Результат интеллектуальной деятельности: Способ и набор для диагностики дифтерии с верификацией токсигенных штаммов возбудителя

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, может быть использовано в лабораторной диагностике возбудителя дифтерии.

Дифтерия является воздушно-капельной антропонозной инфекцией, которая сопровождается высокой летальностью. В России после введения в 1959 г. массовой иммунопрофилактики против дифтерии были отмечены два эпидемических подъема заболеваемости этой инфекций - 1984-1985 гг. и 1994-1995 гг. Во время второго эпидемического подъема 1990-х годов заболело более 18000 человек и погибло более 4000 человек.

Основным методом лабораторной диагностики дифтерийной инфекции в Российской Федерации является бактериологическая диагностика, которая регламентирована двумя нормативно-методическими документами: санитарно-эпидемиологическими правилами СП 3.1.2.3109-13 «Профилактика дифтерии» и методическими указаниями МУК 4.2.3065-13 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции».

Система бактериологической диагностики в нашей стране разработана несколькими поколениями ученых и практических бактериологов. Целью ее является выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых и достаточных для получения достоверного ответа в максимально сжатые сроки. Разработанная схема бактериологической диагностики является достаточно эффективной и включает постановку пробы на токсигенность, которая позволяет выявить продукцию дифтерийного токсина у возбудителя.

Однако подобные методы для получения фенотипической характеристики не могут быть признаны удовлетворительными по чувствительности и продолжительности исследования. Так, результаты биохимической идентификации С. diphtheriae зависят от качества питательных сред и реагентов, условий их приготовления и хранения, определения рН среды, чистоты посуды, а также квалификации персонала и многого др. Кроме того, выдача самого раннего положительного ответа возможна только на третьи сутки, а самого позднего отрицательного ответа - на пятые сутки.

Обследованию на дифтерию подлежат все больные с ангинами, хроническими тонзиллитами, паратонзиллярными и заглоточными абсцессами. Кроме того, обследованию на дифтерию подлежат все контактные лица в очагах дифтерии.

Обследования проводятся также с профилактической целью при поступлении в лечебно-профилактические учреждения, санатории, закрытые специализированные учреждения, при переводе из одного закрытого специализированного учреждения в другое.

Особую опасность представляют дифтерийные бактерионосители, которые имеют высокий уровень антитоксического иммунитета, но являются источниками инфекции для окружающих. Кроме того, в России существует скрытое дифтерийное бактерионосительство, что представляет потенциал для распространения дифтерии, особенно среди непривитых против этой инфекции людей.

Поэтому согласно действующим нормативным документам во всех этих случаях у пациента забирают патологический материал из зева и носа с помощью двух отдельных сухих тампонов с последующим посевом на одну чашку с плотной питательной средой и идентификацией возбудителя в течение 3-5 суток.

При наличии другой локализации (кожа, наружный слуховой проход, гениталии, конъюнктива глаз) взятие патологического материала осуществляют с места локализации одним сухим тампоном, и обязательно материал забирается двумя сухими тампонами из зева и носа. Это объясняется тем, что возбудитель дифтерии наиболее часто локализуется на слизистых оболочках носоглотки и ротоглотки с последующим попаданием его на кожу.

На территории России наиболее распространена дифтерия носоглотки и ротоглотки. Последний случай кожной формы дифтерии в г. Москве был в 2007 г., когда у мужчины бактериологическим методом был выявлен возбудитель дифтерии в ротоглотке, носоглотке и на тыльной поверхности левой кисти. Ему был поставлен диагноз: дифтерия зева, носа и кожи. Данный пациент был выявлен по контакту с умершей от дифтерии ротоглотки больной. Наиболее часто кожная форма дифтерии встречается в странах Юго-Восточной Азии и Индии, что может, в связи с ростом путешествий в эти регионы, привести к завозным случаям кожной формы дифтерии на территорию России.

Поэтому применение высокочувствительных, специфичных, информативных и ускоренных молекулярно-генетических методов обнаружения возбудителя дифтерии является несомненно актуальным и перспективным в лабораторной диагностике дифтерийной инфекции, так как позволит идентифицировать возбудителя дифтерии в течение одного рабочего дня.

За рубежом первые статьи о применении молекулярно-генетических методов при обнаружении возбудителя дифтерии появились в 1990-х годах прошлого века.

Pallen M.J. (1) впервые в 1991 году применил метод ПЦР для скринига токсигенности у коринебактерий дифтерии. В последующие годы ПЦР в классическом варианте стала широко использоваться как отечественными, так и зарубежными исследователями для этих целей (2, 3, 4, 5, 6).

Однако все эти работы были направлены на определение токсигенности у коринебактерий после выделения чистой культуры коринебактерий, что до применения ПЦР занимало от 2 до 4 суток, и не позволяли выявлять возбудителя дифтерии непосредственно в клиническом материале от больного.

В 2000-х развитие ПЦР-диагностики при дифтерийной инфекции пошло в направлении разработки ПЦР в режиме реального времени (7, 8, 9). Вместе с тем, в этих вариантах ПЦР также выявление гена, кодирующего дифтерийный токсин, осуществлялось с чистой культуры коринебактерий.

Только в двух работах (10, 11) были предприняты попытки обнаружения гена дифтерийного токсина с помощью ПЦР в режиме реального времени на ограниченном числе имитантов и клинических образцов. Однако существенным недостатком применения ПЦР в режиме реального времени является высокая стоимость анализа за счет использования дорогостоящего оборудования.

Другим направлением развития ПЦР-диагностики стало создание мультиплексных вариантов реакции, которые позволяют выявлять не только ген дифтерийного токсина у коринебактерий дифтерии и коринебактерий ульцеранс, но и дифференцировать эти микроорганизмы между собой (12, 13). Однако разработка мультиплексных ПЦР-систем имеет ряд трудностей, связанных с качеством проведения реакций и постановкой электрофореза с целью получения характерных паттерных профилей.

В 2000 году была разработана амплификация в изотермальных условиях - петлеобразующая амплификация (LAMP) (14), которая в дальнейшем была модифицирована для большого числа возбудителей инфекционных заболеваний. В 2008 г. в международной базе данных NCBI/GenBank была опубликована нуклеотидная последовательность гена дифтерийного токсина размером 300 п.н., которую можно использовать при конструировании праймеров для изотермальной амплификации при выявлении коринебактерий дифтерии (15).

Наиболее близким техническим решением к предлагаемой группе изобретений является недавно предложенный способ выявления штаммов C. diphtheriae на основе изотермальной амплификации (LAMP), предполагающий использование набора, содержащего 3 пары праймеров, амплифицирующих фрагмент гена дифтерийного токсина (15). Указанные способ и набор выбраны нами в качестве прототипов предлагаемых способа и набора соответственно.

Недостатками известного способа является то, что он был апробирован только на выделенных штаммах C. diphtheriae, не были оценены возможности этого метода при выявлении нетоксигенных токснесущих штаммов с различными механизмами отсутствия экспрессии гена дифтерийного токсина, а также при работе с первичным клиническим материалом от больного.

Кроме того, способ предусматривал использование дорогостоящих реагентов (6 праймеров), доступных японским ученым, что существенно ограничивает и делает невозможным широкое применение этого способа в практическом здравоохранении в нашей стране.

Сведения о способах и наборах для лабораторной диагностики дифтерии с верификацией токсигенных штаммов возбудителя на клиническом материале в литературе отсутствуют.

Задачей настоящего изобретения является разработка простого, ускоренного, высокочувствительного и специфичного способа и набора для ускоренной молекулярно-генетической диагностики возбудителя дифтерийной инфекции, позволяющего выявлять возбудителя заболевания непосредственно в клиническом материале от больного в течение 4-4,5 часов от момента взятия патологического материала.

Технический результат заключается в ускорении, упрощении диагностики дифтерии, обеспечивает ее высокую чувствительность и специфичность за счет одновременной верификации токсигенных и нетоксигенных штаммов возбудителя.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ и набор для ускоренной молекулярно-генетической диагностики дифтерии, основанный на изотермальной амплификации.

Сущность предлагаемой группы изобретений заключается в следующем.

Для диагностики дифтерии производят забор клинического материала от больного. Выделяют из него ДНК. Смешивают смесь №1 и выделенную ДНК, которые прогревают при 90°С - 95°С в течение 3-5 минут. Смесь №1 содержит 10×ПЦР буфер, 2 mM смесь нуклеотидов (dNTP), 25 mM MgCl₂, раствор Betaine, праймер ДТ-BP-FIP (5'-GAT TGG ТСС CAG TAA CGG TTT TTC АТС AAA CGG CAT TAG AGC-3'), праймер ДТ-BP-BIP (5'-CTG TAT TCG CTG GGG СТА ACT CAA ATT АТС AGC TGT TTC GCT AT-3'), праймер ДТ-F3 (5'-GGA AAA AGC TAA АСА ATA CCT AGA-3'), праймер ДТ-В3 (5'-AAG AGC AGC AGT TGT CTT-3') и праймер Loop (5'-ATG CAA CGT GGG CAG TAA AC-3'). Далее проводят охлаждение до температуры в интервале от 10°С до 0°С включительно в течение 30-120 секунд, добавляют смесь №2, содержащую рабочее разведение Bst полимеразы. Изотермальную амплификацию проводят в течение 60 минут при 65°С и 2 минут при 80°С. После чего осуществляют детекцию продуктов амплификации при горизонтальном электрофорезе в агарозном геле путем сравнения электрофоретической подвижности полученных фрагментов ДНК с подвижностью контрольного образца ДНК токсигенного штамма Corynebacterium diphtheriae. При наличии специфического светящегося профиля, аналогичного контрольному образцу токсигенного штамма Corynebacterium diphtheriae, диагностируют дифтерию.

Набор для диагностики дифтерии содержит смесь №1, смесь №2 и контрольный образец, содержащий ДНК токсигенного штамма Corynebacterium diphtheriae.

Способ осуществляется следующим образом.

Для диагностики дифтерии с верификацией токсигенных штаммов возбудителя проводят следующие этапы: 1) взятие патологического материала от пациента; 2) пробоподготовка; 3) приготовление реакционной смеси; 4) амплификация; 5) детекция результатов путем горизонтального электрофореза в агарозном геле.

1) Взятие патологического материала проводится двумя сухими стерильными ватными одноразовыми тампонами из зева и носа пациента, при наличии другой локализации (кожа, наружный слуховой проход, гениталии и т.д.) добавляется еще один тампон. После взятия материала рабочую часть зондов с каждого тампона (зев, нос, другая локализация) помещают в разные стерильные одноразовые пробирки типа эппендорф с 0,5 мл стерильного физиологического раствора; суспендируют вращательными движениями; отламывают стержень, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы плотно закрыть пробирку. Пробирки герметично закрывают и маркируют.

2) Далее проводится пробоподготовка клинического образца: патологический материал с тампона суспендируют на вортексе в течение 4-5 минут, удаляют тампон. Далее проводят центрифугирование пробирок при 12000 об/мин в течение 10 минут; удаляют супернатант, оставив 150 мкл в пробе; пробы встряхивают на микроцентрифуге типа вортекс до полного ресуспендирования осадка.

3) Следующим этапом является выделение (экстракция) ДНК из клинического материала с помощью коммерческих наборов для выделения ДНК сорбционным методом, согласно инструкции производителя.

4) Приготовление реакционной смеси: отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб, маркируют. В каждую пробирку вносят сначала 21 мкл смеси №1 из набора, затем 3 мкл ДНК пробы, полученной после экстракции из клинического или контрольного образца; добавляют 1 каплю минерального масла, прогревают пробы и далее охлаждают. В каждую пробу под минеральное масло вносят 1 мкл смеси №2 из набора, слегка перемешивают на микроцентрифуге типа вортекс.

5) Приготовленные пробы помещают в программируемый микротермостат типа «Гном» или в термоциклер. Изотермальную амплификацию проводят в режиме: 65°С - 60 мин и далее 80°С - 2 мин.

6) Детекцию результатов реакции осуществляют в горизонтальном электрофорезе в агарозном геле. Заранее готовят 1,5% агарозный гель. Полученные после изотермальной амплификации ампликоны в количестве 10 мкл смешивают в штативе с 2 мкл 6х Mass Loading Dye Solution («Fermentas», Литва) и 4 мкл Sybr Green; помещают в лунки агарозного геля и подключают к источнику электрического тока. Электрофорез проводят в режиме 160 V в течение 30 мин. Результат реакции выявляют с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографируют. Для контроля качества электрофореза используют маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Детекцию результатов осуществляют путем сравнения профиля исследуемого ДНК-образца со специфическим профилем ДНК-образца контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae. Если профиль исследуемого ДНК-образца аналогичен профилю ДНК-образца контрольного токсигенного штамма C. diphtheriae, то данные образцы регистрируются как содержащие ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae, что свидетельствует о наличии в патологическом материале от больного возбудителя дифтерии и позволяет подтвердить диагноз дифтерии.

Пример

Диагностику дифтерии проводят в соответствии с предлагаемым способом.

Взятие клинического материала от больного осуществляется двумя сухими стерильными тампонами из зева и носа, при наличии другой локализации (кожа, наружный слуховой проход, гениталии) добавляется еще один тампон. Материал забирается с помощью шпателя, при хорошем освещении, с границы здоровой и пораженной ткани, не касаясь щек, зубов и языка. После взятия материала рабочую часть зондов с каждого тампона (зев, нос, другая локализация) помещают в разные стерильные одноразовые пробирки типа эппендорф с 0,5 мл стерильного физиологического раствора (стерильный физиологический раствор предварительно разливают в пробирки). Тампоны суспендируют вращательными движениями и отламывают, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы плотно закрыть пробирку. Пробирки герметично закрывают и далее маркируют.

Подготовка клинического образца

Пробирки с тампонами с клиническим материалом суспендируют в физиологическом растворе в течение 5 минут на микроцентрифуге типа вортекс, удаляют тампон, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 минут; удаляют супернатант, оставив 150 мкл в пробе; далее пробы встряхивают на микроцентрифуге типа вортекс до полного ресуспендирования осадка.

Выделение (экстракция) ДНК из клинического материала

Для выделения ДНК из клинического материала используют набор реагентов для выделения РНК/ДНК «РИБО-преп». Работа проводится согласно инструкции. Возможно использование других наборов для выделения ДНК из клинического материала, которые зарегистрированы и разрешены для применения на территории РФ.

Проведение амплификации

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб, маркируют. В каждую пробирку вносят сначала 21 мкл смеси №1 из набора, затем 3 мкл ДНК пробы, полученной после экстракции из клинического или контрольного образца; добавляют 1 каплю минерального масла, прогревают пробы и далее охлаждают. В каждую пробу под минеральное масло вносят 1 мкл смеси №2 из набора, слегка перемешивают на микроцентрифуге типа вортекс. Помещают пробы в программируемый микротермостат типа «Гном» или в термоциклер.

Состав смеси №1 из набора: 10×ПЦР буфер, 2 mM смесь нуклеотидов (dNTP), 25 mM MgCl₂, раствор betaine, праймер ДТ-BP-FIP, праймер ДТ-ВР-BIP, праймер ДТ-ВР-F3, праймер ДТ-ВР-В3 и праймер Loop.

Состав смеси №2 из набора: рабочее (1:9) разведение Bst полимеразы в буферном растворе.

Режим амплификации: 65°С - 60 мин и далее 80°С - 2 мин. Электрофорез в агарозном геле.

Готовят 1,5% агарозный гель; в штативе смешивают 2 мкл 6х Mass Loading Dye Solution («Fermentas», Литва), 4 мкл Sybr Green и 10 мкл ампликонов; режим электрофореза - 160 V 30 мин. Результат реакции выявляют с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографируют. Для контроля качества электрофореза используют маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Так, если у исследуемого образца ДНК имеются специфические светящиеся профили, аналогичные контрольному профилю токсигенного штамма C. diphtheriae, то данные образцы регистрируются как содержащие ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae.

Апробация набора и способа ускоренной лабораторной диагностики дифтерии проведена в ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора на типовых коллекционных штаммах и клинических образцах, поступивших в референс центр по мониторингу за возбудителем дифтерии для верификации.

В соответствии с поставленной задачей изучено 200 токсигенных и 150 нетоксигенных штаммов коринебактерий дифтерии, из них 170 штаммов биовара гравис и 180 штаммов биовара митис, а также 15 нетоксигенных токснесущих штаммов коринебактерий дифтерии с тремя механизмами отсутствия экспрессии гена дифтерийного токсина. В апробацию были включены клинические образцы, полученные от пациентов, обследованных на дифтерию с профилактической целью и присланных в референс центр по мониторингу за возбудителем дифтерии из ФБУЗ ЦГиЭ в субъектах Российской Федерации.

Оценка эффективности разработанного способа проводилась при параллельных бактериологических исследованиях. Разработанный способ был высокоэффективен в 100% случаях при выявлении всех токсигенных и нетоксигенных штаммов коринебактерий дифтерии биоваров гравис и митис. Нетоксигенные токснесущие штаммы коринебактерий с механизмом отсутствия экспрессии гена дифтерийного токсина, обусловленным наличием транспозона в гене tox, идентифицировались как нетоксигенные, а нетоксигенные токснесущие штаммы коринебактерий с механизмами отсутствия экспрессия гена дифтерийного токсина, обусловленными наличием делений и мобильного генетического элемента IS в гене tox, идентифицировались как токсигенные. Все клинические образцы, полученные от пациентов, обследованных на дифтерию с профилактической целью, дали отрицательный результат, что было подтверждено и полностью коррелировало с результатами бактериологического исследования.

Таким образом, разработанный способ ускоренной молекулярно-генетической диагностики дифтерийной инфекции обладает высокой диагностической эффективностью, 100% специфичностью и чувствительностью, позволяющей выявить 10³ микробных клеток коринебактерий дифтерии в клиническом материале с одновременной верификацией токсигенных и нетоксигенных штаммов.

Заявленный способ является простым, ускоренным, высокочувствительным и высокоспецифичным. Предлагаемые способ и набор для лабораторной диагностики дифтерии позволяют выявить возбудителя заболевания в течение 4-4,5 часов от момента взятия непосредственно в патологическом материале от больного. Это, в свою очередь, позволяет более полно, по сравнению со штаммом после культивирования, охарактеризовать возбудителя заболевания в конкретном случае с одновременной верификацией токсигенных и нетоксигенных штаммов, что в конечном итоге будет способствовать быстрой постановке диагноза, назначению своевременной и адекватной терапии, а также будет способствовать быстрому обследованию контактных лиц и выявлению больных при проведении противоэпидемических мероприятий в очагах дифтерийной инфекции. Кроме того, применение разработанного способа и набора в практическом здравоохранении даст возможность более быстрого обследования лиц с целью получения результатов при профилактических исследованиях.

Литература

1. Pallen MJ. Rapid screening for toxigenic Corynebacterium diphtheriae by the polymerase chain reaction. J Clin Pathol. 1991 Dec; 44(12): 1025-6.

2. Aravena-Roman M, Bowman R, O'Neill G. Polymerase chain reaction for the detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae. Pathology. 1995 Jan; 27(1): 71-3.

3. Efstratiou, А., K.H. Engler, C.S. Dawes, and D. Sesardic. 1998. Comparison of phenotypic and genotypic methods for detection of diphtheria toxin among isolates of pathogenic corynebacteria. J. Clin. Microbiol. 363173-3177.

4. Mikhailovich VM, Melnikov VG, Mazurova IK, Wachsmuth IK, Wenger JD, Wharton M, Nakao H, Popovic T Application of PCR for detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains isolated during the Russian diphtheria epidemic, 1990 through 1994. J Clin Microbiol. 1995 Nov; 33(11): 3061-3.

5. Nakao H, Popovic T. Development of a direct PCR assay for detection of the diphtheria toxin gene. J Clin Microbiol. 1997 Jul; 35(7): 1651-5.

6. Tseneva G., Shchederkina E. [The use of polymerase chain reaction in the diagnosis of diphtheria infection]. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 2000 Sep-Oct; (5): 72-4.

7. Cassiday P.K, Pawloski L.C., Tiwari Т., Sanden G.N., Wilkins P.P. Analysis of toxigenic Corynebacterium ulcerans strains revealing potential for false-negative real-time PCR results. J Clin Microbiol. 2008 Jan; 46(1): 331-3.

8. Sing A., Berger A., Schneider-Brachert W., Holzmann Т., Reischl U. Rapid detection and molecular differentiation of toxigenic Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans strains by LightCycler PCR. J Clin Microbiol. 2011 Jul; 49(7): 2485-9. doi: 10.1128/JCM.00452-11.

9. Schuhegger R., Lindermayer M., Kugler R. Heesemann J., Bursch U., Sing A. Detection of toxigenic Corynebacterium diphtheria and Corynebacterium ulcerans strains by a novel real-time PCR. J. Clin. Microbiology. - 2008 - vol. 46, №8. - P. 2822-2823.

10. Mancini F., Monaco M., Pataracchia M., von Hunolstein C, Pantosti A., Ciervo A. Identification and molecular discrimination of toxigenic and nontoxigenic diphtheria Corynebacterium strains by combined real-time polymerase chain reaction assays. Diagn Microbiol Infect Dis. 2012 Jun; 73 (2):111-20. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2012.02.022.

11. Mothershed E.A., Cassiday P.K., Pierson K., Mayer L.W., Popovic T. Development of a real-time fluorescence PCR assay for rapid detection of the diphtheria toxin gene. J Clin Microbiol. 2002 Dec; 40(12): 4713-9.

12. Pimenta F.P., Hirata R. Jr, Rosa A.C., Milagres L.G., Mattos-Guaraldi A.L. A multiplex PCR assay for simultaneous detection of Corynebacterium diphtheriae and differentiation between non-toxigenic and toxigenic isolates. J Med Microbiol. 2008 Nov; 57 (Pt 11): 1438-9. doi: 10.1099/jmm.0.2008/000414-0.

13. Torres L. de F., Ribeiro D., Hirata Jr R., Pacheco L.G., Souza M.C., dos Santos L.S., dos Santos C.S., Salah M., Costa M.M., Ribeiro M.G., Selim S.A., Azevedo V.A., Mattos-Guaraldi A.L. Multiplex polymerase chain reaction to identify and determine the toxigenicity of Corynebacterium spp with zoonotic potential and an overview of human and animal infections. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2013 May; 108(3). pii: S0074-02762013000300272. doi: 10.1590/S0074-02762013000300003.

14. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA / T. Notomi, H. Okayama, H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino, T. Hase // Nucl. Acids Research. - 2000. - Vol. 28. - №12. - P. 63.

15. JP 4876223 B2, Japan Health Science Foundation, 15.12.2012.