СПОСОБ СОЗДАНИЯ НАБОРОВ МИКРОСФЕР, ОПТИЧЕСКИ КОДИРОВАННЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ НАНОКРИСТАЛЛАМИ И НЕСУЩИХ НА СВОЕЙ ПОВЕРХНОСТИ РАСПОЗНАЮЩИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЫ

Способ создания наборов микросфер, оптически кодированных флуоресцентными нанокристаллами и несущих на своей поверхности распознающие биологические молекулы, может применяться для создания сенсоров и диагностикумов новых поколений, обеспечивающих высокочувствительную многопараметрическую детекцию анализируемых молекул - биомаркеров заболеваний - в биологических жидкостях и тканях.

Известны способы создания оптически кодированных полимерных микросфер, получаемых путем включения в их состав органических флуоресцентных красителей (WO 2006115870). Микросферы с различными оптическими кодами, несущие на своей поверхности распознающие биологические молекулы, используют для многопараметрической детекции биологических аналитов методом проточной цитометрии. Для этого на поверхности микросфер иммобилизуют распознающие биологические молекулы, специфически связывающие аналит в анализируемом образце биологической жидкости или суспензии ткани. Принцип детекции основан на формировании диагностического комплекса на поверхности микросферы, состоящего из распознающей молекулы, аналита и детектирующей молекулы, несущей вторичную флуоресцентную метку. Количественное определение аналита осуществляется за счет детекции и сопоставления двух сигналов: флуоресценции микросфер и флуоресценции вторичной метки, при этом интенсивность флуоресценции вторичной метки пропорциональна количеству аналита, связавшегося с поверхностью микросфер. Для многопараметрической детекции нескольких аналитов в одном образце используют набор популяций микросфер с различными оптическими кодами, при этом каждая популяция микросфер несет на своей поверхности распознающие биологические молекулы определенного типа, способные специфически связывать только один тип аналита в анализируемом образце. Для многопараметрической детекции важны возможности эффективного разделения сигналов всех используемых популяций микросфер и вторичной флуоресцентной метки.

Недостатком описанного способа является ограниченное количество оптических кодов, получаемых введением только одного типа молекул органического красителя в каждую популяцию микросфер.

Известен способ получения оптически кодированных микросфер путем включения в состав каждой популяции микросфер двух или более типов органических флуоресцентных красителей (US 7445844 В2). Оптически кодированные микросферы получают инкубированием полимерных микросфер с размягчающими полимер растворами органических растворителей, содержащими смеси органических красителей в заданных соотношениях. Путем варьирования количественных соотношений органических красителей в исходной смеси получают набор популяций микросфер с различными оптическими кодами, причем интенсивности флуоресценции красителей в составе микросфер оказываются пропорциональными их концентрациям в исходной смеси. В одном из примеров применения микросферы могут быть использованы для многопараметрической детекции различных биологических аналитов.

Также известен способ получения набора оптически кодированных микросфер (US 6268222), состоящих из полимерных микрочастиц, на поверхности которых иммобилизованы наночастицы, содержащие флуоресцентные красители. При этом оптический код достигается путем варьирования количества иммобилизованных наночастиц, каждая из которых принадлежит популяции частиц, окрашенных определенным красителем.

Общим недостатком вышеперечисленных методов является использование для оптического кодирования микросфер флуоресцентных органических красителей, спектральные свойства которых не позволяют использовать единый источник возбуждающего излучения для одновременного возбуждения флуоресценции всех красителей, входящих в состав разных популяций микросфер в составе набора, и, таким образом, ограничивают количество доступных оптических кодов.

Известны способы создания водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов (WO /2002/073155) и наноразмерной диагностической метки на основе конъюгатов однодоменных антител и водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов (RU 2560699), оптические свойства которых зависят от их размера и которые превосходят все известные органические красители, отличаясь высокой интенсивностью флуоресценции, фотостабильностью, широкими спектрами возбуждения и узкими спектрами фотолюминесценции, обеспечивающими возможность одновременного возбуждения флуоресценции квантовых точек нескольких цветов, используя один источник возбуждающего излучения. Однако указанные диагностические метки, вследствие их малого размера, не применимы для многопараметрической детекции низкомолекулярных маркеров заболеваний методом проточной цитометрии.

Известен способ включения флуоресцентных нанокристаллов одного цвета в состав микросфер в процессе их полимеризации (WO 2005021150), а также способ получения спектрально кодированных микросфер путем включения нанокристаллов различных цветов, в различных количественных соотношениях, в процессе полимеризации микросфер (US 2002/0164271 A1). Также известен способ получения оптически кодированных полимерных микросфер путем иммобилизации на их поверхности флуоресцентных нанокристаллов различных цветов за счет химического связывания активных поверхностных групп нанокристаллов и микросфер (US 6309701 В1).

Также известен способ получения полимерных микросфер (WO 2003003015), спектрально кодированных за счет диффузии нанокристаллов различных цветов в поры микросфер, для чего определенные количества нанокристаллов одного или нескольких цветов добавляют к предварительно набухшим в органическом растворителе микросферам и инкубируют до тех пор, пока не произойдет диффузия нанокристаллов внутрь пор подходящего размера.

Общим недостатком вышеописанных методов является отсутствие пространственного разделения нанокристаллов различных цветов в составе микросфер, что приводит к резонансному переносу энергии между нанокристаллами разного цвета и, как следствие, к искажению заданного оптического кода микросфер.

Известен способ оптического кодирования микросфер, включающий в себя пространственное разделение нанокристаллов различных цветов (US 7674844 В2). Способ заключается во включении в состав полимерных сфер, в процессе их полимеризации, микрочастиц меньшего размера, окрашенных флуоресцентными нанокристаллами. Для этого используют популяции микрочастиц, каждая из которых окрашена нанокристаллами только одного цвета, причем включение в состав микросфер различных популяций микрочастиц в различных количественных соотношениях позволяет получать различные оптические коды, а интенсивность сигнала каждой популяции варьируется ступенчато за счет возможности включения строго определенного количества микрочастиц. Недостатком данного метода является наличие длительных стадий получения составных компонентов микросфер - микрочастиц, окрашенных нанокристаллами.

Известен способ, заключающийся в формировании на поверхности полимерных микросфер полиэлектролитных слоев, состоящих из положительно и отрицательно заряженных полиэлектролитов с введенными между слоями визуализирующими агентами - органическими красителями или полупроводниковыми нанокристаллами (RU 2 532 559 С1). Способ позволяет получить флуоресцентные микросферы, однако не позволяет получать наборы флуоресцентных микросфер с различными оптическими кодами для многопараметрической одновременной детекции биологических аналитов.

Этот способ выбран в качестве прототипа предложенного решения.

Технический результат изобретения заключается в расширении функционала флуоресцентных микросфер за счет получения наборов спектрально кодированных микросфер, имеющих на своей поверхности определенные функциональные химические группы и содержащих строго определенное количество полиэлектролитных слоев и различные комбинации флуоресцентных нанокристаллов с отличающимися оптическими свойствами, причем нанокристаллы в составе микросфер пространственно разделены более чем тремя полиэлектролитными слоями на расстояния, превышающие 10 нм, что позволяет достигнуть не менее ста тысяч оптических кодов популяций микросфер при отсутствии искажений оптических кодов за счет исключения явлений эффективного Ферстеровского резонансного переноса энергии между нанокристаллами различных цветов.

Указанный технический результат обеспечивается тем, что в способе создания наборов микросфер, оптически кодированных за счет нанесения на их поверхность слоев противоположно заряженных полиэлектролитов и слоев водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов и несущих на своей поверхности распознающие биологические молекулы, оптическое кодирование осуществляют за счет нанесения нескольких слоев флуоресцентных нанокристаллов, причем слой флуоресцентных нанокристаллов одного цвета пространственно отделяют от соседнего слоя нанокристаллов другого цвета несколькими слоями полиэлектролитов, при этом для формирования внешнего слоя полиэлектролита используют полимер, включающий в себя функциональные группы, с помощью которых осуществляют химические реакции связывания с функциональными группами распознающих биологических молекул.

Существует вариант, в котором в качестве микросфер используют полимерные микросферы с размером от 2 до 10 мкм.

Существует также вариант, в котором полимерные микросферы представляют собой меламиновые, полистереновые, полиметилметакрилатные или силикагелевые частицы, поверхность которых предварительно функционализируют.

Возможен вариант, в котором функционализация поверхности микросфер проводится введением амино- или карбоксильных групп.

Возможен также вариант, в котором для оптического кодирования микросфер используют полупроводниковые нанокристаллы типа «ядро-оболочка», состоящие из атомов элементов II-VI или III-V групп периодической таблицы Менделеева и имеющие размер меньше радиуса экситона Бора для данного материала.

Существует вариант, в котором в качестве полупроводниковых нанокристаллов используют нанокристаллы с максимумами флуоресценции от 450 до 800 нм.

Существует также вариант, в котором полупроводниковые нанокристаллы предварительно переводят в водную фазу и стабилизируют обработкой тиолсодержащими соединениями.

Возможен вариант, в котором в качестве отрицательно заряженных полиэлектролитов используют поликислоты и/или соли этих поликислот.

Возможен также вариант, в котором в качестве положительно заряженных полиэлектролитов используют полиоснования и/или соли этих полиоснований.

Существует вариант, в котором между слоями флуоресцентных нанокристаллов разных цветов наносят от 3 и более слоев полиэлектролитов разных зарядов, обеспечивая разделение нанокристаллов разных цветов на расстояния свыше 10 нм.

Существует также вариант, в котором внешним полиэлектролитным слоем служит поликислота или соль этой поликислоты, содержащие одну или несколько карбоксильных групп.

Возможен вариант, в котором одну или несколько карбоксильных групп поликислоты внешнего полиэлектролитного слоя химически связывают с аминогруппами распознающих биологических молекул.

Возможен также вариант, в котором для химического связывания карбоксильных групп поликислоты внешнего полиэлектролитного слоя микросферы и аминогрупп распознающих биологических молекул используют карбодиимиды.

Существует вариант, в котором в качестве распознающих биологических молекул используют нативные или модифицированные белки, антитела, пептиды, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды или аптамеры.

Существует также вариант, в котором распознающие биологические молекулы модифицируют химически путем введения дополнительных аминогрупп.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения популяций микросфер, содержащих не менее ста тысяч оптических кодов при отсутствии искажений оптических кодов за счет исключения явлений Ферстеровского резонансного переноса энергии между нанокристаллами различных цветов.

Способ осуществляется следующим образом. На заряженную поверхность полимерных микросфер исходного размера 2-10 мкм наносят от 3 и более слоев противоположно заряженных полиэлектролитов путем последовательной инкубации микросфер с водными растворами полиэлектролитов и последующей отмывки от несвязавшихся молекул полиэлектролитов. Затем микросферы разделяют на несколько групп и микросферы каждой группы инкубируют с водными растворами, содержащими одинаковые или различные количества противоположно заряженных водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов. Избыток несвязавшихся нанокристаллов отмывают. В результате получают одну или несколько популяций микросфер с различающимися интенсивностями флуоресценции за счет включения различных количеств нанокристаллов в состав микросфер. На следующем этапе каждую полученную популяцию микросфер последовательно инкубируют с растворами противоположно заряженных полиэлектролитов, в результате чего формируют от 1 до 5 дополнительных полиэлектролитных слоев на поверхности микросфер. Затем каждую популяцию разделяют на несколько групп и инкубируют с водными растворами, содержащими различные количества противоположно заряженных водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов с отличающимися оптическими свойствами. В результате на поверхности микросфер каждой финальной популяции формируется слой нанокристаллов, пространственно отделенный от слоя нанокристаллов другого цвета. Количество нанокристаллов, содержащихся в пределах одного слоя, пропорционально концентрации исходного раствора нанокристаллов, используемого для приготовления данной популяции микросфер. Этапы нанесения полиэлектролитных слоев и нанокристаллов различных цветов могут быть повторены в зависимости от желаемого количества оптических кодов.

На последнем этапе на поверхность микросфер наносят от 3 до 5 полиэлектролитньгх слоев. При этом для формирования внешнего полимерного слоя используют полимер, содержащий функциональные химические группы, наличие которых позволяет химически связывать с внешним полимерным слоем оптически кодированных флуоресцентных микросфер распознающие биологические молекулы (белки, антитела, пептиды, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, аптамеры).

Способ имеет многостадийную разветвленную структуру, согласно которой, после нанесения слоя нанокристаллов определенного цвета и нанесения промежуточных одного или нескольких полимерных слоев, каждый образец разделяют на N частей, где N - количество уровней интенсивности нанокристаллов следующего слоя. В результате получают Nm популяций микросфер с индивидуальными спектральными кодами, где m - количество цветов флуоресцентных нанокристаллов, N - количество уровней интенсивности флуоресценции каждого типа нанокристаллов. Каждая популяция микросфер может быть обозначена числовым кодом, в котором каждое число соответствует уровню интенсивности флуоресценции (1, 2, 3 и т.д.), а положение числа - цвету нанокристаллов (от синего к красному по возрастанию положения максимума флуоресценции). Если для приготовления набора микросфер используются исходные микросферы разного диаметра, то количество популяций микросфер с индивидуальными спектральными кодами Nm умножается на коэффициент х, который определяется количеством исходных популяций микросфер, различающихся по размеру.

Пример 2. Способ получения набора 8 популяций микросфер, содержащих три цвета нанокристаллов и два уровня интенсивности их флуоресценции.

Водную суспензию, содержащую 3,1×10⁷ полимерных микросфер размером от 2 до 10 мкм, содержащих на поверхности карбоксильные группы, доводят до объема 0,5 мл и смешивают с 0,5 мл раствора положительно заряженного полиэлектролита с концентрацией 2 мг/мл. Смесь вортексируют в течение 30 секунд, затем помещают в ультразвуковую баню на 1 минуту, затем инкубируют в течение 20 минут при мягком перемешивании. После этого суспензию осаждают путем центрифугирования в течение 5 минут при 3000 об/мин, отбирают супернатант и ресуспендируют в 1 мл воды. Процедуру отмывки водой повторяют 3 раза для удаления избытка несвязавшегося полиэлектролита. После этого ресуспендируют микросферы в 0,5 мл воды и добавляют 0,5 мл раствора отрицательно заряженного полиэлектролита с концентрацией 2 мг/мл. Повторяют процедуры инкубации и отмывки для формирования пяти полиэлектролитных слоев, последний из которых является положительно заряженным. После этого микросферы ресуспендируют в 1 мл воды и разделяют на две равные части, к каждой добавляют по 0,5 мл водных растворов водорастворимых отрицательно заряженных флуоресцентных нанокристаллов с максимумом флуоресценции 520 нм с концентрациями 0,05 мг/мл и 0,5 мг/мл. Смеси вортексируют в течение 30 секунд, затем инкубируют в темноте в течение 20 минут при мягком перемешивании. Смеси трехкратно отмывают от избытка несвязавшихся нанокристаллов, затем наносят еще по три полиэлектролитных слоя. После этого каждую популяцию микросфер ресуспендируют в 1 мл воды и разделяют на две равные части, к каждой части добавляют по 0,5 мл водных растворов водорастворимых отрицательно заряженных флуоресцентных нанокристаллов с максимумом флуоресценции 575 нм с концентрациями 0,05 мг/мл и 0,5 мг/мл. Смеси вортексируют в течение 30 секунд, инкубируют в темноте в течение 20 минут при мягком перемешивании затем повторяют процедуры отмывки и нанесения трех полиэлектролитных слоев, после этого каждую популяцию микросфер ресуспендируют в 1 мл воды и снова разделяют на две равные части, к каждой добавляют по 0,5 мл водных растворов водорастворимых отрицательно заряженных флуоресцентных нанокристаллов с максимумом флуоресценции 690 нм с концентрациями 0,05 мг/мл и 0,5 мг/мл. Смеси вортексируют в течение 30 секунд, инкубируют в темноте в течение 20 минут при мягком перемешивании затем повторяют процедуры отмывки и наносят 5 полиэлектролитных слоев. Получают панель из 23=8 популяций трехцветных микросфер с оптическими кодами: 111, 112, 121, 211, 221, 212, 122, 222. Оптически кодированные микросферы, несущие на своей поверхности распознающие биологические молекулы, могут быть использованы для создания диагностикумов новых поколений на базе метода проточной цитометрии.

На фиг. 1 приведена схема оптического кодирования микросфер с использованием трех цветов нанокристаллов и двух уровней интенсивности (согласно примеру 1), согласно которой получают 8 популяций трехцветных микросфер с оптическими кодами: 111, 112, 121, 122, 211, 212, 221, 222.

На фиг. 2 приведены результаты анализа 8 популяций микросфер, содержащих три цвета нанокристаллов и два уровня интенсивности их флуоресценции с помощью проточной цитометрии в трех каналах цитометра: FITC, РЕ, Per-CP.

Пример 3. Способ получения набора 27 популяций микросфер, содержащих три цвета нанокристаллов и три уровня интенсивности их флуоресценции.

Способ осуществляют аналогично описанному в примере 1, перед стадией инкубации с флуоресцентными нанокристаллами разделяют каждую популяцию микросфер не на две, а на три равные части. К каждой части добавляют по 0,5 мл водных растворов водорастворимых отрицательно заряженных флуоресцентных нанокристаллов с концентрациями 0,02 мг/мл, 0,08 мг/мл и 0,5 мг/мл.

Таким образом, предложенный способ позволяет расширить функциональные возможности флуоресцентных микросфер за счет создания наборов микросфер, оптически кодированных флуоресцентными нанокристаллами и несущих на своей поверхности распознающие биологические молекулы. Данные наборы могут найти применение для высокочувствительной многопараметрической детекции биомаркеров заболеваний в биологических жидкостях и тканях.