СПОСОБ СОЗДАНИЯ РЕГЕНЕРИРУЕМОГО БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСА ФОТОННОГО КРИСТАЛЛА С АФФИННЫМИ МОЛЕКУЛАМИ

Изобретение относится к области медицины и нанотехнологии, в частности к способу создания регенеруемого биосенсора для высокочувствительной детекции биологических аналитов. Способ создания регенерируемого нанопроволочного биосенсора может применяться для производства высокочувствительных планарных биосенсоров нового типа, совместимых со стандартными флуоресцентными ридерами. Нанопроволочный биосенсор представляет собой фотонный кристалл, на поверхности которого иммобилизованы аффинные молекулы, способные специфически связываться с биологическими аналитами. Детекция аналитов с помощью биосенсора основана на формировании на поверхности нанопроволочного массива диагностического комплекса, который состоит из распознающей аффинной молекулы, аналита и детектирующей молекулы, связанной с флуоресцентной меткой. Повышение чувствительности детекции с помощью биосенсора по сравнению с известными методами основано на усилении фотолюминесцентного сигнала метки, длина волны фотолюминесценции которой находится в области резонанса фотонного кристалла. Основные требования, которым должен удовлетворять биосенсор, - это эффективное усиление фотолюминесцентного сигнала метки, а также возможность его регенерации для последующих циклов анализа.

Известен способ, включающий применение массива нанопроволок для усиления сигнала флуоресценции в биосенсоре с диэлектрической поверхностью (патент US 20080246961). Недостатком данного способа является то, что массив нанопроволок неупорядочен и помещается сверху на поверхность биосенсора, которая может представлять собой, в том числе, одномерный фотонный кристалл, который не обладает высокими показателями добротности. Кроме того, неупорядоченный массив нанопроволок, помещенный на поверхность биосенсора, препятствует свободному распространению аналита по поверхности биосенсора и эффективному связыванию целевых аналитов; возможность регенерации поверхности биосенсора также отсутствует.

Известен также способ усиления сигнала флуоресценции в биосенсоре с помощью двумерного фотонного кристалла (патент US 7768640). В данном способе фотонный кристалл формируется массивом упорядоченных отверстий на поверхности биосенсора. Аналит, содержащий флуоресцентные метки с длиной волны флуоресценции, попадающей в область резонанса фотонного кристалла, помещается на поверхность биосенсора. Для детектирования используется сигнал флуоресцирующих меток, усиленный фотонным кристаллом на длине волны резонанса за счет эффектов ближнего поля и сильного когерентного рассеяния. Этот способ выбран в качестве прототипа предложенного решения.

Основным недостатком приведенного выше способа является затрудненное проникновение аналита в глубину сенсора, а именно, в отверстия, формирующие фотонный кристалл (имеющие диаметр порядка 100 нм), что приводит к падению чувствительности биосенсора. Еще одним недостатком, следующим из формы подложки, является невозможность регенерации поверхности биосенсора для повторного использования вследствие затрудненного проникновения регенерирующего раствора вглубь фотонной структуры.

Технический результат изобретения заключается в увеличении чувствительности детекции биологических аналитов, а также в расширении возможности применения биосенсоров на основе фотонных кристаллов в лабораторной и клинической практике благодаря возможности многократного использования биосенсора, за счет регенерации его аналитической поверхности.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе создания регенерируемого биосенсора фотонный кристалл формируют в виде подложки, несущей на себе двумерный упорядоченный массив нанопроволок; поверхность подложки готовят для модификации аффинными молекулами, проводят активацию аффинными молекулами, специфичными к целевым аналитам, далее, присутствие целевых аналитов выявляют добавлением специфичных к ним детектирующих молекул, несущих на себе флуоресцентную метку выбранную таким образом, чтобы максимум флуоресценции метки совпадал по длине волны с резонансной модой фотонного кристалла, приводя к увеличению интенсивности флуоресценции метки на этой длине волны, после чего поверхность биосенсора регенерируют для повторных использований.

Существует также вариант, в котором в качестве материала исходной подложки используют пластины кремния, SiO₂. Si₃N₄, SiC.

Существует вариант, в котором нанопроволоки, формирующие фотонный кристалл, получают в результате травления подложки.

Возможен вариант, в котором нанопроволоки, формирующие фотонный кристалл, выращивают на поверхности подложки.

Возможен также вариант, в котором нанопроволоки, имеющие диаметр от 50 до 500 нм и высоту от 100 до 800 нм, располагают в узлах двумерной гексагональной решетки.

Существует вариант, в котором в массиве нанопроволок удаляют одну или несколько нанопроволок, что формирует дефект, внутри которого локализуется резонансная мода излучения.

Существует вариант, в котором поверхность подложки окисляют химически в растворах, содержащих перекись водорода и серную кислоту для создания поверхностной пленки SiO₂.

Существует вариант, в котором поверхность подложки окисляют термически, нагревая до температур от 400 до 1000°С для создания поверхностной пленки SiO₂.

Возможен вариант, в котором после окисления проводят силанизацию поверхностного слоя молекулами (3-аминопропил)триэтоксисилана, позволяющими модифицировать поверхность нанопроволочных структур функциональными группами -NH₂, и обрабатывают молекулами янтарного ангидрида - линкерами, создающими на поверхности группы -СООН.

Возможен вариант, в котором после силанизации поверхностного слоя на поверхности биосенсора иммобилизуют распознающие аффинные молекулы, способные с высокой специфичностью связывать целевой аналит.

Возможен также вариант, в котором для детекции целевого аналита на поверхности биосенсора формируют иммуноферментный комплекс, который состоит из аффинной молекулы, целевого аналита и специфичной к нему детектирующей молекулы, несущей на себе флуоресцентную метку.

Существует также вариант, в котором в качестве флуоресцентной метки используют органические красители.

Существует также вариант, в котором в качестве флуоресцентной метки используют полупроводниковые нанокристаллы.

Возможен также вариант, в котором после проведения измерений проводят регенерацию поверхности биосенсора, для повторного использования с помощью обработки регенерирующим и нейтрализующим растворами.

На фиг. 1 изображена схема изготовления поверхности подложки биосенсора, где: 1 - создание никелевой маски методом электронно-лучевой литографии; 2 - травление подложки методом реактивного ионного травления для получения массива нанопроволок; 3 - окисление поверхности; 4 - силанизация и модификация поверхности группами -СООН; 5 - иммобилизация распознающих аффинных молекул на поверхности.

На фиг. 2 изображена схема рабочего цикла биосенсора, где: 1 - блокировка неактивированной части подложки; 2 - нанесение биологического аналита; 3 - нанесение детектирующих молекул, несущих флуоресцентную метку; 4 - анализ флуоресцентного сигнала; 5 - возбуждение флуоресценции; 6 - регенерация поверхности подложки.

На фиг. 3 схематично изображен массив нанопроволок, формирующих фотонный кристалл с линейным дефектом в центре

Фотонный кристалл формируется массивом упорядоченных нанопроволок на подложке методом плазменного травления кремниевых пластин по маске, нанесенной с помощью электронно-лучевой литографии. Далее окисляют поверхность кремниевых пластин с массивами нанопроволок для создания поверхностной пленки SiO₂ (возможен вариант, в котором качестве материала для изготовления подложки используется пластина со слоем SiO₂ на поверхности, в таком случае стадия окисления поверхности не производится), проводят силанизацию этого поверхностного слоя молекулами (3-аминопропил)триэтоксисилана, позволяющими модифицировать поверхность нанопроволочных структур функциональными группами -NH₂, и обрабатывают молекулами янтарного ангидрида - линкерами, создающими на поверхности группы -СООН, необходимые для последующей иммобилизации аффинных молекул. Ковалентная иммобилизация аффинных молекул осуществляется путем образования пептидной связи между поверхностными -СООН группами и -NH₂, входящими в состав аффинных молекул.

Для детекции аналита при помощи биосенсора на поверхности сенсора формируют диагностический комплекс, состоящий из распознающей аффинной молекулы, аналита и детектирующей флуоресцентной метки. В качестве флуоресцентной метки могут быть использованы конъюгаты аффинных молекул, химически связанные с флуорофором - флуоресцентным нанокристаллом или органическим флуоресцентным красителем с длиной волны максимума флуоресценции в видимом или ИК-диапазоне. При этом максимум люминесценции метки должен совпадать по длине волны с резонансной модой фотонного кристалла для достижения усиления люминесценции. Для проведения анализа сигнала поверхность образца освещают с помощью источника излучения, спектр которого перекрывается со спектром поглощения используемых флуоресцентных меток, и производят измерение интенсивности излучения на длине волны резонанса фотонного кристалла.

После проведения анализа может быть проведена регенерация поверхности биосенсора для его повторного использования. Регенерация включает последовательную обработку биосенсора регенерирующим раствором, разрушающим диагностический комплекс на поверхности биосенсора, последующую обработку поверхности нейтрализующим раствором (для предотвращения инактивации распознающих аффинных молекул) и финальную отмывку высвободившихся компонентов комплекса раствором с физиологическим значением pH.

Приведены примеры конкретной реализации предлагаемого способа.

Пример 1

Перед проведением литографических процедур производится подготовка кремниевых пластин КДБ (100). Подготовка кремниевых пластин производится в следующей технологической последовательности: обработка пластины в HF в течение 10 минут для удаления естественного приповерхностного слоя оксида кремния, промывание пластины деионизованной водой в течение 5 мин, высушивание пластины на спин-коатере при 3000 об/мин в течение 1 мин. Нанесение резистов для проведения электронно-лучевой литографии производится методом спин-коатинга. Для этого выполняются следующие процедуры: подложка помещается на держатель и включается вакуумный прижим по обратной стороне подложки, на вращающуюся подложку при скорости 600 об/мин наносится резист PMGI SF3, скорость оборотов увеличивается до 3500 об/мин и подложка вращается на протяжении 1 мин для удаления избытка резиста, пластина с нанесенным резистом отжигается при 185°С на протяжении 30 сек. Подложка с нанесенным первым слоем резиста помещается на держатель, и включается вакуумный прижим по обратной стороне подложки; на вращающуюся подложку при скорости 600 об/мин наносится резист РММА 950 А2, включается вращение подложки с резистом при 6000 об/мин. на протяжении 1 мин, производится повторный отжиг подложки при 185°С на протяжении 60 сек. Контроль однородности полученного покрытия производится при помощи оптического микроскопа. Перед выполнением литографии в ПО прибора создается топология образца в негативном изображении. Каждая подложка биосенсора представляет собой шесть аналитических лунок диаметром 7 мм. Каждая аналитическая лунка представляет собой массив вертикальных нанопроволок высотой 800 нм и диаметром 150 нм, ориентированных в узлах гексагональной решетки с параметром 350 нм, имеющим дефект в виде ряда отсутствующих проволок в центре. Контроль качества проявления резистов проводится при помощи растрового электронного микроскопа, совмещенного с установкой электронно-лучевой литографии.

Для проведения реактивного ионного травления (РИТ) на пластину предварительно наносят стойкую в условиях РИТ позитивную маску из никеля. Для этого производят следующие процедуры: пластина с проявленным слоем резиста крепится на держателе и переносится в камеру, производится вакуумирование системы, производится термическое напыление слоя никеля толщиной 10 нм; после металлизации пластина помещается в ацетон на 60 мин для удаления металла в не защищенной резистом области (процесс "lift-off") и очистки пластины от остатка резиста РММА, для удаления остатков резиста PMGI пластина помещается в N,N-диметилформамид на 60 мин. По завершении процесса получают кремниевую пластину с нанесенной никелевой маской.

Реактивное ионное травление массива нанопроволок производится по следующей технологической последовательности: пластина с никелевой маской переносится в загрузочный шлюз установки реактивного плазменного травления SPTS LPX ICP, шлюз вакуумируется и запускается процесс травления фотонных кристаллов (Аргон 15 sccm; Кислород 10 sccm; SF₆ 85 sccm; мощность 180 Вт 10 мин). Контроль качества изготовленных массивов нанопроволок производится на растровом электронном микроскопе.

После проведения РИТ полученные кремниевые пластины очищают от загрязнений путем выдерживания в изопропиловом спирте в течение 2 часов при слабом встряхивании, затем поверхность пластин промывают двукратным погружением в свежую порцию метилового спирта. Окончательную очистку проводят путем выдерживания в деионизованной воде в течение 2 часов при слабом встряхивании.

Производится подготовка окисляющего раствора. Для этого смешивают серную кислоту, перекись водорода и деионизованную воду в объемном соотношении 1:3:6. Полученный раствор перемешивают в течение 2 минут со скоростью 600 об/мин и далее помещают в холодильную камеру при температуре +4°С.

Предварительно очищенную кремневую пластину с массивом нанопроволок погружают в раствор-окислитель и проводят окисление при слабом перемешивании течение 30 минут.

По завершении процедуры окисленную пластину промывают, опустив в деионизованную воду, при слабом перемешивании в течении 30 минут. Далее отработанную воду заменяют на новую, и процедуру отмывки повторяют.

Для функционализации поверхности окисленных нанопроволок аминогруппами производят следующую процедуру. В 15 мл н-гексана помещают (3-аминопропил)триэтоксисилан (APTES) к количестве, эквивалентном 5 мкл на каждый квадратный сантиметр поверхности; полученный раствор перемешивают на вортексе в течение 10 минут. Далее окисленную кремневую пластину помещают в полученный раствор и производят перемешивание на лабораторном шейкере в течение 12 часов.

По завершении процедуры пластину выдерживают в чистом хлороформе в течение 15 минут, далее операцию повторяют 2 раза с заменой хлороформа.

Окончательную функционализацию поверхности кремниевых нанопроволок проводят следующим образом. Готовят раствор янтарного ангидрида (ЯА) в N,N-диметилформамиде в количестве, эквивалентном введенному ранее APTES. В полученный раствор помещают кремниевую пластину, прошедшую стадию обработки APTES, и производят перемешивание реакционного раствора на шейкере в течение 30 мин.

Обработанную пластину выдерживают в чистом хлороформе в течение 15 минут, далее операцию повторяют 2 раза заменой хлороформа.

Для иммобилизации распознающих аффинных молекул на поверхности нанопроволок проводят следующие процедуры: на поверхность пластины площадью 1 см² наносят по 100 мкл водного раствора активирующих агентов 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и сульфо-N-гидроксисукцинимида (EDC + Sulfo-NHS) с концентрацией 1-50 мг/мл и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, по окончании активации пластину отмывают от избытка активирующих агентов с помощью натрий-фосфатного буфера, рН 7,2). Для этого пластину помещают в емкость, заполненную PBS, и инкубируют в течение 5 минут в режиме покачивания на шейкере. Процедуру отмывки повторяют 3 раза, затем на поверхность пластины наносят по 100 мкл раствора распознающих аффинных молекул, растворенных предварительно в PBS до концентрации 0,000001-1 мг/мл. Реакцию инкубируют в течение ночи на +4°С, на следующий день массивы троекратно отмывают от избытка несвязавшихся аффинных молекул с помощью натрий-фосфатного буфера, рН 7,2 и инкубируют в блокирующем растворе (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4 (PBS) с добавлением 0.5% бычьего сывороточного альбумина, BSA) в течение 2 часов при комнатной температуре.

Пример 2

Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, однако процесс окисления пластин кремния производят термически в печи в атмосфере кислорода при температуре 800°С в течение 10 минут, плавно повышая температуру с комнатной до 800°С в течение 5 минут, также плавно понижая после проведения процедуры окисления.

Пример 3

Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, однако дефект фотонного кристалла представляет собой от 1 до 11 отсутствующих проволок в центральном ряду. Получают локализацию излучения меток в данной области.

Пример 4

Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, однако после измерения флуоресцентного сигнала меток проводят регенерацию биосенсора для его последующего использования по следующей процедуре. Готовят 500 мл 0,1 М буферного раствора Tris-HCl (нейтрализующий раствор). Для этого в мерную колбу на 500 мл помещают 6,05 г Trizma® base BioUltra, добавляют 400 мл воды степени чистоты MilliQ. Перемешивают до полного растворения кристаллов и титруют раствор 0,1 М HCl до рН 8,5. Доводят объем водой до 500 мл. Готовят 500 мл 0,1 М буферного раствора глицин-HCl, рН 2,8 (регенерирующий раствор). Для этого в мерную колбу на 500 мл помещают 2.85 г глицина, добавляют 400 мл воды степени чистоты MilliQ. Перемешивают до полного растворения кристаллов и далее титруют раствор 0,1 М HCl до рН 2,8. Доводят объем водой до 500 мл. На поверхность биосенсора, с иммобилизованным на его поверхности диагностическим комплексом, наносят 200 мкл регенерирующего раствора, инкубируют в течение 5-10 минут в режиме покачивания на шейкере. Удаляют регенерирующий раствор и наносят 200 мкл нейтрализующего раствора. Инкубируют в течение 5 минут в режиме покачивания на шейкере. Удаляют нейтрализующий буфер и наносят 200 мкл PBS, инкубируют в течение 5 минут в режиме покачивания. Повторяют процедуру отмывки 3 раза. Для оценки степени регенерации измеряют флуоресценцию сенсора при длине волны испускания флуорофоров, входящих в состав иммунодиагностического комплекса.

Таким образом, из описания видно, что данный способ расширит возможности применения биосенсоров на основе фотонных кристаллов в лабораторной и клинической практике благодаря возможности многократного использования, за счет регенерации аналитической поверхности, а также повысит аналитическую чувствительность детекции биологических аналитов.