к появлению алкилирующих соединений, взаимодействующих с ДНК, фиксируемых биосенсором Е. coli pAlkA-lux. Взаимодействие НДМГ с гумусом почв приводит к появлению соединений, приводящих к повреждениям в ДНК, вызывающим SOS-ответ бактерий, не снимающийся в присутствии каталазы (неопубликованные данные).

Влияние НДМГ на биосенсор Е. coli pGrpE-lux практически отсутствует, поэтому данный биосенсор служит отрицательным контролем в данном наборе биосенсоров.

Изобретение позволяет создать высокочувствительный, дешевый и быстрый тест-метод на основе измерения интенсивности биолюминесценции.

Источники информации

1. Дмитриев О.Ю., Иваненко С.И., Овсянников Д.А., Смирнова С.С., Чистова Ж.А. В Сб. «Труды Российской инженерной академии, Секция «Инженерные проблемы стабильности и конверсии», Выпуск 11. «Экологические проблемы разработки и эксплуатации ракетно-космической техники», Москва, СИП РИА, 2004 г. стр. 40-43.

2. Лопырев В.А., Долгушин Г.В., Ласкин Б.М. (2001) Журнал Рос.хим. об-ва им. Д.И. Менделеева, т. XLV, №5-6, стр. 149-156.

3. Кузнецова Л.В. В Сб. «Труды Российской инженерной академии, Секция «Инженерные проблемы стабильности и конверсии», Выпуск 12. «Экологические проблемы разработки и эксплуатации ракетно-космической техники», Москва, СИП РИА, 2004 г., стр. 24-25.

4. Патент РФ 2366953, МПК G01N 33/487, опубл. 2009.

5. Патент США №5683868, МПК C12N 1/21, опубл. 1997.

6. Патент РФ 2297450, МПК C12N 1/21, опубл. 2007.

7. Zavilgelsky, G.В.; Kotova, V. Yu.; Manukhov, I. V. (2007) Action of 1,1 -dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide. // Mutation research-genetic toxicology and environmental mutagenesis. Volume: 634 Issue: 1-2 P. 172-176.

8. Горянин И.И., Котова В.Ю., Краснопеева Е.Д., Чубуков П.А., Балабанов В.П., Чалкин С.Ф., Шатров Т.Я., Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. Определение генотоксического действия 1,1-диметилгидразина алкилирующими соединениями, возникающими при его окислении, и перекисью водорода. // Труды Московского физико-технического института. 2013. Т. 5. №1-17. С. 103-111.

9. Anti Poso, Arte von Wright, Jukka Gynther (1995) Mutation Research. V. 332, РР/ 63-71.

10. Патент РФ 2569156, МПК C12N 1/21, опубл. 2015 – прототип.

11. Завильгельский Г.Б., Зарубина А.П., Манухов И.В. (2002) Молекулярная биология, т. 36. стр. 792-804.

12. http://molbiol.ru/protocol/03_05.html.