Результат интеллектуальной деятельности: ЛИНИЯ КЛЕТОК PIGAS, СОДЕРЖАЩАЯ СТАБИЛЬНО ИНТЕГРИРОВАННЫЙ В ГЕНОМ САЙТ СВЯЗЫВАНИЯ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА STAT-1

Область техники настоящего изобретения

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, фармакологии, клеточной биологии и генной инженерии, в частности, к получению линии генномодифицированных клеток меланомы человека, используемых для. определения биоактивности IFN-γ.

Настоящее изобретение может быть использовано для определения биологической активности IFN-γ, а также для идентификации молекул различной природы (химических соединений, пептидов и полипептидов) и тестирования активности различных фармацевтических препаратов, демонстрирующих интерфероно-подобную активность или же способных модулировать активность IFN-γ-активированного сигнального пути.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В ответ на воздействие патогенов различной природы клетки иммунной системы синтезируют целый спектр цитокинов, модулирующих иммунный ответ и обеспечивающих защитные функции организма. Среди цитокинов важное место занимают представители интерферонового семейства. Интерфероны представляют собой эволюционно древний компонент врожденного и адаптивного иммунного ответа. Они оказывают противовирусное и антибактериальное действие, участвуют в противоопухолевом иммунном ответе и в развитии атопического дерматита [1]. Нарушение в продукции интерферонов детектируется в ряде заболеваний воспалительной и аутоиммунной природы [2].

Все интерфероны делятся на 3 основных типа (тип I, тип II и тип III), каждый из которых узнает свой рецептор на поверхности клетки [3]. Группа интерферонов типа I самая многочисленная. Она включает в себя 13 разновидностей: IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ω, IFN-δ и IFN-τ. Единственным представителем интерферонов типа II является IFN-γ. К интерферонам типа III относят несколько различных подтипов IFN-A (IFN-λ1, IFN-λ1, IFN-λ3).

IFN-γ входит в группу цитокинов с плейотропным действием, играющих важную роль в иммунном ответе. Ген IFN-γ человека локализуется в 12-ой хромосоме, содержит 4 экзона и кодирует полипептид из 166 аминокислотных остатков. Первоначально считалось, что продукция IFN-γ свойственна только узкому спектру, клеток иммунной системы, среди которых натуральные киллеры (NK), CD4+ Th1-лимфоциты и цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты. Позднее стало очевидно, что В-лимфоциты, NKT-клетки и профессиональные антиген-презентирующие клетки (АРС) (макрофаги, дендритные клетки) также способны к синтезу данного цитокина. IFN-γ-продуцирующая способность у различных типов иммунных клеток разная и тесно связана с особенностями устройства гена, кодирующего этот цитокин [4].

Нарушения в IFN-γ-зависимой системе имеют драматические последствия для организма [5]. Мыши, дефектные по гену IFN-γ, оказываются гиперчувствительны к бактериальным, паразитическим и вирусным инфекциям, вызываемым вирусом коровьей оспы, мышиным вирусом энцефаломиелита, паразитическими протистами Leishmania major, Toxoplasma gondii, бактерией Listeria monocytogenes и некоторыми слабовирулетными микобактериями. У людей среди клинических проявлений, связанных с нарушением в IFN-γ-системе, отмечают сильную восприимчивость к слабовирулентным микобактериям, включая осложнения при вакцинации БЦЖ вплоть до летального исхода. Помимо повышенной восприимчивости к вирусным и бактриальным инфекциям, для детей с дефектной IFN-γ-системой характерна пониженная мобильности нейтрофилов и активность NK-клеток, что связано с ключевой ролью IFN-γ в регуляции воспалительной реакцияии и иммунорегуляции. Кроме того, IFN-γ оказывается важным фактором и при ряде аутоиммунных патологий, включая системную красную волчанку, множественный склероз и инсулин-зависимый сахарный диабет.

IFN-γ используется как важный терапевтический агент. Он оказывает противовирусное, антипаразитическое, микробицидное, иммуномодулирующее и антипролиферативное действия. Влиянию со стороны данного цитокина подвержены компоненты как врожденного, так и адаптивного иммунитета. IFN-γ стимулирует активацию макрофагов и NK-клеток [6]. Кроме того, в присутствии IFN-γ происходит увеличение эффективности презентации процессированного опухолевого антигена в составе комплекса МНС I класса-пептид-β2-микроглобулин Т-клетками. IFN-γ может препятствовать развитию опухоли, оказывая антипролиферативное и проапоптотическое влияние на трансформированные клетки [7], [8]. Активация IFN-γ/STAT-1 сигнального каскада ингибирует опухоль-ассоциированный ангиогенез [9]. С другой стороны, IFN-γ способен индуцировать ускользание опухоли от иммунного надзора [10]-[12].

IFN-γ синтезируется в виде предшественника, содержащего сигнальный пептид размером в 23 аминокислотных остатка. В процессе созревания IFN-γ претерпевает посттрансляционные модификации, включая С-концевой процессинг и N-гликозилирование. Посттрансляционные модификации IFN-γ важны для его биологической активности. В частности, гликозилирование по Asn²⁵ обеспечивает более эффективную димеризацию и секрецию белка [13].

Биологически активная форма IFN-γ представляет собой нековалентный антипараллельный гомодимер, состоящий из гликопротеинов с молекулярной массой массой 20-25 kDa.

Существует несколько способов получения IFN-γ в препаративных количествах. Одним из первых был разработан метод выделения IFN-γ из компонентов человеческой крови. Данный метод имеет ряд существенных недостатков, препятствующих его удачному технологическому внедрению. В частности, выделение нативных цитокинов экономически невыгодно из-за низкого выхода продукта (менее 1 мг/л донорской крови), а также возможности контаминации препатарата различными вирусами, передающихся через кровь и ее компоненты [14]. Технологии получения рекомбинантных белков позволяют избежать описанных трудностей путем эффективного синтеза требуемых белков в прокариотических и эукариотических экспрессионных системах. На настоящий момент на фармацевтическом рынке, преобладает рекомбинантный IFN-γ.

Гетерологическая экспрессия IFN-γ в эукариотических клетках, особенно в клетках млекопитающих, позволяется получить зрелый гликопротеин, прошедший через этапы посттрансляционной модификации, что должно гарантировать уровень его. биологической активности сопоставимый с нативным белком. Однако высокая стоимость компонентов питательных сред для эукариот и необходимость дорогостоящих стадий очистки рекомбинантного IFN-γ, делают коммерчески невыгодным производство данного белка путем экспрессии в клетках млекопитающих [15].

Кроме того, ряд исследований указывает на то, что вид используемой эукариотической системы влияет на качество получаемого рекомбинантного белка. В частности, с использованием различных техник, основанных на масс-спектрометрическом анализе, показано, что рекомбинантный IFN-γ имеет разную, степень и сайты N-гликозилирования, а также структуру С-концевой части молекулы в зависимости от того, получен он в линии клеток яичников китайских хомячков СНО (Chinese hamster ovary cells), в клетках молочных желез трансгенных мышей или в линии клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf9), инфицированных бакуловирусом. [16]. Демонстрируется также, что IFN-γ, полученный в клетках линии СНО, представляет собой гетерогенную популяцию, включающую в себя молекулы с различных уровнем и характером посттрансляционных модификаций [17]. Как уже отмечалось выше, посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, могут сказываться на биоактивности, способности к связыванию рецептора, чувствительности к протеолизу, иммуногенности, а также стабильности терапевтического рекомбинантного белка in vivo. Рекомбинантный IFN-γ человека, полученный в клетках насекомых, отличается от нативного IFN-γ человека по своим фармакокинетическим свойствам. Время выведения такого IFN-γ из кровотока кролика значительно меньше, чем нативного белка [18]. Для рекомбинантного IFN-γ, полученного в клеках мелкопитающих, характерна модификая структурно важной С-концевой части молекулы, что может существенно снизить его биоактивность [16].

Существуют методы экспрессии и очистки функционально активного рекомбинантного IFN-γ в клетках одноклеточных эукариот, например в штаммах дрожжей Pichia pastoris. Серьезным недостатком данного подхода является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза [19].

Еще одним способом наработки рекомбинантного IFN-γ человека является его микробиологический синтез в прокариотических системах. Штаммы-продуценты E.coli широко используются для получения биологически активного рекомбинантного IFN-γ человека в количестве, достаточном как для проведения структурно-функциональных исследований, так и для использования в качестве терапевтичекого агента.

Следует отметить, что используемые на настоящий момент способы выделения и очистки рекомбинантного IFN-γ включают в себя процедуры по ренатурации белка из телец включения. Процесс рефолдинга достаточно сложный и сопряжен с опасностью потери биологической активности выделяемого белка [20]. Вне зависимости от метода, использованного для получения IFN-γ, функциональная активность конечного выделенного и очищенного продукта должна быть проверена и подтверждена.

Кроме того, периодическая проверка функциональной активности требуется и во время хранения IFN-γ. В процессе хранения очищенный рекомбинантный IFN-γ человека может подвергнуться модификациям, способным сильно снизить (вплоть до полного элиминирования) его биологическую активность [21]. В бактериальных клетках отсутствует система посттрансляционной модификации белков, в частности система энзиматического гликозилирования. Однако показано, что рекомбинантный IFN-γ, полученный путем микробиологического синтеза в штаммах E.coli, может, содержать углеводные остатки [22]. В нормальных физиологичеких условиях в клетках E.coli протекает процесс гликирования, заключающийся в неэнзиматической неконтролируемой ковалентной модификации белков углеводными остатками (часто глюкозой). Более того, после ковалентного присоединения остатков глюкозы белок, может претерпевать дальнейшие изменения и в отсутствии Сахаров, что приводит к образованию конечных продуктов глубокого гликирования (advanced glycation end products (AGEs)) [23]. Гликирование рекомбинантного IFN-γ человека отражается на его стабильности. При хранении гликированная фракция очищенного IFN-γ· подвергается протеолизу и ковалентной димеризации, что приводит к потере противовирусной активности препарата [21].

Для оценки удельной биологической активности IFN-γ как природного происхождения, так и полученного методами генной инженерии, используют тест по супрессии цитопатического действия вируса на клеточную культуру. Наиболее часто используются следующие сочетания клетка/вирус: клетки бычьих почек Madin-Darby (MDBK), лимфоидные клетки человека Л-41, перевиваемые клетки почки эмбриона свиньи СПЭВ/вирус везикулярного стоматита (VSV); клетки линии Vero, Нер2С, L929, Л-41/вирус энцефаломиокардита мышей (EMCV); клетки фибробластов человека/вирус леса Семлики, вирус Синдбис или иные [24]. Метод достаточно трудоемкий и требует от исследователя повышенной осторожности в виду работы с вирусными частицами. На настоящий момент тест по супрессии цитопатического действия вируса на клеточную культуру является единственным доступным методом определения биологической активности IFN-γ. Учитывая востребованность процедуры проверки функциональной активности IFN-γ как для лабораторной практики, так и для фармацевтической отрасли, существует необходимость в разработке и создании новых подходов и тестовых систем для решения данной задачи.

Один из возможных подходов к созданию тест-системы для определения биоактивности IFN-γ основывается на способности функционального IFN-γ запускать внутриклеточный сигнальный каскад с участием транскрипционного фактора STAT-1 (Signal Transducer and Activator of Transcription 1).

Обработка клеток функциональным IFN-γ приводит к активации транскрипционного фактора STAT-1. IFN-γ связывается с рецепторным комплексом IFNGR (IFNGR1/IFNGR2) на поверхности клеток. Цитоплазматические домены IFNGR ассоциированы с двумя нерецепторными тирозиновыми киназами JАК1 и JAK2. Образование компекса IFN-γ/IFNGR1/IFNGR2 индуцирует JАК1/JАК2-зависимое фосфорилирование цитоплазматических доменов рецептора, что создает условия для связывания, фосфорилирования и активации транскрипционного фактора STAT-1. Активный фосфорилированный фактор STAT-1 димеризуется и транслоцируется в ядро, где активирует транскрипцию генов, промоторные области которых содержат последовательность GAS (IFN-γ-activated site) [5].

Существуют способы количественной оценки активности транскрипционных факторов. Эти способы основаны на использовании репортерных экспрессионных конструкций, представляющих собой генетические элементы, состоящие из репортерного гена, минимального промотора и сайта связывания для транскрипционного фактора, чья активность детектируется. В качестве репортерного гена может быть использован любой ген, продукт которого легко поддается, количественному измерению и не влияет на физиологию клетки. Под минимальным промотором понимается промотор, который сам по себе не способен направлять экспрессию репортерного гена и требует добавления перед ним специальных регуляторных элементов, таких как сайты связывания для транскрипционного фактора. Сайты связывания, в свою очередь, представляют из себя нуклеотидные последовательности, которые располагаются в непосредственной близости от минимального промотора, распознаются и связываются специфическими транскрипционными факторами, что способствует активации транскрипции репортерного гена с минимального промотора. Репортерные экспрессионные конструкции вводятся в клетки путем трансфекции. В том случае, если в клетке присутствует соответствующий активный транскрипционный фактор, наблюдается экспрессия репортерного гена.

Раскрытие настоящего изобретения

Сущностью настоящего изобретения является создание новой линии клеток PiGAS, содержащей стабильно интегрированную в геном репортерную конструкцию 6xGAS-Luc//Neo, позволяющую детектировать биоактивность IFN-γ. Способность клеток линии PiGAS выступать в качестве модельной системы для детекции активности интерферонов достигается при помощи генной модификации клеток линии меланомы человека MelP плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo, содержащей репортерную кассету 6xGAS-Luc, встроенную в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих, из шести тандемно повторяющихся сайтов связывания GAS (IFN-γ-activated site) транскрипционного фактора STAT-1, минимального промотора SV40 и гена люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc). Помимо репортерной кассеты 6xGAS-Luc плазмида pGAS(x6)-Luc//Neo содержит ген селективного маркера неомицин-фосфотрансферазы (Neo), что позволяет выращивать клетки линии PiGAS на селективной среде, содержащей антибиотик G418.

Технический результат заключается в получении клеток линии PiGAS, стабильно трансфицированных плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo, предназначенной для определения биоактивности IFN-γ человека.

Целью настоящего изобретения является расширение коллекции уникальных клеточных штаммов, которые можно использовать для детекции биологической активности как рекомбинантных, так и эндогенных белков, в частности IFN-γ. Эта задача является особенно актуальной для современной биотехнологии и молекулярной биологии. Интерфероны преимущественно получают методом микробиологического синтеза в различных искусственно сконструированных штаммах P. Pastoris, Ps. putida и Ε.coli. В результате отсутствия посттрансляционных модификаций, свойственных природным эндогенным интерферонам, а также особенностям процедуры очистки рекомбинантных белков полученные препараты нуждаются в проверке их биологичекой активности. При хранении (особенно в водных растворах) интерфероны подвергаются модификации и химическому разложению за счет протекания процессов протеолиза, окисления, дисульфидного обмена и прочих, что также сказывается на их биологической активности. На настоящий момент биологическую активность, препаратов интерферона определяют в основном с помощью тест-систем, в основе которых лежит способность интерферонов подавлять цитопатическое действие вируса (например, вируса везикулярного стоматита) в культуре клеток. Метод достаточно трудоемкий и имеет ряд недостатков в виду необходимости использования вирусных частиц, что в совокупности диктует необходимость разработки новых методов определения биоактивности интерферонов.

Поставленная задача решается тем, что получена новая линия клеток PiGAS, несущая стабильно интегрированную в геном репортерную экспрессионную конструкцию, представляющую собой последовательно расположенные 6 повторов сайта связывания GAS (IFN-γ-activated site) транскрипционного фактора STAT-1, минимальный промотор SV40 и репортерный ген люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc), встроенные в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих. Линия PiGAS также содержит интегрированный в геном ген неомицин фосфотрансферазы II (Neo) под контролем конститутивного протомора PGK-1, что обеспечивает возможность выращивания клеток в ростовой среде в присутствии селективного антибиотика G418.

Полученная клеточная линия PiGAS может быть использована в качестве тест-системы для определения биоактивности IFN-γ. Она позволяет достоверно детектировать биоактивный IFN-γ в концентрации не менее 0,05 нг/мл.

Полученная клеточная линия PiGAS обладает стабильными культуральными и морфологическими свойствами и депонирована во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером Н-161.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 демонстрирует карту полученной плазмиды pGAS(x6)-Luc//Neo, содержащей репортерную экспрессионную кассету для детекции биоактивности IFN-γ, состоящую их гена люциферазы светлячка (Luc) под контролем промотора SV40, которому предшествуют 6 повторов сайта связывания GAS (IFN-γ-activated site) транскрипционного фактора STAT-1 (SEQ ID NO: 1), а также селективный маркерный ген неомицин фосфотрансферазы II (Neo) под контролем конститутивного промотора PGK-1 (SEQ ID NO: 2), обеспечивающий устойчивость эукариотических клеток к антибиотику генетицину (G418).

Фигура 2 демонстрирует результат двойного люциферазного теста, проведенного с лизатами клеток линии меланомы человека MelP, стимулированных IFN-γ. Клетки линии MelP высаживали в лунки 24-луночного планшета по 120000. клеток в лунку, выращивали до достижения 60-80% монослоя, после чего трансфицировали смесью плазмид pGAS(x6)-Luc//Neo и pRL-CMV (Promega, США) при помощи набора для липофекции эукариотических клеток Unifectin-56 (UnifectGroup, Россия) согласно рекомендациям производителя. Спустя 4 часа проводили замену среды в лунках на свежую культуральную среду, содержащую 10 нг/мл рекомбинантного IFN-γ или 100 нг/мл бычьего сыворочного альбумина и инкубировали клетки в течение 24 часов. Далее клетки лизировали и проводили двойной люциферазный тест согласно рекомендациям производителя (Promega, США). Все измерения проводили в четырех повторах. Результаты представлены в виде гистограммы. Под относительной люциферазной активностью понимается отношение активности люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc) к активности люциферазы Renilla.

Стимуляция клеток рекомбинантным IFN-γ человека вызывает увеличение сигнала относительной активности люциферазы в 37 раз по сравнению с нестимулированными клетками.

Фигура 3 демонстрирует результат анализа лизата клеток линии меланомы человека MelP, трансфицированных плазмидами pGAS(x6)-Luc//Neo и pGAS(x6)-Luc, на присутствие белка NPTII (неомицин фосфотрансферазы И) методом вестерн-блот анализа со специфическими антителами. Плазмида pGAS(x6)-Luc отличается от плазмиды pGAS(x6)-Luc//Neo отсутствием селективного маркерного гена неомицин фосфотрансферазы II (Neo) под контролем конститутивного промотора PGK-1. Клетки линии MelP высаживали в лунки 6-луночного планшета по 500000 клеток в лунку, выращивали до достижения 60-80% монослоя, после чего трансфицировали соответствующими плазмидами при помощи набора для липофекции эукариотических клеток Unifectin-56 (UnifectGroup, Россия) согласно рекомендациям производителя. Через 24 часа клетки лизировали в буфере Лэмли (BioRad) и использовали для анализа. Все образцы разделяли в 12,5% ДСН-ПААГ в редуцирующих условиях, после чего проводили вестерн-блот анализ с использованием антител к неомицин фосфотрансферазе II (Millipore, США). Для оценки молекулярной массы белков использовали маркер молекулярной массы Prescision Plus Protein™ Standard (Bio-Rad, США).

По результатам вестерн-блот анализа в образце, соответствующем лизату клеток линии MelP, трансфицированных плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo, детектируется белок весом 29 кДа, отсутствующий в нетрансфицированных клетках или клетках, трансфицированных плазмдой pGAS(x6)-Luc. Размер детектируемого белка соответствует размеру неомицин фосфотрансферазы II. 1 - нетрансфицированные клетки линии меланомы человека MelP, 2 - клетки линии меланомы человека MelP, трансфицированные плазмидой pGAS(x6)-Luc, 3 - клетки линии меланомы человека MelP, трансфицированные плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo.

Фигура 4 демонстрирует результат анализа активности STAT-1-зависимого репортера в клеточной линии PiGAS, содержащей стабильно интегрированную в геном экспрессионную кассету 6xGAS-Luc//Neo. Клетки линии PiGAS высаживали в лунки. 24-луночного планшета по 120000 клеток в лунку. Спустя 4-6 часов, убедившись, что клетки полностью прикрепились ко дну планшета и восстановили морфологию, проводили замену среды в лунках на свежую культуральную среду, содержащую 10 нг/мл рекомбинантного IFN-γ человека и инкубировали клетки в течение 24 часов. Далее получали клеточные лизаты, в которых измеряли активность люциферазы при помощи люциферазного теста (Promega, США) и концентрацию общего белка при помощи бицинхониновой кислоты (Sigma-Aldrich, США). Для каждого лизата проводили нормировку значения активности люциферазы на концентрацию общего белка. Все измерения проводили в четырех повторах. Результаты представлены в виде гистограммы. Под относительной люциферазной активностью понимается отношение активности люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc) к концентрации общего белка.

Стимуляция клеток рекомбинантным IFN-γ человека вызывает увеличение сигнала относительной активности люциферазы в 15 раз по сравнению с нестимулированными клетками.

Фигура 5 демонстрирует зависимость уровня активности люциферазы (А) и уровень фосфорилирования транскрипционного фактора STAT-1 (Б) в репортерной клеточной линии PiGAS, содержащей стабильно интегрированную в геном экспрессионную кассету 6xGAS-Luc//Neo, от концентрации рекомбинантного IFN-γ человека. Клетки линии PiGAS высаживали в лунки 96-луночного планшета по 30000 клеток в лунку. Спустя 16 часа проводили замену среды в лунках на свежую культуральную среду, содержащую рекомбинантный IFN-γ человека в концентрации от 0,01 нг/мл до 10 нг/мл и инкубировали клетки в течение 24 часов. Далее получали клеточные лизаты. (А) В клеточных лизатах измеряли активность люциферазы при помощи люциферазного теста (Promega, США) и концентрацию общего белка при помощи бицинхониновой кислоты (Sigma-Aldrich, США). Для каждого лизата проводили нормировку значения активности люциферазы на концентрацию общего белка. Все измерения проводили в четырех повторах. Результаты представляли в виде графика зависимости относительной люциферазной активности от концентации рекомбинантного IFN-γ человека. Под относительной люциферазной активностью понимается отношение активности люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc) к концентрации общего белка. Репортерная клеточная линия PiGAS достоверно детектирует биоактивный IFN-γ в концентрации не менее 0,05 нг/мл. (Б) В клеточных лизатах также проводили детекцию фосфорилированной формы транскрипционного фактора STAT-1 (pY-STAT-1) и тотального STAT-1 при помощи вестерн-блот анализа с использованием специфических антител (Cell signaling, США). pY-STAT-1 детектируется в лизатах клеток линии PiGAS, стимулированных IFN-γ в концентрации не ниже 0,1 нг/мл.

Фигура 6 демонстрирует зависимость уровня активности люциферазы в репортерной линии PiGAS, содержащей стабильно интегрированную в геном экспрессионную кассету 6xGAS-Luc//Neo, от времени стимуляции клеток рекомбинантным IFN-γ человека. Клетки линии PiGAS засевали в лунки 96-луночного планшета по 30000 клеток в лунку. Спустя 16 часов проводили замену среды в лунках на свежую культуральную среду, содержащую рекомбинантный IFN-γ человека в концентрации 2,5 нг/мл (прерывистая линия) или 10 нг/мл (сплошная линия), инкубировали клетки в течение 2, 4, 6, 8, 10 или 24 часов, после чего получали клеточные лизаты. Для каждого временного значения в качестве контроля использовали клетки линии PiGAS, нестимулированные IFN-γ. В клеточных лизатах измеряли активность люциферазы при помощи люциферазного теста (Promega, США) и концентрацию общего белка при помощи бицинхониновой кислоты (Sigma-Aldrich, США). Для каждого лизата проводили нормировку значения активности люциферазы на концентрацию общего белка. Все измерения проводили в четырех повторах. Результаты представляли в виде отношения нормированной активности люциферазы в лизатах клеток, стимулированных IFN-γ, к нормированной активности люциферазы в лизатах клеток, нестимулированных IFN-γ. В лизатах клеточной линии PiGAS достоверно детектируется увеличение активности люциферазы (по сравнению с нестимулированными клетками) спустя 4 часа после стимуляции клеток биоактивным IFN-γ в концентрациях 2,5 нг/мл и 10 нг/мл.

Примеры осуществления настоящего изобретения

Пример 1. Получение генетической репортерной экспрессионной кассеты для детекции уровня активности IFN-γ /STAT-1-зависимого сигнального каскада, встроенной в вектор, предназначенный для экспрессии в клетках млекопитающих (плазмида pGAS(x6)-Luc//Neo)

Генетическая репортерная экспрессионная кассета 6xGAS-Luc//Neo состоит из. нескольких отдельных структурных блоков, несущих различное функциональное значение. Она включает в себя 1) репортерный ген люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc) под контролем минимального промотора SV40, которому предшествуют 6 повторов сайта связывания GAS (IFN-γ-activated site) транскрипционного фактора. STAT-1 (SEQ ID NO: 1); и 2) селективный маркерный ген неомицин фосфотрансферазы II (Neo) под контролем конститутивного промотора PGK-1 (SEQ ID NO: 2). Репортерный экспрессионный элемент 6xGAS-Luc//Neo обеспечивает возможность детекции активности ΙΡΝ-γ/STAT-1-зависимого сигнального каскада, а наличие гена Neo дает возможность выращивать клетки, содержащие данную плазмиду, на среде с антибиотиком генетицином (G418).

Фрагмент ДНК, включающий в себя элемент экспрессионной репортерной кассеты 6xGAS-Luc//Neo, был получен с использованием традиционных генно-инженерных методов и подходов.

Нуклеотидная последовательность для связывания транскрипционного фактора STAT-1 под названием GAS (IFN-γ-activated site) была взята из промоторной области гена гуанилат-связывающего белка GBP (guanylate-binding protein) [25]. Олигонуклеотиды (5'- TCGAGAGTTTCATATTACTCTAAATCG -3' и 5'-TCGACGATTTAGAGTAATATGAAACTC -3'), которые при отжиге друг на друга дают ДНК-фрагмент, содержащий мономерную последовательность GAS, фланкированную сайтами рестрикции XhoI и SalI, были подвергнуты самолигированию с последующей обработкой полученного мультимерного продукта рестриктазой Salí, ДНК-полимеразой Pfu и рестриктазой XhoI. Полученная смесь мультимеров разного размера была подвергнута электрофорезу в агарозном геле. ДНК-фрагмент размером 162 п. о., соответствующий тандемным повторам из шести последовательностей GAS, был выделен из геля и клонирован в вектор pBluescript-SK(-) (Stratagene, США) по сайтам XhoI и SmaI. Далее фрагмент ДНК 6xGAS (170 п. о.) был вырезаны из плазмиды pBluescript-SK(-) по сайтам XhoI и ВаmHI и клонирован в вектор pGL3promoter (Promega, США) по сайтам XhoI и BglII.

В полученную плазмиду pGAS(x6)-Luc по сайтам SalI и ВаmHI был также вставлен фрагмент, кодирующиий ген неомицин фосфотрансферазы II (Neo) под контролем конститутивного промотора PGK-1, предварительно вырезанный из плазмиды pΡΝΤ по сайтам XhoI и ВаmHI. Ген Neo кодирует селективный маркер - ген устойчивости к антибиотику генитицину (G418), позволяющий проводить селекцию в клетках млекопитающих при получении клонов клеток, содержащих стабильно интегрированную в геном репортерную конструкцию 6xGAS-Luc//Neo.

Пример 2. Проверка функциональной активности полученной генетической конструкции pGAS(x6)-Luc//Neo, содержащей ген люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc) под контролем STAT-1-зависимого промотора и ген неомицин фосфотрансферазы II (Neo) под контролем конститутивного промотора PGK-1.

Проверка функциональной активности плазмиды pGAS(x6)-Luc//Neo осуществлялась в два этапа с использование клеточной линии меланомы человека MelP. На первом была доказана функциональная активность экспрессинной кассеты 6xGAS-Luc, состоящей из 6 повторов сайта связывания GAS (IFN-γ-activated site) транскрипционного фактора STAT-1, минимального промотора SV40 и репортерного гена люциферазы светлячка Photinuspyralis (Luc).

Для этого клетки линии MelP трансфицировали смесью опытной (pGAS(x6)-Luc//Neo) и контрольной (pRL-CMV (Promega, США)) плазмид. Контрольная плазмида кодирует ген люциферазы Renilla под контролем конститутивного промотора и служит для оценки жизнеспособности клеток, эффективности трансфекции и используется для нормировки сигнала от люфицеразы светлячка (Luc). Трансфекцию проводили при помощи набора для липофекции эукариотических клеток Unifectin-56 (UnifectGroup, Россия) согласно рекомендациям производителя. Трансфицированные клетки обрабатывали рекомбинантным белком IFN-γ человека в концентрации 10 нг/мл или бычьим сыворочным альбумином в концентрации 100 нг/ мл (в качестве отрицательного контроля) в течение 24 часов. В присутствии IFN-γ происходит фосфорилирование и активация транскрипционного фактора STAT-1, в результате чего фосфо-STAT-1 формирует гомодимеры, транслоцируется в ядро и связывается с нуклеотидной последовательностью GAS в промоторной области репортерного гена люциферазы светлячка (Luc), тем самым запуская экспрессию этого гена с последующей наработкой люциферазы. Активность люциферазы в клеточных лизатах анализировали при помощи двойного люциферазного теста согласно рекомендациям производителя (Promega, США). Результаты представляли в виде отношения активности люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc) к активности люциферазы Renilla. По результатам данного теста было установлено, что в присуствии IFN-γ детектируется тридцатисемикратное увеличение уровня активности люциферазы, что подтверждает функциональную активность экспрессинной кассеты 6xGAS-Luc.

На втором этапе оценки активности плазмиды pGAS(x6)-Luc//Neo была доказана функциональность экспрессионного элемента, кодирующего ген неомицин фосфотрансферазы II (Neo) под контролем конститутивного протомора PGK-1. Клетки линии MelP трансфицировали плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo, а также плазмидой pGAS(x6)-Luc при помощи набора для липофекции эукариотических клеток Unifectin-56 (UnifectGroup, Россия) согласно рекомендациям производителя. Плазмида pGAS(x6)-Luc была использована в качестве отрицательного контроля, поскольку в ней отсутствует экспрессионный элемент PGK-1-Neo. Трансфицированные клетки культивировали в ростовой среде (среда RPMI-1640 с 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ L-Глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в течение 24 часов, после чего получали клеточные лизаты и осуществляли анализ наличия в них неомицин фосфотрансферазы II при помощи вестерн-блот анализа со специфическими антителами (Millipore, США). Вестерн-блот анализ показал наличие белка с молекулярной массой около 29 кДа, что соответствует молекулярной массе к неомицин фосфотрансферазы II.

Пример 3. Получение новой клеточной линии PiGAS, содержащей стабильно интегрированную в геном генетическую конструкцию 6xGAS-Luc//Neo

Для получения клонов клеток со стабильно интегрированной в геном репортерной кассетой 6xGAS-Luc//Neo использовали клетки линии меланомы человека MelP, трансфицированные плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo.

Трансфекцию клеток осуществляли при помощи набора для липофекции эукариотических клеток Unifectin-56 (UnifectGroup, Россия) согласно рекомендациям производителя. Селекцию клонов проводили в ростовой среде (среда RPMI-1640 с 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ L-Глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина), содержащей 800 мкг/мл антибиотика G418. После формирования резистентными клетками колоний последние переносили в 96-луночный планшет. Те клоны, которые покрывали дно лунки 96-луночного планшета на 50-80%, переносили в лунки 24-луночного планшета, где культивировали до состояния, когда клон клеток достигал монослоя, после чего переносили в лунки 6-луночного планшета..

После формирования в лунках 6-луночного планшета монослоя из клона клеток линии меланомы человека MelP, трансфицированных плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo, проводили анализ способности клона продуцировать люциферазу светлячка в ответ на обработку IFN-γ. Для этого клетки каждого клона высаживали в 8 лунок 96-луночного планшета из расчета 30000 клеток в лунку. Спустя 4 часа, убедившись, что клетки прикрепились к дну лунок и восстановили распластанную морфологию, меняли культуральную среду в 4 лунках на свежую ростовую среду, а в других 4 лунках на свежую ростовую среду с добавлением 10 нг/мл IFN-γ. После чего культивировали клетки в течение 24 часов. По окончании культивирования ростовую среду удаляли, клетки промывали однократным раствором PBS, после чего лизировали. В клеточных лизатах определяли активность люциферазы светлячка Photinus pyralis при помощи люциферазного теста и концентрацию общего белка при помощи бицинхониновой кислоты (Sigma-Aldrich, США). Далее значения люциферазной активности нормировали на концентрацию общего белка и делали вывод о способности каждого из клонов отвечать на стимуляцию IFN-γ. По результатам проверки полученных клонов клеток линии меланомы человека MelP, трансфицированных плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo, был отобран клон, для которого было характерное оптимальное соотношение сигнал (нормированная активность люциферазы в клетках, стимулированных IFN-γ)/ шум (нормированная активность люциферазы в нестимулированных клетках). Клон получил название PiGAS. Клетки клона PiGAS выращивали в чашке Петри диаметром 6 см, после чего в чашке Петри 10 см.

Пример 4. Определение предела чувствительности клеточной линии PiGAS к IFN-γ

Для определения предела чувствительности клеточной линии PiGAS к IFN-γ клетки линии PiGAS высаживали в лунки 96-луночного планшета из расчета 30000 клеток в лунку и культивировали в течение 16 часов в ростовой среде (RPMI-1640 с 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ L-Глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Далее ростовую среду в лунках меняли на свежую с добавлением рекомбинантного IFN-γ в концентрации от 0,01 нг/мл до 10 нг/мл и продолжали культивирование в течение следующих 24 часов. По окончании культивирования ростовую среду удаляли, клетки промывали однократным раствором. PBS, после чего лизировали. В клеточных лизатах определяли активность люциферазы светлячка Photinus pyralis при помощи люциферазного теста и концентрацию общего белка при помощи бицинхониновой кислоты (Sigma-Aldrich, США). Значения люциферазной активности нормировали на концентрацию общего белка. Результаты, представляли в виде графика зависимости относительной люциферазной активности, отражающей отношение активности люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc) к концентрации общего белка, от концентации рекомбинантного IFN-γ человека.

Кроме того, в полученных лизатах также анализировали наличие фосфорилированной и нефосфорилированной форм STAT-1 при помощи вестерн-блот анализа с использованием специфических антител к STAT-1 (Cell Signaling, США) и фосфо-STAT-1 (Cell Signaling, США). Наличие фосфорилированной формы STAT-1 служит косвенным признаком активации IFN-γ/STAT-1-сигнального пути и указывает на биоактивность IFN-γ.

Клеточная линия PiGAS, содержащая стабильно интегрированную в геном репортерную экспрессионную конструкцию 6xGAS-Luc//Neo, достоверно детектирует биоактивный IFN-γ в концентрации не менее 0,05 нг/мл. Таким образом, клеточная линия PiGAS может быть использована для определения биоактивного IFN-γ.

Пример 5. Определение оптимального времени воздействия IFN-γ на клеточную линию PiGAS

Для определения оптимального времени воздействия биоактивного IFN-γ на клетки линии PiGAS, достаточного для индукции люциферазной активности репортерной кассеты, стабильно интегрированной в геном клеток PiGAS, клетки линии PiGAS высаживали в лунки 96-луночного планшета из расчета 30000 клеток в лунку и культивировали в течение 16 часов в ростовой среде (RPMI-1640 с 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ L-Глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) до достижения 65-85% монослоя, после чего среду в лунках меняли на свежую с добавлением рекомбинантного IFN-γ человека в концентрации 2,5 нг/мл, либо 10 нг/мл. Стимуляцию клеток IFN-γ проводили в течение различных интервалов времени: 2, 4, 6, 8, 10 и 24 часа. При этом для каждого временного значения в качестве контроля использовали клетки линии PiGAS, нестимулированные IFN-γ. Далее ростовую среду удаляли, клетки промывали однократным раствором PBS, получали клеточные лизаты, в которых определяли активность люциферазы светлячка при помощи люциферазного теста и концентрацию общего белка при помощи бицинхониновой кислоты (Sigma-Aldrich, США). Значения люциферазной активности нормировали на концентрацию общего белка. Все измерения проводили в четырех повторах. Результаты представляли в виде графика зависимости относительной люциферазной активности, отражающей отношение нормированной активности люциферазы в лизатах клеток, стимулированных IFN-γ, к нормированной активности люциферазы в лизатах клеток, нестимулированных IFN-γ, от времени воздействия IFN-γ.

Для стимуляции клеток линии PiGAS биоактивным IFN-γ (в концентрации как 2,5 нг/мл, так и 10 нг/мл) минимальным эффективным временем воздействия является значение 4 часа. При инкубации клеток линии PiGAS с биоактивным IFN-γ в течение 6 часов значение детектируемой относительной люциферазной активности достигает максимума. Увеличение времени воздействия свыше 6 часов нецелесообразно, поскольку не приводит к дальнейшему росту детектируемой относительной люциферазной активности.

Родословная клеточной линии;

Линия клеток PiGAS получена из клеток линии меланомы человека MelP [26] путем трансфекции их плазмидой pGAS(x6)-Luc//Neo.

Трансфицированные клетки содержат стабильно интегрированную в геном репортерную конструкцию 6xGAS-Luc, состоящую из 6 повторов сайта связывания транскрипционного фактора STAT-1, минимального промотора SV-40 и гена люциферазы светлячка Photinus pyralis (Luc), а также ген устойчивости к селективному антибиотику G418 под контролем своего конститутивного промотора PGK-1.

Число пассажей:

К моменту составления паспорта клеточная линия прошла более 15 пассажей.

Стандартные условия культивирования:

Питательная среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбирональной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и смесь антибиотиков (пенициллин - 100 ед/мл, стрептомицин - 100 мкг/мл, G418 - 400 мкг/мл). Культивирование осуществляется при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Пассаж 1 раз в 3-4 суток. Кратность рассева 1:4-1:6, оптимальная плотность 15000-20000 клеток/см². Метод снятия: 0,05% раствор трипсина.

Культуральные свойства:

Клетки имеют преимущественно адгезионный, преимущественно монослойный характер роста в стандартных условиях культивации.

Маркерные признаки:

Функциональный ответ в люциферазном тесте, основанном на продукции люциферазы светлячка Photinus pyralis в ответ на обработку клеток IFN-γ в концентрации не менее 0,05 нг/мл в течение не менее 18 часов или в концентрации 10 нг/мл в течение не менее 4 часов. Устойчивость к антибиотику G418 (800 мкг/мл).

Контаминация:

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении. Тест на микоплазму отрицателен.

Условия криоконсервации:

Среда для замораживания: 80% ростовая среда, 10% эмбриональная бычья сыворотка, 10% DMSO. Количество замораживаемых клеток: 1,0-2,0×10⁶ клеток/мл, 1 мл клеточной суспензии в ампуле. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 5 мл ростовой среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды и переносят в культуральный флакон с площадью роста 25 см². Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет не менее 70%.

Список процитированной литературы

[1] A. Bufe, К. Gehlhar, Ε. Grage-Griebenow, and M. Ernst, "Atopic phenotype in children is associated with decreased virus-induced interferon-alpha release.," Int. Arch. Allergy Immunol, vol. 127, no. 1, pp.82-8, Jan. 2002.

[2] F.-C. Lin and H.A. Young, "The talented interferon-gamma," Adv. Biosci. Biotechnol, vol. 04, no. 07, pp. 6-13, 2013.

[3] S. Pestka, "The Interferons: 50 Years after Their Discovery, There Is Much More to Learn," J. Biol. Chem., vol. 282, no. 28, pp. 20047-20051, 2007.

[4] J.R. Schoenborn and С.B. Wilson, "Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses.," Adv. Immunol, vol. 96, pp. 41-101, Jan. 2007.

[5] K. Schroder, P.J. Hertzog, T. Ravasi, and D.A. Hume, "Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions.," J. Leukoc. Biol, vol. 75, no. 2, pp. 163-89, Feb. 2004.

[6] X. Hu and L. B. Ivashkiv, "Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.," Immunity, vol. 31, no. 4, pp. 539-50, Oct. 2009.

[7] J.F. Bromberg, C.M. Horvath, Z. Wen, R.D. Schreiber, and J.E. Darnell, "Transcriptionally active Stat1 is required for the antiproliferative effects of both interferon alpha and interferon gamma.," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.Α., vol. 93, no. 15, pp. 7673-8, Jul. 1996.

[8] Y.E. Chin, M. Kitagawa, K. Kuida, R.A. Flavell, and X.Y. Fu, "Activation of the STAT signaling pathway can cause expression of caspase 1 and apoptosis.," Mol. Cell. Biol, vol. 17, no. 9, pp. 5328-37, Sep.1997.

[9] T.E. Battle, R.A. Lynch, and D.A. Frank, "Signal Transducer and Activator of Transcription 1 Activation in Endothelial Cells Is a Negative Regulator of Angiogenesis," Cancer Res., vol. 66, no. 7, pp. 3649-3657, Apr. 2006.

[10] S. Nguyen, V. Beziat, N. Dhedin, M. Kuentz, J.P. Vernant, P. Debre, and V. Vieillard, "HLA-E upregulation on IFN-gamma-activated AML blasts impairs CD94/NKG2A-dependent NK cytolysis after haplo-mismatched hematopoietic SCT.," Bone Marrow Transplant., vol. 43, no. 9, pp.693-9, May 2009.

[11] L. , M. Corvaisier, В. Charreau, A. Moreau, E. Godefroy, A. Moreau-Aubry, F. Jotereau, and N. Gervois, "Expression and release of HLA-E by melanoma cells and melanocytes: potential impact on the response of cytotoxic effector cells.," J. Immunol, vol. 177, no. 5, pp.3100-7, Sep.2006.

[12] A.E. , A.D. Chernisheva, I.R. Zakeeva, A.B. Danilova, A.O. Danilov, V.M. Moiseenko, D. Geraghty, Ν. V. Gnuchev, G.P. Georgiev, Α. V Kibardin, and S. S. Larin, "[HLA-E molecule induction on the surface of tumor cells protects them from cytotoxic lymphocytes]," Vopr. Onkol, vol. 55, no. 2, pp.224-9, Jan. 2009.

[13] T. Sareneva, J. Pirhonen, K. Cantell, N. Kalkkinen, and I. Julkunen, "Role of N-glycosylation in the synthesis, dimerization and secretion of human interferon-gamma.," Biochem. J., vol. 303 (Pt 3, pp.831-40, Nov. 1994.

[14] I.A. Braude, "Purification of natural human immune interferon induced by A-23187 and mezerein.," Methods Enzymol, vol. 119, pp. 193-9, Jan. 1986.

[15] Енсен Анна Дам (DK), Патент РФ 2296130 "Варианты полипептида гамма-интерферона", 2002.

[16] D.С. James, M.H. Goldman, M. Hoare, N. Jenkins, R.W. Oliver, B.N. Green, and R.B. Freedman, "Posttranslational processing of recombinant human interferon-gamma in animal expression systems.," Protein Set, vol. 5, no. 2, pp. 331-40, 1996.

[17] E.M. Curling, P.M. Hayter, A.J. Baines, A.T. Bull, K.Gull, P.G. Strange, and N. Jenkins, "Recombinant human interferon-gamma. Differences in glycosylation and proteolytic processing lead to heterogeneity in batch culture.," Biochem. J., vol. 272, no. 2, pp. 333-7, Dec. 1990.

[18] T. Sareneva, K. Cantell, L. Pyhâla, J. Pirhonen, and I. Julkunen, "Effect of carbohydrates on the pharmacokinetics of human interferon-gamma.," J. Interferon Res., vol. 13, no. 4, pp.267-9, Aug. 1993.

[19] D. Wang, H. Ren, J.-W. Xu, P.-D. Sun, and X.-D. Fang, Expression, purification and characterization of human interferon-γ in Pichia pastoris," Mol. Med. Rep., vol. 9, no.2, pp.715-719, Feb. 2014.

[20] А.И. Закабунин, Г.А. Барановская, Η.M. Пустошилова, В.Φ. Майстренко, Л.П. Гаврюченкова и О.А. Громова, Патент РФ 2132386 "Способ получения рекомбинантного интерферона-гамма человека", 1999.

[21] R. Mironova, T. Niwa, R. Dimitrova, M. Boyanova, and I. Ivanov, "Glycation and post-translational processing of human interferon-gamma expressed in Escherichia coli.," J. Biol. Chem., vol. 278, no. 51, pp. 51068-74, Dec. 2003.

[22] R. Mironova, T. Niwa, H. Hayashi, R. Dimitrova, and I. Ivanov, "Evidence for non-enzymatic glycosylation in Escherichia coli.," Mol. Microbiol, vol. 39, no. 4, pp. 1061-8, Feb. 2001.

[23] A.S. Eble, S.R. Thorpe, and J.W. Baynes, "Nonenzymatic glucosylation and glucose-dependent cross-linking of protein.," J. Biol. Chem., vol. 258, no. 15, pp. 9406-12, Aug. 1983.

[24] Министерство здравоохранения РФ, Общая фармакопейная статья "Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток".

[25] Т. Decker, D.J. Lew, Y.S. Cheng, D.Ε. Levy, and J.Ε. Darnell, "Interactions of alpha- and gamma-interferon in the transcriptional regulation of the gene encoding a guanylate-binding protein.," EMBO J., vol. 8, no. 7, pp. 2009-14, Jul. 1989.

[26] О.С. Бурова, С.С. Ларин, Г.Η. Ворожцов, И.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников, Л.Ф. Морозова, Г.П. Георгиев, Н.В. Гнучев, Л.В. Демидов, Т.Н. Палкина и А.М. Козлов, Патент РФ 2287575 "Клеточная линия меланомы человека mel p, используемая для получения противоопухолевых вакцин", 2005.