4-[(4-Ацетоксибензоил)амино]бутират лития, обладающий церебропротективным действием

Оптимизация лечения нейродегенеративных заболеваний - одна из актуальных проблем медицины, значимость которой обусловлена широкой распространенностью, высоким процентом смертности и инвалидности пациентов [С.А. Живолупов, И.Н. Самарцев, Т.В. Бодрова. Теоретические и практические аспекты терапии и профилактики острых нарушений мозгового кровообращения /Журнал неврологии и психиатрии, 3, 2014; Вып. 2, 2014; 37-42].

Важная физиологическая роль гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК, CAS 56-12-2, аминалон, гаммалон) в регуляции функциональной активности ЦНС определяет перспективность создания на ее основе нейропсихотропных лекарственных средств. Однако в силу ряда физико-химических свойств препараты, в частности ГАМК, обладают низкой биодоступностью, что является причиной их невысокой эффективности. Низкая биодоступность незамещенных аминокислот, в том числе, линейной ГАМК, объясняется их высокой полярностью - при физиологических значениях pH такие вещества существуют в виде биполярных ионов, вследствие чего плохо проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). На сегодняшний день в медицинской практике успешно применяются линейные аналоги ГАМК: γ-амино-β-фенилмасляная кислота (CAS 1078-21-3, фенибут) как ноотропный препарат и транквилизатор, γ-амино-β-(n-хлорфенил)масляная кислота (баклофен) как центральный миорелаксант, N-никотиноил-γ-аминомасляная кислота (пикамилон) как ноотроп и средство, улучшающее мозговое кровообращение и др. Широко используются и циклические аналоги ГАМК: 2-оксо-1-пирролидинацетамид (пирацетам) - родоначальник группы ноотропов, N-карбамоил-метил-4-фенил-2-пирролидон (фенотропил) - ноотроп с нейропротекторным и нейромодулирующим действием [Сравнительное экспериментальное изучение ноотропных свойств аналога ГАМК фенибута и его метилового эфира / Багметова В.В., Бородкина Л.Е., Тюренков И.Н., Берестовицкая В.М., Васильева О.С.// Фундаментальные исследования. - 2011. - №10 (часть 3). - стр. 467-471] и др. Одним их эталонных лекарственных препаратов является ʺМексидолʺ (этилметилгидроксипиридина сукцинат), который проявляет ноотропную, нейропротекторную, анксиолитическую, противогипоксическую, антистрессорную, антиалкогольную, противопаркинсоническую и противосудорожную активность и др. Установлена его эффективность при атеротромботическом и кардиоэмболическом вариантах только в дозе от 300 мг в сутки в течение 14 дней [Скворцова В.И., Стаховская Л.В., Шамалов Н.А. Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование эффективности и безопасности мексидола в комплексной терапии ишемического инсульта в остром периоде. Инсульт 2006; 18: 47-54].

Психоневрологические последствия цереброваскулярных нарушений охватывают довольно широкий спектр эмоциональных и когнитивных расстройств, проявление которых имеет исключительно важное значение для клинической оценки результатов лечения инсульта [Truelsen Т., Bonita R., Adv. Neurol, v. 92, pp. 1-12, 2003].

Целью изобретения является синтез водорастворимого производного ГАМК - 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутирата лития и его применение для лечения и профилактики хронической ишемии мозга. Из аналогов известен 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]ацетат лития (RU 2505294), обладающий транквилизирующим и ноотропным действием. О церебропротективном действии 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]ацетат лития не сообщалось.

В настоящее время 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутановая кислота в международных базах химических веществ не зарегистрирована и в медицине в качестве лечебного препарата не применяется.

Пример 1. 4-[(4-гидроксибензоил)амино]бутановая кислота может быть получена по известной методике [RU 2495867]. В реактор, снабженный мешалкой, помещают ГАМК и 50 мл ДМФА. По каплям приливают хлорангидрид 4-гидроксибензойной кислоты в течение 60-90 мин. Реакцию проводят при охлаждении. Затем полученную реакционную смесь перемешивают еще 2,5 часа (при охлаждении), контролируя pH среды (pH>7). Для поддержания среды добавляют 6 н водный раствор гидроксида натрия. Полученную смесь выливают в лед и подкисляют хлороводородной кислотой до pH 5, выпавшие белые кристаллы 4-[N-(3-гидроксибензоил)амино]бутановой кислоты отфильтровывают и сушат. Выход 93%. Тпл=231-234°С, Rf 0.846 (бутанол-1). М+ 223 (хроматомассспектрометр «Saturn-2100», Varian).

Затем соединение были проацетилировано. Например [US 5196502], в круглодонном реакторе с мешалкой смешиваются 4-[(4-гидроксибензоил)амино]бутановая кислота (100 ммол), уксусный ангидрид (200 ммол) и 0.2 мл серной кислоты. Температура реакционной смеси повышается с 25°С до 75°С, при этом раствор становится прозрачным. Реакционную массу перемешивают при этой температуре еще 20 мин и оставляют остывать. Затем содержимое реактора выливают в холодную воду. Через 2 часа выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают водой и сушат. Получают новое соединение (4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутановая кислота) в виде белых кристаллов с Тпл. 195-197°С (выход 76%). 1Н ЯМР (DMSO-d, 500 MHz) δ: 7.182-7.789 (м, 4Н, Ph), 8.35 (с, 1Н, NH), 1.589-3.165 (м, 6 Н, С₃Н₆), 2.285 (с, 3Н, С(O)СН₃). Найдено (%): С, 55.78; Н, 4.69; N, 5.27. Вычислено (C₁₃H₁₅NO₅) (%): С, 58.86; Н, 5.70; N, 5.28. ESI-MS, m/z. 265 [М]⁺. Литиевая соль была синтезирована действием безводного гидроксида лития в бензоле.

Пример 2. Влияние 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутирата лития на выживаемость и психоневрологический дефицит при необратимой одномоментной окклюзии общих сонных артерий у крыс. Экспериментальное исследование влияния профилактического и лечебного введения 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутирата лития при билатеральной окклюзии общих сонных артерий выполнено на беспородных крысах-самцах 180-200 г., 3,5-4-х месячного возраста. Экспериментальные животные содержались в условиях стандартного вивария с соблюдением всех правил лабораторной практики (животные получены из питомника ФГУП "НИИ ГТП" ФМБА России) и свободным доступом к воде и пище. Экспериментальная модель неполной ишемии головного мозга воспроизводилась путем одномоментной двусторонней перевязки общих сонных артерий (ОСА) [Мирзоян Р.С. Методические рекомендации по доклиническому изучению лекарственных средств для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени //Руководство по доклиническому изучению лекарственных средств / Под. ред. А.Н. Миронова. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.].

Оценка влияния 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутирата лития на выживаемость и степень неврологического дефицита животных после неполной ишемии головного мозга оценивалась у следующих групп животных сформированных по принципу рандомизации:

1) ЛО (ложнооперированные) крысы - животным этой экспериментальной группы после подведения под общие сонные артерии лигатуры не затягивались, т.е. кровоток в бассейне общих сонных артерий не изменялся;

2) контроль-ишемия - экспериментальная группа животных, которым необратимо перевязывались сонные артерии и в качестве «лечения» эти животные получали дистиллированную воду;

3) ишемия + 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутират лития - экспериментальная группа животных, которым необратимо перевязывались сонные артерии и в качестве лечения эти животные получали 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутират лития в дозе 9 мг/кг;

4) ишемия + мексидол - экспериментальная группа животных, которым необратимо перевязывались сонные артерии и в качестве лечения эти животные получали мексидол в дозе 250 мг/кг;

5) ишемия + глицин - экспериментальная группа животных, которым необратимо перевязывались сонные артерии и в качестве лечения эти животные получали глицин в дозе 10 мг/кг.

6) ишемия + фенибут - экспериментальная группа животных, которым необратимо перевязывались сонные артерии и в качестве лечения эти животные получали фенибут в дозе 25 мг/кг.

Каждая группа состояла из 20 крыс за исключением контрольной группы, которая состояла из 30. Введение животным 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутирата лития /мексидола/глицина/фенибута/дистиллированной воды проводили за 30 минут до наложения перевязки артерий и через 2 часа после начала операции. Количество выживших животных регистрировали через 6, 12, 24, 48 и 72 часа после операции перевязки артерий. Неврологический дефицит оценивали в баллах по шкале McGrow в модификации Ганнушкиной И.В. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel и BioStat 2008 5.2.5.0. с использованием критерия Манна-Уитни, точного критерия Фишера.

Поведение и когнитивные функции животных определяли в стандартных психоневрологических тестах: «Открытое поле», «Условная реакция пассивного избегания» (УРПИ).

В тесте «открытое поле» (ОП) (Хаунина Р.А., Лапин И.П. 1976 г., Воронина Т.А. 1982) изучают поведение грызунов в новых условиях. Животное помещается в центр круглой белой арены хвостом к экспериментатору, затем экспериментатор в течение 3-х минут наблюдает за поведением животного в установке, фиксируя число актов указывающих на двигательную или исследовательскую активность, признаки тревожного или депрессивного поведения. При этом об ориентировочно-исследовательской активности судят по сумме стоек и заглядываний в отверстия, а по количеству пересеченных секторов - о спонтанной двигательной активности.

Методика оценки условного рефлекса пассивного избегания» (УРПИ) позволяет выявить специфическую ноотропную активность веществ и используется для оценки влияния веществ на формирование, сохранение и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения. Данная методика выполнялась следующим образом:

1) Этап формирования рефлекса пассивного избегания - крысу помещали в освещенный отсек (лампа мощность 100 Вт) в центральную зону, хвостом к отверстию в темный отсек, обследовав светлый отсек крыса переходила в темный, через электрический пол которого подавался ток 40В, 3 импульса по 1 с, с интервалом 0,5 с, тем сам животные получало электроболевое раздражение. За животным наблюдали в течение 3-х минут, если оно вновь заходило в темный отсек электроболевое раздражение наносили повторно, крысы которые не заходили - из эксперимента исключались. Фиксировались следующие показатели: латентный период (ЛП) первого захода в темный отсек (время от момента помещения животного в середину площадки до первого захода в темный отсек) и количество заходов в него.

2) Этап контроля выработки рефлекса - все животные повторно не должны заходить в темный отсек установки, зашедшие животные исключались из эксперимента.

3) Этап воспроизведения навыка пассивного избегания - на данном этапе в отличие от этапа обучения, если животное заходило в темный отсек, то электроболевое раздражение не наносили. Регистрировались аналогичные показатели, что и при обучении плюс общее время, проведенное в темном отсеке.

«Тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ) используют для изучения когнитивных функций грызунов в условиях аверсивной среды, он позволяет оценить: индивидуальные различия когнитивного стиля решения задачи (поиска пути активного избавления из аверсивной среды). Фиксировался ЛП подныривания (время от момента погружения животного в воду до подныривания под края цилиндра). Также как и тест УРПИ методика включает в себя этап обучения навыка (выработка рефлекса избавления) и этапа его воспроизведения через 24 часа. Животные, не решающие задачу за время наблюдения на этапе обучения, исключаются из опыта.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel и BioStat 2008 5.2.5.0. с использованием критерия Манна-Уитни, точного критерия Фишера.

Результаты исследования

Установлено, что при перевязке общих сонных артерий у экспериментальных животных к 72-му часу показатель летальности был достоверно ниже у тех животных, которые получали 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутират лития по отношению к группе животных контроль-ишемия (таблица 1). Оказываемое им церебропротективное действие превосходило таковое у мексидола, глицина и фенибута.

При оценке неврологического дефицита у животных с экспериментально вызванной ишемий головного мозга установлено, что введение 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутирата лития достоверно препятствовало нарастанию у крыс неврологической симптоматики, что выражалось в снижении балла по шкале неврологического дефицита McGrow (таблица 2). Неврологические отклонения через 72 часа после моделирования патологии были отмечены у животных, получавших 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутират лития в дозе 9 мг/кг, были наименьшими среди всех экспериментальных групп.

Патентуемое соединение в дозе 9 мг/кг препятствовало нарушению локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности животных и снижало выраженность постишемической амнезии (таблица 3).

При оценке поведения животных через 72 часа после ОСА двигательная активность животных контрольной группы в тесте «ОП» была снижена относительно двигательной активности группы ложнооперированных животных практически во всех исследуемых группах (рис. 1, 2). У животных, получавших до и после ОСА патентуемое соединение и препараты сравнения, показатели двигательной и исследовательской активности были выше контрольной группы животных. Соединение 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутират лития наиболее значимо повышало двигательную и исследовательскую активности (рис. 1).

В тестах УРПИ и ТЭИ, позволяющих оценить когнитивную функцию животных, их обучаемость, формирование, сохранение и воспроизведение у них памятного следа, установлено увеличение латентного периода решения экстраполяционной задачи в ТЭИ и уменьшении латентного периода захода в темный отсек в тесте УРПИ в группах ишемизированных животных, по сравнению с ложнооперированными (рис. 2).

У животных, получавших 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутират лития в ТЭИ выявлено, что латентный период решения задачи экстраполяционного избавления был статистически значимо меньше, а период захода в темный отсек в тесте УРПИ значимо больше, чем у животных контрольной группы (рис. 2).

Таким образом, учитывая, что 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутират лития увеличивает выживаемость животных и снижает выраженность неврологических нарушений после перевязки сонных артерий, заявленное соединение может найти применение при создании новых лекарственных средств, для лечения заболеваний ЦНС сосудистого, травматического, токсического, гипоксического генеза.

Пример 3. Определение острой токсичности. Острую суточную токсичность при однократном введении изучали на мышах-самцах массой 20-24 г. Соединение в дистиллированной воде вводили животным внутрибрюшинно в различных возрастающих дозах однократно. Наблюдение за животными проводили в течение суток, отмечая количество погибших животных. Расчет LD₅₀ проводили методом пробит анализа. Исследования острой токсичности показали, что по классификации токсичности веществ 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутират лития при введении в брюшную полость животных (К.К. Сидорова, 1973) заявляемое вещество относится к классу малотоксичных (таблица 3). Терапевтический индекс патентуемого соединения, обладающего церебропротективным действием в сочетании с ноотропной и анксиолитической активностью, в 4,5 раза выше, чем у фенибута и в 31 раза выше, чем у мексидола.