Результат интеллектуальной деятельности: Способ профилактического лечения при развитии неопластических процессов кожной ткани, таких как меланома, базально-клеточный рак, плоскоклеточный рак

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, фармакологии, ветеринарии, и может быть использовано для профилактического лечения и профилактики возникновения неопластических процессов кожной ткани - плоскоклеточного и базально-клеточного рака кожи, а также меланомы и других доброкачественных и злокачественных опухолей кожи, с помощью фармацевтического препарата, включающего белково-полипептидный комплекс, полученный из гомогенатов нервной и кожной тканей эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных.

В настоящее время, на фоне неуклонного роста заболеваний кожной ткани аутоиммунного, сосудистого, токсического, инфекционного, травматического генеза, а также ятрогенных осложнений после применения «омолаживающих» препаратов, косметических средств и процедур не существует препаратов группы прямых репарантов, специфичных для кожной ткани.

Известны различные формы онкологических заболеваний кожи (рака кожи), такие, например, как меланома, базалиома (базально-клеточный рак), плоскоклеточный рак кожи.

Лечение меланом, в частности, представляет трудную задачу из-за бурной, рано наступающей диссеминации. Оно должно проводиться только в условиях специализированного учреждения. Лечение меланомы преимущественно хирургическое. На 1-2 стадиях проводят радикальное иссечение меланомы.

Известны вакцины против меланомы, которые представляют собой аллогенные опухолевые клетки и их лизаты, аутогенные опухолевые клетки, различные антигены (MAGE-1, MAGE-3, MART-1, gr100 и др.). Эти вакцины повышают активность цитотоксических лимфоцитов по отношению к малигнизированным клеткам, активизируют пролиферацию Т-лимфоцитов, инфильтрацию опухоли CD8+.

Известно, что противоопухолевые препараты по механизму действия и химическому строению разделяются на несколько групп: алкилирующие соединения, антиметаболиты, антибиотики, вещества растительного или животного происхождения, гормональные препараты, ферменты и другие.

В основе противоопухолевого действия этих соединений лежит нарушение (подавление) обмена нуклеиновых кислот, особенно ядерных нуклеотидов, что ведет к прекращению клеточного давления и роста опухоли (патент US 4622325, 11.11.1986; авторское свидетельство SU 1208619, патент RU 2040255).

Но, поскольку известные противоопухолевые препараты способствуют только подавлению клеточной активности, не затрагивая причины, вызывающей опухоль, то рецидивы опухоли и метастазирование не исключаются.

Базалиома - рак кожи с местно-деструктурирующим ростом, который возникает из эпидермиса или волосяных фолликулов и редко метастазирует (по данным ВОЗ 1974 г.). По данным ряда авторов (Шанин А.П. Опухоли кожи, их происхождение, клиника и лечение, Л., 1969, с. 154-172), базалиома встречается чаще других новообразований кожи и занимает промежуточное положение между доброкачественными опухолями и плоскоклеточным раком. На ее долю приходится от 77 до 90% злокачественных эпителиальных опухолей кожи (Венкей Т., Шувгар Я. Злокачественные опухоли кожи, Будапешт, 1962, с. 12-15). Известные методы лечения базалиом кожи: хирургическое иссечение, электрокоагуляция, криодеструкция, лучевая терапия, лазеротерапия, химиотерапия, наружное лечение противоопухолевыми препаратами (Коган М.Г. Совершенствование методов лечения множественных базалиом кожи на основании изучения их иммуноморфологических особенностей. Автореферат диссертации кандидата медицинских наук, М., 1984, с. 24) недостаточно эффективны, вызывают рецидивы заболевания и сопровождаются поздними послеоперационными осложнениями в виде глубоких дефектов кожи.

Из RU 2179000, 10.02.2002 известен способ комплексного лечения базалиом кожи.

Предложено начинать лечение с приема человеческого лейкоцитарного интерферона в виде ингаляций по 20 тыс. ЕД, через день, на курс лечения 20 процедур. На фоне иммунокоррекции проводили радиоволновое удаление базалиом на аппарате «Сургитрон» (Surgitron) производства фирмы «Ellman international» (США). Способ обладает качественно новым подходом и высокой эффективностью в комплексной терапии базалиом кожи и коррекции иммунологических показателей, приводит к высокому проценту излечения, характеризуется отсутствием рецидивов и осложнений терапии.

Однако данный способ не обладает широким спектром действия при развитии неопластических и репаративных процессов кожи и при профилактическом лечении и профилактике различных онкологических заболеваний кожи.

Общеизвестно для специалиста в области лечения различных заболеваний, в том числе и онкологических заболеваний кожи, т.е. при развитии неопластических процессов кожной ткани (меланома, базально-клеточный, плоскоклеточный рак), что под понятием:

- профилактическое лечение,

- профилактика по отношению к способам лечения,

- в частности, терапии онкологических заболеваний кожи, и профилактики их,

понимается профилактическое лечение и профилактика при начальном развитии неопластических процессов кожной ткани, таких как меланома, базально-клеточный и плоскоклеточный рак.

Особым направлением в терапии злокачественных опухолей является разработка способов лечения рака с использованием препаратов из животного сырья, преимущественно из эмбриональных органов животных и человека (DE 228739, 29.04.1983; DE 2600442, 08.01.1976).

Препараты, получаемые из животных тканей, обладают существенным преимуществом по сравнению с известными цитостатиками химического происхождения, так как обладают слабым гепатотоксическим и тератогенным действием. Однако применение данных препаратов сдерживается из-за ограниченности сырьевой базы и из-за опасности развития аллергических осложнений ввиду того, что последние обладают видимой антигенной специфичностью.

В частности, из заявки Франции №2451193, 13.03.1979 известен способ лечения рака с помощью гомогената эмбриональной ткани.

Известный способ заключается в следующем: при наружной локализации опухолевого процесса больному наносят в виде аппликаций гомогенат (суспензию) эмбриональной ткани в смеси с фармацевтическим пригодным наполнителем, а в случае внутренней локализации опухоли - парентерально вводят 10 мл 10%-ного водно-солевого гомогената эмбриональной ткани 1-2 раза в день в течение 4-12 недель. В качестве наполнителя используют изотонический раствор хлорида натрия. После месяца лечения частоту введения гомогената эмбриональной ткани постепенно уменьшают до 1-2 раза в неделю и продолжают лечение еще 2-3 мес. Способ особенно эффективен при наружной локализации опухоли, так как часто наблюдается отделение опухоли от соседних здоровых тканей, что благоприятствует успешному хирургическому удалению опухоли. Ближайший противоопухолевый эффект наблюдается через 2-3 недели после начала лечения. Средняя длительность ремиссии составляет 9 мес.

Недостатком известного способа является то, что использование ксеногенной эмбриональной ткани ограничено видовой антигенной специфичностью. Кроме того, предлагаемый для лечения гомогенат эмбриональной ткани представляет собой смесь неустановленного состава, содержащую фетальные белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и другие компоненты. Поэтому предлагаемое средство нельзя стандартизовать по составу, так как оно будет зависеть от исходной ткани и в процессе лечения могут возникнуть побочные осложнения из-за токсических реакций.

Из RU 2105567, 27.02.1998 известен способ лечения злокачественных опухолей, в том числе рака кожи, губы, слизистой полости рта, при длительно незаживающих ранах трофических язв путем введения альфа-фетопротеина (АФП) в разовой дозе 500-5000 МЕ/кг веса больного 1-2 раза в сутки в течение 4-6 недель с использованием в качестве носителя физиологического раствора (раствор хлорида натрия).

За ME (международная единица) АФП принимают количество белка, равное 1,25 нг. Далее по тексту все данные будут приведены в ME.

АФП представляет собой онкофетальный белок, который получают из абортивного материала человека (природный альфа-фетопротеин) или из осповакцины на эмбриональных клетках легких человека (рекомбинантный альфа-фетопротеин). В заявленном способе может быть использован любой тип альфа-фетопротеина (природный или рекомбинантный). АФП не пирогенен, не кумулируется в организме, не обладает тератогенным, анафилактогенным, эмбриотоксическим, аллергизирующим и гистаминоподобным свойствами.

Однако данный способ основан на использовании абортивного материала человека, что ограничивает его использование.

Из RU 2240810, 27.11.2004 известен способ профилактики и лечения предопухолевых патологических состояний, включающий вакцинацию лиц, относящихся к группам высокого онкологического риска по результатам тестирования, эмбриональным противоопухолевым модулятором (ЭПОМ), который вводят подкожно 1 раз в год в дозе 0,02-0,04 мг/кг. Модулятор ЭПОМ содержит широкий спектр онкофетальных антигенов. Препарат получен из эмбриональных тканей человека и животных и содержит пул белков-гликопротеидов, извлеченных методом спиртового осаждения. Однако, данный препарат не используется для лечения и профилактики (профилактического лечения) рака кожи.

Из RU 2283129, 10.09.2006 известен белково-пептидный противоопухолевый препарат (композит), содержащий белок теплового шока семейства HSP70 и нековалентно связанный с ним опухолево-специфический пептид, выбранный из группы: MAGE-A1, - А2, - A3, др. 100, HER2/neu, EGFRvIII, или фрагмент любого из них.

Данный клеточный препарат используют в способе иммунотерапии или иммунопрофилактики опухолей.

Таким образом, как следует из известного уровня техники, в медицине и фармакологии широко используют различные белково-пептидные препараты.

Так, в частности из RU 2485132, 20.06.2013 известен белково-полипептидный комплекс (БПК), обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, и фармацевтическая композиция на его основе.

БПК получен из нервной и кожной тканей эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных.

Он не использовался для лечения рака кожи.

Технической задачей заявленного изобретения является повышение эффективности профилактического лечения (профилактики) неопластических процессов кожной ткани, а также расширение арсенала средств при профилактическом лечении (профилактике) указанных заболеваний кожи с использованием указанного выше известного эмбрионального белково-полипептидного комплекса, обладающего свойствами регулятора клеточной дифференцировки и высокой общей биологической активностью.

Технический результат при решении указанной технической задачи достигается способом профилактического лечения онкологических заболеваний кожи при развитии неопластических процессов кожной ткани, таких как меланома, базалиома, плоскоклеточный рак, т.е. на разных ранних стадиях возможно развитие этих заболеваний, связанных с воздействием на кожу разных неблагоприятных факторов.

Итак, поставленная техническая задача и достигаемый технический результат достигаются заявленным способом профилактического лечения при развитии неопластических процессов кожной ткани, таких как меланома, базально-клеточный, плоскоклеточный рак, включающим использование фармацевтического препарата, включающего в качестве активного действующего вещества белково-полипептидный комплекс и фармацевтически приемлемые носители, такие как разбавитель, возможно, включающий буферный раствор, а также традиционно используемые фармацевтически приемлемые носители при составлении косметических композиций, таких как дневные и ночные кремы, гели самостоятельно или в липосомальной форме, а также в виде фотоактивных или фотозащитных композиций, ежедневно, в концентрации его 0,001-0,5 мг/мл 1-2 раза в сутки с курсовой дозой 10-20 дней не менее 4 курсов в год, при этом в качестве активного действующего вещества используют белково-полипептидный комплекс, полученный из гомогената эмбриональной нервной и кожной тканей копытных сельскохозяйственных животных и содержащий отрицательно заряженные слабокислые и нейтральные белки и полипептиды с молекулярной массой от 5 до 200 кДа и с содержанием фракции со средней молекулярной массой в пределах от 10 до 120 кДа не менее 80%, общей концентрацией белка 0,2-4,2 мг/мл, с максимумом поглощения ультрафиолетового спектра раствора при длине волны 280±5 нм, наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра, наличием специфических полос в интервале значений pl от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле.

В заявленном изобретении в качестве основного действующего вещества (биологически-активного вещества) используют известный белково-полипептидный комплекс, который представляет собой биологически-активный белково-полипептидный комплекс (далее БПК) с молекулярной массой входящих в него компонентов в пределах от 5-200 кДа и содержанием средней молекулярной фракции в пределах от 10 до 120 кДа не менее 80%, общей концентрацией белка 0,2-4,2 мг/мл, с максимумом поглощения ультрафиолетового спектра раствора при длине волны 280±5 нм, наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра, наличием специфических полос в интервале значений от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически-приемлемый носитель, например разбавитель (вода для инъекций, физиологический раствор раствор хлорида натрия), а также традиционные носители (фармацевтически приемлемые) при составлении мазей, гелей, кремов и т.д. Причем разбавитель может включать буферный раствор и вспомогательные вещества - высокомолекулярные соединения, относящиеся к классу консервантов (например, нипагин) и солюбилизаторов (например, полисорбат-80, ТВИН-10) в достаточных концентрациях. Субстанция получена путем ионообменной хроматографии фильтрата экстрагированного гомогената тканей кожи, головного и спинного мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней в присутствии буферного раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизаторов.

Используемый в заявленном изобретении биологически активный белково-полипептидный комплекс и способ его получения защищены заявителем данного изобретения и описаны в RU 2428196, 10.09.2011.

При этом в RU 2445106, 20.03.2012 заявителем данного изобретения защищена фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, гипоксического и аутоиммунного генеза, которая содержит в качестве активного действующего вещества указанный биологически активный белково-полипептидный комплекс.

Заявители заявленного изобретения в результате дополнительных исследований выявили возможность использования его в качестве активного действующего вещества в способе профилактики и профилактическом лечении при развитии неопластических и репаративных процессов кожи, онкологических заболеваний кожи, таких как меланома, базалиома (базальто-клеточный рак), плоскоклеточный рак кожи.

В результате дополнительных исследований, экспериментов заявителем была разработана схема лечения данных заболеваний с использованием указанного белково-полипептидного комплекса, обладающего определенными указанными характеристиками.

Попытки использования экстрактов эмбриональных тканей для профилактического лечения (профилактики) онкологических заболеваний вообще и кожи в частности известны с незапамятных времен. Всех их объединяет одно - выраженное противоопухолевое действие белков - факторов дифференцировки, вырабатываемых клетками эмбриональных тканей. Основная функция этих белков - при быстром и одновременном делении огромного количества клеток для активного роста организма в целом - обеспечение правильной дифференцировки клеток и их своевременный апоптоз.

Основной же чертой, характеризующей опухолевые клетки, является нарушение конечной дифференцировки и утрата способности к апоптозу.

Основными биологическими молекулами, обеспечивающими основной сигналинг эволюционно закрепленным путям развития и дифференцировки тканей в эмбриогенезе млекопитающих, являются белки и полипептиды. Получение фракций нативных белковых и полипептидных ансамблей из эмбриональных тканей является весьма трудной и дорогостоящей задачей, решение которой зависит от множества последовательных действий, требующих точного исполнения каждого пункта регламента в строго определенных условиях, так как выраженность противоопухолевого действия целевых фракций, их токсичность (аллергенность, иммунотоксичность) и стабильность непосредственно зависят от степени нативности получаемых белково-полипептидных молекул.

Наиболее оптимальным решением для сохранения нативности и стабильности факторов дифференцировки для их применения в терапии неопластических поражений кожи оказался способ получения белково-полипептидного комплекса, который позволяет получить белково-полипептидный комплекс, обладающий необходимыми свойствами, позволяющими использовать его в заявленном способе профилактики и лечения при развитии неопластических и репаративных процессов кожи, онкологических заболеваний кожи (способ получения данного белково-полипептидного комплекса и сам белково-полипептидный комплекс описаны в патенте RU 2428196, как было выше указано).

Фармацевтический препарат, как правило, выпускают в виде раствора, например, как раствор препарата 0,1 мг/мл, на основе которого готовятся фармпрепараты как в виде растворов, гелей, кремов, липосомальной эмульсии необходимых концентраций в них БПК согласно заявленному способу в фармацевтически приемлемых носителях в сочетании, при необходимости, со вспомогательными добавками (целебными добавками), традиционно используемыми в медицине, в фармацевтической (в том числе и косметической) промышленности.

Итак, согласно формуле изобретения используемый в заявленном «Способе профилактического лечения …» фармацевтический препарат может быть использован в виде фотозащитных и фотоактивных композиций, т.е. в форме фотозащитных, фотоактивных композиций (кремов, мазей, гелей, растворов и т.д.). Они содержат различные известные фотозащитные добавки, фотоактивные добавки, помимо указанного активного действующего вещества - белково-полипептидного комплекса (далее - БПК) и фармацевтически приемлемого (пригодного) носителя, традиционно используемых при приготовлении фармпрепаратов различных разбавителей, а также традиционно используемых носителей при приготовлении композиций (как фармпрепаратов в форме кремов, мазей, гелей, растворов) также различные известные фотозащитные и фотоактивные добавки, традиционно используемые в различных, например, фотозащитных (в частности, солнцезащитных) кремах, мазях и в фотоактивных композициях.

К таким фотозащитным известным добавкам относятся, в частности, различные каротиноиды, бета-каротин, витамины Е, С, эфиры салициловой кислоты, т.е. вещества (как целевые добавки), поглощающие УФ- лучи.

В частности, является общеизвестным, что фотозащитное (и противовоспалительное) действие оказывает комплекс веществ из растительных экстрактов: чая, кофе, какао, календулы, бадана, ромашки, эвкалипта; растительных масел: подсолнечного, гвоздики, лаванды, укропного, мятного и пихтового, а также экстракта прополиса, пчелиного воска, витаминов А и Е, глицерина и лимонной кислоты. Указанный комплекс веществ приводит к синергизму фотозащитного действия, обеспечивая этим высокий фотозащитный эффекте области жесткого УФ-излучения. Оптимальный светофильтрующий эффект обеспечивается в диапазоне 270-360 нм.

Общеизвестно также, что к фотоактивным композициям относятся композиции, способные под действием облучения лазерным светом самостоятельно генерировать лазерное излучение и содержащие различные фотоактивные добавки, например 3,6-диангидро-D-сорбитол (добавка СОРБ), фотосенсибилизаторы (используемые при лучевой терапии, например), в частности 5-аминолевулиновая кислота и другие известные фотосенсибилизаторы, как фотоактивные добавки.

В частности, общеизвестно, что фотоактивный препарат (композиции, используемые в частности для фотодинамического воздействия), подвергается световому облучению непосредственно перед нанесением на ткани с помощью специального устройства. В процессе этого композиция активируется, превращаясь из фотоактивной в фотоактивированную форму, приобретая новые полезные биологически активные свойства. Затем фотоактивированная композиция наносится на ткани-мишени, где и оказывает лечебное и/или косметологическое воздействие. Фотоактивная композиция (фотоактивное средство) может иметь различные жидкие и мягкие формы: истинные, коллоидные и мицеллярные растворы, гели, кремы, моно- и полидисперсные системы, эмульсии, везикулярные и липосомальные системы и т.д. В предлагаемом способе ткани подвергаются воздействию уже фотоактивированным продуктом, который находится в биологически активном состоянии.

Белково-полипептидный комплекс может быть введен совместно с другими имммуномодуляторами, супрессорами ангиогенеза, веществами, угнетающими рост опухолевых клеток, такими как полинуклеотиды ДНК и РНК, шапероны HSP 60, HSP 70, HSP 90, опухолевоспецифические пептиды из группы MAGE, такие как MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-А3, и др. 100, HER2/neu, EGFRvIII или их фрагменты; цитостатиками и другими ингибиторами опухолевого роста в эффективных дозах.

Белково-полипептидный комплекс используют в форме мази или геля с сохранением указанных концентраций, объемных соотношений, разовых и курсовых режимов дозирования. В качестве мазевой, или гелевой основы, или кремов, в том числе фотозащитных (солнцезащитных) композиций (кремов), используется гидрофильный фармацевтически приемлемый носитель (например, вазелин, ланолин, косметические воска полиэтиленгликолиь и т.д.).

Белково-полипептидный комплекс при лечении с помощью аппликаций могут использовать в виде липосомальной эмульсии, самостоятельно или в составе мази или геля, с сохранением тех же концентрационных, объемных соотношений, разовых и курсовых режимов дозирования.

При осуществлении способа введения белково-полипептидного комплекса через кожу используют метод электрофореза, фонореза, фармафореза самостоятельно или в составе липосомальной эмульсии, мази или геля с сохранением тех же концентрационных и объемных соотношений, разовых и курсовых режимов дозирования.

Антинеопластическая активность при непосредственном применении БПК или в составе фармкомпозиций, БАД (биологически-активных добавок) - проявляется в активации каскадов аппоптоза и некроза опухолевых клеток с одновременной стимуляцией процессов аутофагии. Механизмы действия комплекса были доказаны в клеточных экспериментах in vitro на клеточных линиях, в опытах с перевиваемыми опухолевыми клеточными линиями на лабораторных животных, в клинике у пациентов с базально-клеточным, плоскоклеточным раком кожи и меланомой.

Ниже представлены примеры, иллюстрирующие заявленную группу изобретений, но не ограничивающие ее.

При этом, например, указание концентрации (содержания) белково-полипептидного комплекса (БПК) в примерах не более 0,1 мг/мл означает 10 мг БПК в 100 мл, т.е. 0,01% раствор БПК (с учетом погрешности на плотность воды (как фармацевтически приемлемого носителя, разбавителя) или мазевой, гелевой и т.д. основы.

Пример 1.

Пациентка Р., 49 лет, больной себя считает около 4 месяцев.

Обратилась в поликлинику.

Statuslocalis

На коже угла глаза бляшка розового цвета d=1,5 см с геморрагической коркой в центре.

Предварительный диагноз

Базалиома угла левого глаза II ст., II кл. гр.

Был произведен соскоб с бляшки левого угла глаза. Цитология №1217/12,

заключение: базалиома.

Лечение: проводят аппликации белково-полипептидного комплекса в 50 мМ глициново-фосфатном буфере с концентрацией белка 0,1 мг/мл, и в количестве 1,5 мл непосредственно на пораженную кожу и вокруг, до 5 мм от ее края, ежедневно курсом 14 процедур, с повтором курса через 10-14 дней. Комплекс наносился на стерильную четырехслойную марлевую салфетку, предварительно кожу области очага очищали 20% спиртовым раствором.

После курса аппликаций пациентка была направлена на лечение в отделение радиолучевой терапии, по окончании лучевой терапии повторили аналогичные 2 курса аппликаций с интервалом между курсами 14 дней.

3-летнее наблюдение онкодерматолога подтвердило полную ремиссию заболевания.

Пример 2.

Пациент 34 г., в течение 3 лет наблюдает появление и увеличение в виде пятна розового образования до 1,0 см в диаметре с появлением в центре красного уплотнения.

Statuslocalis

На коже лба, по центру, ближе к волосистой части определяется плоская слегка вдавленная эрозия красного цвета, мокнущая в центре до 1,2 см в диаметре.

Предварительный диагноз

Базалиома кожи лба II ст.

Был произведен соскоб эрозии. Цитология №292/13, заключение: базалиома.

Лечение: непосредственно на область пораженной кожи и вокруг, до 5 мм от ее краев, проводилось нанесение мазевой композиции, состоящей из полиэтиленгликоля 400 и 1500 в соотношении 3:1 и белково-полипептидного комплекса в концентрации 0,1 мг/мл, 1 раз в сутки 12 дней с повтором курса через 7-10 дней, до 6 двойных курсов в год. Композиция тонким слоем наносилась на стерильную марлевую салфетку, которую фиксировали пластырем. После годового курса диаметр опухоли уменьшился до 3 мм, пациент был направлен на лечение в отделение фотодинамической терапии, где был проведен 1 сеанс с радохлорином. Через 3 недели, после снятия повязки на месте очага отмечается едва заметное пятно розового цвета, слабо отличимое от соседних участков кожи. 2-летнее наблюдение онкодерматологом подтвердило полную ремиссию заболевания.

Пример 3.

Пациент 45 лет; в течение 1 года наблюдает появление и увеличение в виде розового пятна новообразования до 1,0 см в диаметре и уплотнения.

Предварительный диагноз: меланома кожи

Профилактическое лечение проводят с использованием белково-полипептидной композиции в виде фармпрепарата, содержащего БПК в стерильном растворе (физиологический раствор - изотон7ический раствор хлорида натрия) с содержанием белка 0,001-0,05 мг/мл (0,001 мг/мл, 0,003 мг/мл, 0,04 мг/мл) исходного раствора и три 10-кратных разведенных физиологических растворах. Сразу после хирургического лечения (удаления опухоли) осуществлялось системное введение белково-полипептидного комплекса подкожными инъекциями курсами 14 дней, при содержании его в растворе (вода для инъекций) 0,2 мг, 1 раз в сутки, с перерывом между курсами 14 дней, всего 6 курсов. Операционная рана зажила первичным натяжением, швы сняты на 6-е сутки, шов мягкий, малозаметный.

2-летнее наблюдение онкодерматологом подтвердило полную ремиссию заболевания.

Пример 4.

Определение влияния БПК на рост нормальных фибробластов кожи человека (ФБЧ) и клеток меланомы В16.

Методика.

Культура клеток. Клетки меланомы В16 были получены из коллекции Института молекулярной биологии РАН. Фибробласты кожи здоровых людей (ФБЧ), которые использовали в экспериментах только на 2-8 пассажах, были получены из лаборатории биотехнологии 1-го МГМУ им. И.М. Сеченова. Культивирование клеток производили в стандартных условиях (5% CO₂, 37°C). Использовали среду DMEM и эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС) (фирмы «Gibco», США, полученные через фирму «Invitrogen», Москва).

Для определения цитотоксической противоопухолевой активности БПК клетки пассировали в 96-луночные планшеты (Costar) в 100 мкл среды с плотностью 5×10³ клеток/лунку. Клетки преинкубировали в планшетах в течение 24 часов для их адаптации перед добавлением препаратов. БПК добавляли к клеткам в диапазоне концентраций от 0,001 до 0,2 мг/мл в 4-х повторах и через 72 часа эксперимент останавливали. Количество выживших метаболически активных клеток измеряли, используя МТТ-тест. Метод основан на том, что дегидрогеназы митохондрий только метаболически активных клеток конвертируют МТТ-реактив в окрашенные кристаллы формазана. После того как к культивируемым клеткам добавляли 10 мкл 0,5%-ного раствора МТТ их инкубировали 3 часа при 37°C. Затем кристаллы формазана растворяли в 0,1 мл DMSO при встряхивании на Titramax 101. Оптическую плотность растворов измеряли на мультискане EX («Lab. System», Финляндия) при длине волны 540 нм. Количество выживших клеток рассчитывали в процентах от контроля, которым являлись клетки, культивированные без добавления препаратов L-аспарагиназ.

Проточно-цитофлуорометрический анализ клеточного цикла и определение количества апоптических клеток после обработки ФБЧ и опухолевых клеток БПК проводили по стандартному методу (Griffin С., Hamm С., McNulty J., Pandey S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on non-cancerous peripheral blood mononuclear cells // Cancer. Cell. Int. - 2010. - Vol. 10. - PP. 6. doi: 10.1186/1475-2867-10-6).

Для этого фибробласты и опухолевые клетки (0,5×10⁶) пассировали в матрасы объемом 25 см², содержащие 5 мл ростовой среды, и культивировали в стандартных условиях. Через 24 часа в среду добавляли препараты БПК. Через 72 часа после этого собирали осадок клеток для анализа в цитофлюориметре после их обработки йодистым пропидием (Sigma). Для проведения проточной цитофлюориметрии использовали цитофлюориметр FACSAria I (Becton Dickinson, США).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0. Сравнение было проведено с использованием непараметрического метода Манна-Уитни.

Результаты.

Результаты проиллюстрированы также на фигурах 1 и 2, где по оси абсцисс отложен процент (%) выживших клеток, а по оси ординат - концентрация БПК в мг в среде культивирования клеток.

На фиг. 1 представлены сведения о цитофлюорометрических исследованиях клеток фибробластов человека (ФБЧ) через 72 часа после добавления в ростовую среду используемого препарата по данному изобретению (торговое наименование «Целлекс»).

На фиг. 2 представлены сведения о цитофлюорометрических исследованиях клеток меланомы В16 через 72 часа после добавления в ростовую среду используемого препарата по данному изобретению (торговое наименование «Целлекс»).

Результаты, представленные на фиг. 1, свидетельствуют о том, что БПК, добавленный к фибробластам кожи человека, и через 72 часа не оказывает ингибирующего влияния на рост этих клеток.

В то же время, БПК через 72 часа подавляет рост клеток меланомы В16 (фиг. 2). Цитофлюорометрические исследования показали отсутствие в пробах меланомы В16 апоптических клеток через 72 часа эксперимента, вероятнее всего клетки погибали в результате некроза или аутофагии.

Пример 5.

Пациент В. 63 года. Больным себя считает несколько месяцев. Точный дебют заболевания: 30 января 2012 года. За последние несколько месяцев отмечает увеличение пигментного новообразования, появление изъязвления, эрозий (первичное обращение).

Жалобы при обращении: на наличие новообразования на коже грудной клетки, кровотечения из образования.

Statuslocalis

Первичные элементы сыпи: узел.

Локализация высыпаний: грудь.

Клинический диагноз: меланома кожи грудной клетки T2N1M0. Сразу после хирургического лечения (удаления опухоли) осуществлялось системное введение белково-полипептидного комплекса подкожными инъекциями курсами 14 дней, при содержании его в растворе (вода для инъекций) 0,2 мг, 1 раз в сутки, с перерывом между курсами 14 дней всего 6 курсов. Операционная рана зажила первичным натяжением, швы сняты на 6-е сутки, шов мягкий, малозаметный.

2-х летнее наблюдение онкодерматологом подтвердило полную ремиссию заболевания.

Пример 6.

Пациентка Л. 66 лет.

Считает себя больной 7 лет. Три года назад самостоятельно обработала очаг "кератомы", (как ей казалось) "суперчистотелом", после воспалительного изъязвления, узел разделился на два.

Statuslocalis

Локализованная сыпь. На внешней стороне правого бедра узел около 1,5 см в диаметре, неправильной формы.

Клинический диагноз: Узловая меланома правого бедра.

Гистопатологическое заключение:

Узловая меланома из эпителиоподобных клеток, с изъязвлением эпидермиса, с выраженной лимфоидной инфильтрацией, с инвазией II-III уровня по Кларку и толщиной до 2,2 мм по Бреслоу. Опухоль удалена в пределах здоровых тканей.

Сразу после хирургического лечения (удаление опухоли) осуществлялось системное введение белково-полипептидного комплекса в виде подкожных инъекций курсами 14 дней, по 0,1 мг 1 раз в сутки, с перерывом между курсами 14 дней всего 4 курса и наружное применение 0,1% БПК на область послеоперационной раны в составе стерильной гидрофильной мази из полиэтиленгликолей 400 и 1200 в соотношении 3:1, соответственно, в течение 7 дней. Операционная рана зажила первичным натяжением, швы сняты на 7-е сутки.

3-летнее наблюдение онкодерматологом подтвердило полную ремиссию заболевания.

Таким образом, как следует из приведенных примеров, изобретение обеспечивает реализацию способа профилактического лечения рака при использовании белково-полипептидного препарата с определенными характеристиками и в определенных дозировках и определенной схемы лечения, обеспечивая эффективность этих способов, что доказывает наглядно промышленную применимость заявленного изобретения.