Результат интеллектуальной деятельности: Композиция для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к системам на основе микроорганизмов, иммобилизованных в матрицу синтетического носителя.

Известна полимерная композиция для иммобилизации микроорганизмов на основе криогеля поливинилового спирта (ПВС). Криогели ПВС образуются при замораживании 10-20%-ных водных растворов при (-18) – (-22)°C в течение 16-48 ч и последующем оттаивании при 4-20°C. [Патент РФ 2315102 Иммобилизованный биокатализатор для биологической очистки жиросодержащих сточных вод и способ его получения]. Иммобилизованные в данной композиции микроорганизмы мало пригодны для применения в качестве рецепторных элементов биосенсорных анализаторов, так как в виде тонких пленок криогель ПВС обладает очень низкой механической прочностью.

Известна сшивка ПВС с помощью сульфата натрия в присутствии борной кислоты. Иммобилизация микроорганизмов происходит одновременно со сшивкой ПВС. Готовят раствор А: 10%-ный раствор ПВС, для этого 10 г ПВС растворяют в 90 мл воды и нагревают до температуры 80°C, после растворения ПВС сразу же приливают 20 мл 1%-ного раствора альгината натрия и охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения ПВС-альгинатного раствора, добавляют 10%-ный активный ил. Одновременно с раствором А готовят раствор В: к 500 мл насыщенного 7%-ного раствора Н₃ВО₃ прибавляли 2-5%-ный раствор CaCl₂. Затем раствор А погружали в раствор В на 1 ч. При этом формировались ПВС-боратные гранулы. Гранулы промывали и хранили при 4°C в дистиллированной воде. ПВА-сульфатные гранулы (группа S) были подготовлены путем переноса гранулы (группа В) в 0,5 м раствор Na₂SO₄ погружая их на 1 ч. Гранулы промывали и хранили при 4°C в дистиллированной воде. [Leu Tho Bach, Pham Van Dinh. Immobilized bacteria by using PVA (Polyvinyl alcohol) crosslinked with Sodium sulfate // International Journal of Science and Engineering (IJSE). 2014. V. 7(1). P. 41-47] Недостатком методики является губительное воздействие борной кислоты, многокомпонентность смесей и трудоемкий процесс приготовления гидрогеля.

Наиболее близкой к заявленному техническому решению, принятой за прототип, является полимерная композиция для иммобилизации микроорганизмов на основе ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном [Пат. РФ №2461625, МПК⁸ C12N 11/04; C08F 216/06 от 30.12.2010 г. Композиция для получения полимерной пленки для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах]. Полимерную композицию получают из поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном. Модификацию проводят в токе азота в присутствии нитрата церия-аммония в качестве катализатора при мольном соотношении реагентов ПВС : N-ВП : катализатор - 239:(9,0-56,2):(0,7-6,0). Для приготовления рецепторных элементов биосенсора полученный раствор композиции для получения полимерной пленки смешивают с бактериальными клетками и высушивают в течение 2 ч при 20°C.

К недостаткам изобретения можно отнести то, что при модификации с использованием N-ВП помимо сшивки цепей ПВС возможны реакции с образованием разветвленного полимера, который растворим в воде. В результате в процессе эксплуатации гидрогеля с иммобилизованными микроорганизмами часть биоматериала вымывается. Исключение из композиции N-ВП является экономически обоснованным, так как приводит к удешевлению используемого носителя.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение точности и чувствительности анализа с использованием биосенсора путем получения сшитого поливинилового спирта, обеспечивающего образования нерастворимого в воде гидрогеля для иммобилизации микроорганизмов.

Технический результат, который может быть получен при использовании заявляемой композиции для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов, заключается в том, что полученные тонкие, эластичные пленки, набухающие в воде с образованием гидрогеля, могут быть использованы для иммобилизации микроорганизмов при создании рецепторных элементов биосенсорных анализаторов.

Сущность технического решения заключается в том, что композиция для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах состоит из полимера на основе поливинилового спирта, полученного окислительной сшивкой под действием ионов церия (IV), при этом исходные компоненты взяты в мольном соотношении ПВС:(NH₄)₂Се(NO₃)₆ 160-110:1-1,3.

На фиг. 1 представлен механизм сшивки ПВС с участием и ионов Се⁺⁴ в качестве инициатора, приводящий к образованию сетчатого полимера, впоследствии из которого формируются тонкие полимерные пленки, способные набухать в водных растворах, образуя гидрогель.

В таблице 1 приведены характеристики биосенсора, иммобилизованные в представленную композицию для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов дрожжей Debaryamyces hansenii при анализе глюкозы и этанола.

Для приготовления композиции для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов к 20 мл 5%-ного водного раствора ПВС (м.м. 78000±1000) прибавляли 0,8 мл водного раствора нитрата церия-аммония (NH₄)₂Ce(NO₃)₆ (Т=0,1 г/мл) при постоянном перемешивании. Перемешивание проводят при температуре 55°C в атмосфере азота в течение 3 ч.

При приготовлении композиции для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов не требуется приготовления многокомпонентных смесей, использования борной кислоты, губительно действующей на микроорганизмы, что позволяет упростить процедуру иммобилизации и избежать потери чувствительности биорецепторных элементов вследствие низких значений рН, губительно действующих на микроорганизмы. Введение биоматериала после синтеза полимера способствует увеличению продолжительности дыхательной активности микроорганизмов. Полученную с использованием описанной методики композицию для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов используют в работе в качестве рецептора на кислородном электроде.

Пример

Для приготовления композиции для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов, к 20 мл 5%-ного водного раствора ПВС марки 16/1 (молярная масса 78000±1000, пр-во Россия) прибавляли 0,8-1,2 мл водного раствора нитрата церия-аммония (NH₄)₂Ce(NO₃)₆ (T=0,l г/мл) при постоянном перемешивании. Перемешивание проводили при 50-60°C в атмосфере азота в течение 3 ч.

Для иммобилизации дрожжей Debaryamyces hansenii ВКМ Y-2482 раствор композиции для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта охлаждали до комнатной температуры, отбирали необходимое количество микропипеткой и добавляли в него дрожжевые клетки Debaryamyces hansenii ВКМ Y-2482 (20 мг биомассы на 100 мкл раствора полимера). Для равномерного распределения клеток в полимере проводили встряхивание в течение 5 мин на центрифуге «Sky Line». 200 мкл полученной смеси переносили в блистерную упаковку с диаметром ячеек 6-7 мм и высушивали на воздухе до полного высыхания в течение 2-4 ч. Полученную композицию для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта, хранили в холодильнике (+4°C) в сухом виде или в фосфатно-цитратном буферном растворе (рН 6,0).

Кислородный электрод с размещенным на нем биорецептором погружали в измерительную ячейку объемом 3 мл, содержащей фосфатно-цитратный буферный раствор (рН 6,0), и регистрировали содержание кислорода в кювете при добавлении разных концентраций определяемых веществ.

Таким образом, разработанная композиция для получения гидрогеля на основе поливинилового спирта для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах обеспечивает высокую чувствительность биосенсора при стабильной работе до 46 суток.