Результат интеллектуальной деятельности: Способ лабораторной верификации вагинита у девочек с вульвитом в возрасте до 8 лет

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для лабораторного подтверждения диагноза вагинита у девочек.

Микробиоценоз слизистой оболочки влагалища у девочек в периоде детства в связи с низким уровнем эстрогенов, малым количеством слоев эпителия, слабой выработкой гликогена формируется в условиях предельно малого участия молочно-кислых палочек.

В повседневной практике достаточно часто встречаются девочки, обращающиеся с яркими симптомами вульвита, доставляющими крайний дискомфорт, притом что при микроскопии мазков и даже при микробиологическом исследовании отделяемого из влагалища выраженные отклонения биотопа отсутствуют, что затрудняет выбор лечебной тактики.

В 1990 году М.Л. Коршуновым впервые были разработаны критерии диагностики «переходного» типа микроценоза влагалища у детей в возрасте до 8 лет включительно, базирующиеся на анализе данных микроскопии мазка влагалищного отделяемого. Автор обозначил переходным типом микроценоза наличие незначительного количества грамположительных коккобактерий при минимуме лейкоцитов (0-2) и при обнаружении эпителиальных и дегенеративно измененных клеток у девочек с клиническими симптомами вульвовагинита. Однако вышеуказанные критерии незначительно отличаются от характеристики нормоценоза влагалища у девочек, описанного этим же автором, что не дает возможности дифференциально диагностировать патологические изменения микроценоза влагалища.

Способ диагностики с использованием микробиологического (культурального) исследования, позволяющего установить видовой состав аэробных, факультативно-анаэробных и некоторых облигатно-анаэробных бактерий и тем самым подтвердить принадлежность к роду, также не позволяет определить точные количественные значения микроорганизмов. Более того, традиционный забор содержимого влагалища из его просвета определяет состав транзиторных микроорганизмов а не постоянной пристеночной микрофлоры. Как известно, именно пристеночно живущие микроорганизмы участвуют в обеспечении колонизационной резистентности вульвы и влагалища.

Указанный способ не дает конкретных количественных значений указанных микроорганизмов и не дает возможность четко сформулировать необходимость и объем лечебного воздействия. Существенным недостатком являются приблизительная оценка, важность профессионализма работников лаборатории, длительные сроки культивирования (в среднем до 7 дней).

Одним из ближайших аналогов указанных способов является способ микробиологической диагностики дисбактериозов влагалища (RU 2293986), заключающийся в сочетанной оценке данных микроскопии и результатов культурального исследования вагинальных мазков из заднего свода влагалища, полученных стерильным ватным тампоном. Существенным недостатком указанного метода является необходимость введения влагалищных зеркал, что проблематично в рутинной практике врача, особенно у детей дошкольного возраста. Кроме того, в основу диагностического метода включены лабораторные исследования, требующие длительного поэтапного получения данных при отсутствии четких повозрастных критериев оценки биотопа влагалища у детей.

Другим аналогом является способ оценки микробиоценоза влагалища (RU 2249821) у взрослых женщин, заключающийся в одновременном заборе отделяемого и соскобного материала из влагалища, орошении влагалища 5,0 мл 6,0% раствора полиглюкина и заборе смыва с последующим цитологическим исследованием окрашенного по Граму мазка соскобного материала, определением бактериальной обсемененности эпителиоцитов, количества лейкоцитов и ключевых клеток, посева отделяемого влагалища и соскобного материала из серийных разведений на питательные среды с определением количества лактобацилл, условно-патогенной факультативно-анаэробной и облигатно-анаэробной микрофлоры. В смыве из влагалища определяют концентрации IgA, sIgA, IgM и свободного секреторного компонента. Сравнивают полученные данные с критериями, установленными для дисбиоза влагалища в репродуктивном периоде. Существенным недостатком данного способа является необходимость многократного и трудоемкого забора исследуемого материала, оценка микробиологического состояния без учета ее видовой идентификации и их количественных значений.

В последнее время наряду с классическими диагностическими методами все чаще используется метод ПЦР в реальном времени, позволяющий выявлять широкий спектр микроорганизмов, охарактеризовывать их количественный уровень по содержанию высокоспецифичных амплифицированных фрагментов ДНК даже при минимальных количественных изменениях микробного представительства.

Ближайшим аналогом указанного метода является способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности (RU 2362808), заключающийся в использовании ПЦР в режиме реального времени с определением общего числа геномов ДНК бактерий, характерных для конкретного биотопа с числом геномов нормальной и условно-патогенной биоты. Полученные величины сравнивают между собой, определяя их соотношение. При превышении числа геномов нормобиоты относительно числа геномов условно-патогенной биоты в 1000 раз констатируют отсутствие дисбаланса. При значении данного показателя менее 1000 диагностируют дисбаланс и устанавливают степень его выраженности. Указанный способ не учитывает возможные возрастные изменения микроценоза конкретного биотопа, а именно влагалища, отсутствует описание представительства отдельных групп микроорганизмов и их количественные изменения, определяющие нормобиоту у девочек и не менструирующих девочек-подростков.

Таким образом, вышеизложенное требует разработки новых более точных и высокоспецифичных критериев лабораторной диагностики вагинита у девочек с вульвитом в возрасте от 1 до 8 лет, особенно при спорных результатах стандартных лабораторных данных о микрофлоре в области вульвы и влагалища. Высокая чувствительность, специфичность и быстрота диагностических возможностей ПЦР в режиме реального времени отвечает практическим требованиям работы с детьми и подростками.

Задачей изобретения является разработка критериев диагностики вагинита у девочек в возрасте от 1 до 8 лет с вульвитом при использовании метода количественной ПЦР в режиме реального времени.

Методика исследования

В исследование было включено 93 девочки в возрасте от 1 до 8 лет включительно.

Критерии включения в основную группу (n=27): клинически и лабораторно подтвержденное воспаление вульвы и влагалища инфекционного генеза.

Критерий включения в группу контроля (n=66): соматическое и гинекологическое здоровье, подтвержденное клинически и лабораторно.

На 1-ом этапе проводили детальный анализ анамнестических данных девочек, включая изучение наследственной предрасположенности к заболеваниям, вредных привычек и хронических заболеваний у родителей до зачатия, течения беременности и родов у матерей девочек, острых и хронических соматических и эндокринных заболеваний, перенесенных и имеющихся у девочек к моменту осмотра.

На 2-м этапе после получения информированного согласия родителя или законного представителя девочки проводилась оценка физического (рост, масса тела, индекс массы тела) и полового развития (половая формула, данные наружного гинекологического осмотра).

На 3-м этапе оценивались данные ПЦР исследования в режиме реального времени мазка-соскоба со слизистой боковой стенки влагалища за гименом, взятые одноразовым урогенитальным зондом (артикул: 3400-01). Показателем адекватности получения биоматериала являлось достаточное количество геномной ДНК человека в пробе, источником которой являлись эпителиальные клетки и лейкоциты, попадающие в пробу при правильной технике взятия биоматериала - контроль взятия материала (КВМ). Показатель КВМ оценивался в абсолютных значениях, его минимальный пороговый уровень составлял 10⁴ ГЭ/образец. При снижении данного показателя результат ПЦР в режиме реального времени считался недостоверным. Лабораторный контроль взятого материала после анализа КВМ был валиден во всех случаях, что подтверждало объективность последующего анализа полученных результатов.

На 4-ом этапе полученные данные клинических и лабораторных исследований обрабатывались статистическими методами.

Полученные результаты

Установлено, что у «здоровых» девочек микроценоз слизистой влагалища в возрасте от 1 до 8 лет включительно характеризуется количественным балансом геномов Lactobacillus spp. и Gardnerella vaginalis, выраженным их соотношением, равным lg0,3 или -0,5. При вагините у девочек аналогичного возрастного периода фиксируется увеличение числа геномов Lactobacillus spp. относительно Gardnerella vaginalis (р<0,05).

Задачей изобретения является разработка критериев диагностики вагинита у девочек с вульвитом в возрасте от 1 до 8 лет при использовании метода количественной ПЦР в режиме реального времени.

Сущность изобретения заключается в том, что используют ПЦР в режиме реального времени с определением в образце числа геномов Lactobacillus spp. и Gardnerella vaginalis в мазке-соскобе со слизистой оболочки влагалища, рассчитывают индекс lgL/G, где lgx - десятичный логарифм численного соотношения геномов микроорганизмов, L соответствует числу геномов Lactobacillus spp., a G - числу геномов Gardnerella vaginalis в образце, и при значениях индекса более -0,5 диагностируют вагинит.

Способ позволяет в кратчайшие сроки диагностировать вагинит у девочек с вульвитом в возрасте от 1 до 8 лет включительно.

Предложенный метод впервые позволяет ускорить диагностический поиск у детей дошкольного возраста, индивидуализировать терапевтические подходы с определением необходимости и объема лекарственного вмешательства. Предлагаемый способ впервые позволяет проводить объективное динамическое наблюдение за эффективностью в результате лечения - восстановление нормальной сбалансированной биоты. В основу способа положена впервые предлагаемая авторами комплексная количественная и качественная оценка отдельных групп микроорганизмов слизистой влагалища у девочек в возрасте от 1 до 8 лет в рамках определенного показателя с использованием метода ПЦР в реальном времени.

Способ осуществляется следующим образом.

Способ диагностики вагинита, отличающийся тем, что используют ПЦР в режиме реального времени с определением в образце числа геномов Lactobacillus spp. и Gardnerella vaginalis в мазке-соскобе со слизистой оболочки влагалища, рассчитывают индекс lg L/G, где lgx - десятичный логарифм численного соотношения геномов микроорганизмов, L соответствует числу геномов Lactobacillus spp., a G - числу геномов Gardnerella vaginalis в образце, и при значениях индекса более -0,5 диагностируют вагинит.

Клинические примеры

Пример 1. Девочка З., 1 года 3 месяца, обратилась с жалобами на незначительные выделения из половых путей желтоватого цвета, выраженный дискомфорт в области половых органов. Произведен забор мазка-соскоба боковой стенки слизистой влагалища за гименом с его исследованием методом ПЦР в режиме реального времени. В течение суток получен результат: число геномов в образце Gardnerella vaginalis 10^0,0, Lactobacillus spp. - 10^2,5, соответственно индекс составил lg 10^2,5/10^0,0=lg 316/1=2,5 то есть > -0,5. По результатам проведенного обследования диагностировано наличие вагинита. Назначена терапия. В отличие от известных методов диагностика с помощью предложенного метода позволила получить данные о состоянии микроценоза в кратчайшие сроки и провести адекватную терапию с эффектом.

Пример 2. Девочка О., 1 год 10 месяцев, обратилась с жалобами на покраснения половых органов, дискомфорт при ношении белья. Произведен забор мазка-соскоба боковой стенки слизистой влагалища за гименом с его исследованием методом ПЦР в режиме реального времени. В течение суток получен результат: число геномов в образце Gardnerella vaginalis 10^0,0, Lactobacillus spp. - 10^2,3, соответственно индекс составил lg 10^2,3/10^0,0=lg 199/1=2,2, то есть > -0,5. По результатам проведенного обследования диагностировано наличие вагинита. Назначена терапия. В отличие от известных методов диагностика с помощью предложенного метода позволила получить данные о состоянии микроценоза в кратчайшие сроки и провести адекватную терапию с эффектом.

Пример 3. Девочка М., 5 лет 6 месяцев, обратилась с жалобами на покраснение наружных половых органов, выделения из половых путей желто-зеленого цвета в скудном количестве. На основании результатов клинического осмотра заподозрен вульвовагинит. Произведен забор мазка-соскоба боковой стенки слизистой влагалища за гименом с его исследованием методом ПЦР в режиме реального времени. В течение суток получен результат: число геномов в образце Gardnerella vaginalis 10^0,0, Lactobacillus spp. 10^1,7, соответственно индекс составил lg 10^1,7/10^0,0=lg 50/1=1,6 то есть > -0,5. По результатам проведенного обследования диагностировано наличие вагинита. Назначена терапия. В отличие от известных методов диагностика с помощью предложенного метода позволила получить данные о состоянии микроценоза в кратчайшие сроки и провести адекватную терапию с эффектом.

Список литературы

1. Андросова Л.Д., Медицинский альманах №4 (13), ноябрь 2010, с. 177-179.

2. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. №2. Т. 3. с. 101-105.

3. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Инфекции влагалища Диагностика. Лабораторная диагностика оппортунистических инфекций влагалища // Consilium Medicum. 2005. N 3. Т 7.

4. Богданова Е.А. Воспалительные заболевания вульвы и влагалища у девочек // Гинекология. 1999 /N 3/ Том I.

5. Бодяжина В.И., Жмакин К.Н. Учебник гинекологии. Второе издание, переработанное и дополненное. Москва: Изд-во «Медицина». - 1967. - с. 32-55.

6. Гриневич Е.В. Характеристика микробиоценозов влагалища, кишечника и мочевыводящих путей при вульвовагинитах у девочек раннего возраста в зависимости от различных факторов риска Дис… канд. мед. наук. 2005.

7. Гуркин Ю.А. Гинекология подростков. / Руководство для врачей. СПб: ИКФ «Фолиант», 2000. - 574 с.

8. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. - М.: Мед. книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 2003. - 336 с.

9. Дергачева Т.И. Клинико-иммунологическая характеристика неспецифических вульвовагинитов у девочек с аллергическими заболеваниями. Дис… 1987.

10. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология Учебник для мед. вузов - СПб.: СпецЛит, 2008 - 4-е изд., - 767 с.

11. Коршунов М.Л. Бактериальный вульвовагинит у девочек, страдающих воспалительными заболеваниями почек и мочевыводящих путей. Дис… 1990

12. Кисина В.И. Микроценоз влагалища в норме и при вагинальных инфекциях: методы его коррекции // Consilium Medicum. Том 04/N 7/2002.

13. Лапченко М.Л. Гинекологические заболевания у девочек и девушек, 2004. Гл. 6 стр. 146-148.

14. Локун М.В. Особенности регуляции микроэкологических нарушений у девочек с неспецифическими вульвовагинитами. Дис… 2005

15. Маркин Л.Б., Яковлева Э.Б. Детская гинекология // Знания / стр. 109-118, 2004.

16. Малова И.О. Влагалищные выделения у девочек: этиология, клиника, диагностика, лечение // Педиатрия. Том 07 /N 2/ 2005.

17. Маркин Л.Б. Детская гинекология: Справочник - К.: Знания, 2004 - 476 с.

18. Прилепская В.Н., Довлетханова Э.Р., Байрамова Г.Р., Фофанова И.Ю. Современный взгляд на вопросы этиологии, патогенеза и лечения бактериального вагиноза // Гинекология №2 / том 12 / 2010.

19. Пересада О.А., Кудина О.Л., Тимошенко Т.И. Влияние микрофлоры матери на формирование микробиоценоза влагалища девочки. БелМАПО. Опубликовано: "Медицинская панорама" №1, январь 2002.

20. Препутневич Т.В., Мелкумян А.Р., Анкирская А.С. Использование современных лабораторных технологий в видовой идентификации лактобактерий при оценке состояния микробиоты влагалища у женщин репродуктивного возраста // Акушерство и гинекология №1 / 2013.

21. Рахматулина М.Р. Вульвовагиниты у девочек до 12 лет: этиология, клиника, диагностика. Дис… 2004.

22. Скала Л.З., Сидоренко С.В. Практические аспекты современной клинической микробиологии. - Тверь: ООО Издательство «Триада», 2004. - 312 с.

23. Субботина С.В. Клинико-иммунологические особенности вульвовагинитов у девочек. Дис… 2000.

24. Султанова Ф.Ш. Состояние влагалища и шейки матки у девочек допубертатного возраста с различным уровнем стероидных гормонов. Дис… 2003.

25. Творогова Т.М. Воспалительные заболевания гениталий у девочек // РМЖ // N7, 2005 г.

26. Тихомиров А.Л., Олейник Ч.Г. Бактериальный вагиноз: некоторые аспекты этиологии, патогенеза, клиники, диагностики и лечения // Гинекология. Том 06 /N2/ 2004.

27. Трачук Т.Ю. Особенности формирования биоценоза влагалища новорожденных и его роль в снижении детской гинекологической заболеваемости. Дис… 1999.

28. Уварова Е.В. Детская и подростковая гинекология. Руководство для врачей. - М.: Литтерра, 2009 г.

29. Уварова Е.В. Современные лечебно-диагностические технологии в детской гинекологии // Гинекология. Том 9 №5, стр 16 / 2007.

30. Уварова Е.В. Кандидный вульвовагинит в практике детского гинеколог. // Русский медицинский журнал, 2002, том 10, №18, с. 798-802.

31. Уварова Е.В., Латыпова Н.Х., Плиева З.А. Результаты применения Лактогина для устранения дисбиотических состояний кишечника и влагалища у девочек с хроническим вульвовагинитом // Репродуктивное здоровье детей и подростков / 2008, №4, с. 71-82.

32. Уварова Е.В., Султанова Ф.Ш. Неспецифические вагиниты у детей и подростков. Недетские детские проблемы // Consilium Provisorum. Том 03 /N5/ 2003.

33. Arne K. Myhre. Changes in Genital Anatomy and Microbiology in Girls between Age 6 and Age 12 Years: A Longitudinal Study, J Pediatr Adolesc Gynecol (2009).

34. Bacon JL. Prepubertal labial adhesions: Evaluluation of a referral population. Am. J Obstet Gynecol 2002; 187:327.

35. Jonathan Batchelor et al. Skin disorders affecting the vulva // obstetrics, gynaecology and reproductive medicine 2008; 18:3, p. 53-58.

36. Celeste J. Brown, Mayee Wong. Preliminary characterization of the normal microbiota of the human vulva using cultivation-independent methods // Journal of Medical Microbiology (2007), 56, 271-276.

37. Aldo Cavallini et al. Estrogen receptor and ER-related receptor expression in normal and atrophic vagina // Maturitas. 59 (2008), 219-225.

38. Consensus Conference on Pediatric Atopic Dermatitis // J. Am. Acad. Dermatol. 2003; 49: 1088-1095. Atopic eczema in primary care. MeReC Bulletin. 2003; 14:1.

39. Caglar M.K. Serum Estradiol levels, in infants with and without Labial Adhesions: The role of estrogen in the etiology and treatment, 2007.

40. Cambell M.F. Vulvar fusion // JAMA, No 115 Pages 513-515, 1940.

41. Tamara L. Callahan, Aaron B. Caughey. Blueprints in obstetrics and gynecology / 2nd ed. 2001.

42. Crone AM. Aetiological factors in vulvar dermatitis JEADV (2000) 14, 181-186.

43. Cuadros Juan. The aetiology of paediatric inflammatory vulvovaginitis // Eur J Pediatr (2004) 163: 105-107.

44. Metella Dei et al. Vulvovaginitis in childhood; Best practice & research clinical obstetrics and gynecology. 24 (2010) 129-137.

45. Denney Jeff M. Bacterial vaginosis: A problematic infection from both a perinatal and neonatal perspective // Seminars in Fetal & Neonatal Medicine. 14 (2009) 200-203.

46. Donders GG. Bosmans E, Dekeersmaecker A, Vereecken A, Van Bulck B, Spitz B. Pathogenesis of abnormal vaginal bacterial flora. Am J Obstet Gynecol 2000; 182:872-8.

47. Forsum U. Bacterial vaginosis - a microbiological and immunological enigma // APMIS 113: 81-90, 2005.

48. Jasper Jill M. Vulvovaginitis in the Prepubertal Child // Clinical pediatric emergency medicine 2009; 10-13.

49. Manohara Joishy, Chetan Sandeep Ashtekar, Arpana Jain, Rohini Gonsalves, Do we need to treat vulvovaginitis in prepubertal girls? Clinical review. BMJ, 2005 V 330 186-188 Metella Dei. Vulvovaginitis in childhood // Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology. 24 (2010), 129-137.

50. Lyubov A Matytsin. Vaginal microbiocoenosis and cytology of prepubertal and adolescent girls: their role in health and disease // World J Pediatr, Vol 6 #1, 2010.

51. Hammerschlag MR, Alpert S, Rosner I, et al. Microbiology of the vagina in children: normal and potentially pathogenic organisms. Pediatrics 1978; 62:57-62 Howard Maibach, Miranda Farage. Lifetime changes in the vulva and vagina // Arch Gynecol Obstet (2006). 273: 195-202.

52. Myhre A.K. Anogenital bacteriology in non-abused preschool children: a Acta Paediatr 91:885-891 / 2002.

53. Noverr M.C., Huffnagle G.B. The 'microflora hypothesis' of allergic diseases // Clin Exp Allergy 2005; 35:1511-1520.

54. Strieker Т., Navratil F., Sennhauser F.H. Vulvovaginitis in prepubertal girls // Arch Dis Child 2003; 88:324-326.