Результат интеллектуальной деятельности: Сбор лекарственных растений антиоксидантного действия

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической фармакологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции свободнорадикальных нарушений, и касается сборов, обладающих антиоксидантным действием, получаемых из растительного сырья.

Синтетические лекарственные средства, используемые для лечения этих заболеваний, по своей терапевтической эффективности не всегда удовлетворяют требованиям клинической фармакологии, прежде всего в связи с наличием ряда побочных эффектов: тошнота, рвота, диарея, утомляемость, бессонница, повышение артериального давления, нарушения сердечного ритма, сухость и депигментация кожи, ухудшение заживления ран, потенцирование коагулопатии при недостаточности витамина К, снижение фагоцитарной активности макрофагов, тромбофлебиты, тромбоэмболии, креатинурия, образование камней в почках, гинекомастия, что ограничивает их применение, особо в условиях трудовой деятельности [1, 2]. Известные лекарственные средства, обладающие антиоксидантным действием, - дигидрокверцетин, витамины (аскорбиновая кислота, токоферола ацетат, ретинола ацетат), их аналоги и др. [1, 2], имеют недостаточно высокую терапевтическую эффективность по своей способности ингибировать свободнорадикальное окисление на разных стадиях процесса при терапии патологий, сопровождающихся нарушением баланса взаимоотношений систем свободнорадикального окисления и общей антиоксидантной активности в организме. Сборы лекарственных растений могут сыграть существенную роль в решении данной проблемы. Применение сборов отличается комплексным эффектом воздействия, сохранением нативности биологически активных веществ и, как следствие, выраженным фармакологическим эффектом, а также простотой применения.

Адекватного прототипа в литературе не обнаружено.

Известно использование растительного сбора «Эуфразин» [3], обладающего антиоксидантной и ноотропной активностью и содержащего плоды черники обыкновенной, траву очанки гребенчатой, цветки лабазника вязолистного, траву мелиссы лекарственной, плоды шиповника коричного при соотношении компонентов сбора в частях соответственно 2:3:2:1:2 (препарат сравнения). Однако указанный растительный сбор недостаточно эффективен ввиду низкой способности ингибировать свободнорадикальное окисление на разных стадиях процесса при терапии патологий, сопровождающихся дисбалансом в системах свободнорадикального окисления и общей антиоксидантной активности организма, а также слабости гепатопротекторного действия, адаптогенного и иммунотропного эффектов.

Техническим результатом данного изобретения является расширение арсенала средств растительного происхождения для защиты организма от свободных радикалов, обладающих антиоксидантным действием.

Технический результат достигается благодаря применению в качестве сбора лекарственных растений, обладающего антиоксидантным действием, состава при следующем соотношении компонентов, %: побеги княжика сибирского (60-40), зеленые листья бадана толстолистного (30-40) и трава лабазника вязолистного (10-20).

Новым является то, что впервые в качестве сбора лекарственных растений, обладающего антиоксидантным действием, используют состав, содержащий побеги княжика сибирского, зеленые листья бадана толстолистного и траву лабазника вязолистного.

Сбор получают путем механического смешивания предварительно высушенных и измельченных побегов княжика сибирского, зеленых листьев бадана толстолистного и травы лабазника вязолистного. Траву, побеги и листья измельчали до частиц размером не более 5 мм. Во всех случаях измельченную пыль отсеивали сквозь сито с диаметром отверстий 0,18-0,2 мм.

Добавленные в сбор компоненты имеют следующие характеристики:

1. Побеги княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) содержат фенолоспирты (3,4-дигидроксифенилэтанол-2, 2-(3,4-дигидроксифенил)-этил-O-β-D-глюкопиранозид), флавоноиды (кемпферол, кверцетин, изокверцитрин), кумарины (скополетин, эскулетин, эскулин, умбеллиферон, скиммин), органические кислоты (кофейная, хлорогеновая, хинная), гидролизуемые и конденсированные дубильные вещества, алкалоиды (следовые количества аконитина, дельфинина), тритерпеновые сапонины (олеаноловая кислота, хедерагенин, витальбозид А), стерины (β-ситостерин и его глюкозид), водорастоворимые полисахариды, каротиноиды, аминокислоты (пролин, треонин, валин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, гистидин, триптофан, аргинин), что обеспечивает выраженное антиоксидантное и антирадикальное, противоишемическое, ноотропное, анксиолитическое, антистрессорное, адаптогенное, иммунотропное действие.

2. Зеленые листья бадана толстолистного (Bergenia crassifolia (L.) Fritsch.) содержат простые фенолы (гидрохинон, арбутин), флавоноиды (кверцетин, кемпферол, апигенин, лютеолин, таксифолин, изокверцитрин, рутин), фенолкарбоновые кислоты (галловая, гентизиновая, кофейная, феруловая, хлорогеновая), кумарины (бергенин, эскулетин), гидролизуемые и конденсированные дубильные вещества, полисахариды, каротиноиды, аминокислоты, что обуславливает выраженную антигипоксическую, антиоксидантную, адаптогенную активности, способствует эффективному улучшению процесса обучения и памяти в норме, а также при различных патологических состояниях.

3. Трава лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.) содержит простые фенолы (спиреин, монотропитин, рододендрол, салигенин, салицин, изосалицин), флавоноиды (кверцетин, кемпферол, апигенин, лютеолин, таксифолин, изокверцитрин, авикулярин, гиперозид, спиреозид, 4'-O-b-D-галактопиранозид кверцетина, рутин), органические кислоты (бензойная, салициловая, м-гидроксибензойная, анисовая, ванилиновая, гентизиновая, галловая, п-кумаровая, кофейная, хлорогеновая, феруловая, хинная), дубильные вещества (гидролизуемые, в т.ч. эллаговая кислота), тритерпеновые соединения (урсоловая, олеаноловая кислоты), амины, аминокислоты (валин, глутаминовая кислота, гистидин) и неорганические компоненты, таким образом, улучшает интегративные показатели мозговой деятельности в норме и при патологии (гипоксическая травма, ишемия), обладает антиоксидантным, антистрессорным, адаптогенным, ноотропным, анксиолитическим, гепатопротекторным и иммунотропным действием. Использование данного компонента позволяет избегать некоторых побочных эффектов синтетических антиоксидантов (беспокойство, нарушение сна, головокружение, диспептические расстройства, изменение картины крови и состояния внутренних органов).

Следовательно, заявляемый сбор увеличивает устойчивость организма к воздействию повреждающих факторов (гипоксия, ишемия, интоксикация, травма, стресс и др.), повышает адаптацию организма наряду с гепатопротекторным и иммунотропным эффектами.

В литературе отсутствуют данные о применении в качестве сбора лекарственных растений, обладающего антиоксидантным действием, состава, содержащего побеги княжика сибирского, зеленые листья бадана толстолистного и траву лабазника вязолистного.

Компоненты и их содержание подобраны экспериментально. Использование побегов княжика сибирского, зеленых листьев бадана толстолистного и травы лабазника вязолистного в составе сбора по предлагаемому назначению стало возможным благодаря выявлению экспериментально его новых свойств, а именно способности нормализовать дисбаланс взаимоотношений процесса свободнорадикального окисления и общей антиоксидантной системы организма за счет антиоксидантного действия.

Новый сбор, содержащий побеги княжика сибирского (60-40), зеленые листья бадана толстолистного (30-40) и траву лабазника вязолистного (10-20), проявил в результате проведенного экспериментального изучения антиоксидантное действие.

Новые свойства и состав сбора явным образом не вытекают из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Впервые установлено, что в качестве сбора лекарственных растений, обладающего антиоксидантным действием, можно использовать состав, содержащий побеги княжика сибирского, зеленые листья бадана толстолистного и траву лабазника вязолистного.

Идентичной совокупности лекарственных растений не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе.

Предлагаемый сбор лекарственных растений с успехом может быть использован в практическом здравоохранении для коррекции заболеваний, сопровождающихся нарушением свободнорадикальных процессов.

Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания.

Пример 1. Побеги княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.), зеленые листья бадана толстолистного (Bergenia crassifolia (L.) Fritsch.), траву лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.), высушенные воздушным способом, измельчают до мелкодисперсного порошка (влажность 8,5%) (ПС).

Пример 2. Приготовление отвара осуществляют следующим образом: 10,0 г сбора заливают 120 мл воды (1:10, с учетом коэффициента водопоглощения), нагревают на кипящей водяной бане 30 мин, процеживают горячим, отжимают сырье, после охлаждения доводят объем полученного отвара водой до 100 мл (ОС).

Пример 3. Приготовление настоя осуществляют следующим образом: 10,0 г сбора заливают 120 мл воды (1:10, с учетом коэффициента водопоглощения), нагревают на кипящей водяной бане 15 мин, процеживают горячим, отжимают сырье, после охлаждения доводят объем полученного отвара водой до 100 мл (НС).

Фармакологические исследования выполнены на 72 аутбредных мышах-самцах CD-I (I категории, согласно сертификату) массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга» (Томск). Эксперименты осуществляли в зимний период. Работы в рамках экспериментальных методик выполняли с 9 до 15 ч. Животных содержали в стандартных условиях вивария на обычном рационе кормления (за исключением тех случаев, где иные условия оговариваются особо) в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (г. Страсбург, 1986).

Фармакологические эффекты нового сбора, содержащего побеги княжика сибирского, зеленые листья бадана толстолистного и траву лабазника вязолистного, оценивали по влиянию на показатель антиоксидантной активности в реакции с ДФПГ и содержание ТБК-активных продуктов в гомогенате головного мозга у мышей после гипоксического воздействия, моделируемого в условиях методики гипоксии гермообъема [4]. Животных умерщвляли в CO₂-камере, извлекали мозг и помещали его в 2 мл физиологического раствора, содержащего трис-HCl буфер (pH 7,4). Далее мозг взвешивали и гомогенизировали в 9,0 мл среды, имеющей состав: 0,175 М KCl, 0,025 М трис-HCl буфер (pH 7,4), предварительно охлажденной до температуры 2°C. Процедуру осуществляли вручную в пластмассовом гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Стакан гомогенизатора был погружен в ледяную баню. Полученный гомогенат центрифугировали в рефрижераторной центрифуге «Biofuge Primo R» при 600 g в течение 10 мин и при температуре 2°C для осаждения фрагментов неразрушенной ткани.

Высушенный измельченный сбор, отвар и настой растительного сбора вводили животным курсом ежедневно в течение 5 дней через зонд в желудок в виде раствора или взвеси в воде за 1 час до начала экспериментальных манипуляций. Высушенный измельченный до мелкодисперсного порошка сбор вводили в дозе 500 мг/кг. Доза отвара и настоя составила 5 мл/кг. Данная доза соответствует количеству сбора (порошка) по содержанию экстрактивных веществ. Указанные дозы определены как наиболее активные в предварительных экспериментах. В качестве препарата сравнения использовали настой растительного сбора «Эуфразин» в дозе 3 мл/кг. Животные контрольных групп получали эквивалентное количество воды.

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически. О достоверности различий судили методом проверки вероятности нулевой гипотезы с использованием t критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р≤0,05.

Пример 4. Определение показателя антиоксидантной активности в реакции с α-дифенил-α-пикрилгидразилом (ДФПГ) по J. Glavind [5] в гомогенате головного мозга у мышей после гипоксического воздействия. Стабильный свободный радикал ДФПГ восстанавливается в ходе взаимодействия с антиоксидантами, что отражается в уменьшении экстинкции раствора ДФПГ при длине волны 517±2 нм.

Для получения хлороформного экстракта в пробирку к 0,5 мл гомогената приливали 10,0 мл хлороформа, плотно закрывали и интенсивно встряхивали в течение 10 мин. Полученную пробу центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Верхний тонкий водный слой и пленку белков удаляли. Нижнюю хлороформную фазу использовали для определения показателя антиоксидантной активности.

Содержание липидов в экстракте определяли гравиметрически. Для этого в предварительно маркированный и взвешенный на аналитических весах флакон вносили 3,0 мл хлороформного экстракта липидов и выпаривали досуха при температуре 70°C на водяной бане. После чего флакон повторно взвешивали и по разнице масс определяли содержание липидов в экстракте.

Проба «контроль»: в пробирке смешивали 3,0 мл хлороформа и 1,0 мл раствора ДФПГ, спустя 5 мин измеряли экстинкцию смеси при длине волны 517±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно хлороформа (Е_{КОНТРОЛЬ}). Затем в кювету добавляли 25 мкл раствора гидрохинона, быстро перемешивали стеклянной палочкой, спустя 30 мин проводили измерение (Е_ГХ).

Проба «опыт»: в кювету (толщина 10 мм) вносили 3,0 мл хлороформного экстракта липидов и 1,0 мл раствора ДФПГ, тотчас перемешивали стеклянной палочкой и через 30 мин измеряли экстинкцию при длине волны 517 нм относительно хлороформа (Е_ОПЫТ).

Для расчета принимали во внимание, что 0,1 мкэквивалент гидрохинона вызывает уменьшение экстинкции раствора ДФПГ на 0,22 ед., а 1 мкмоль гидрохинона соответствует 2 мкэквивалентам. Показатель антиоксидантной активности (АА) рассчитывали по формуле:

где АА - антиоксидантная активность, нэкв/г мозга на мг общих липидов;

М_МОЗГА - масса мозга, г;

МОЛ - масса общих липидов в г мозга, мг;

1231,2 - коэффициент, учитывающий разведение проб и переход от единиц экстинкции к эквивалентам восстановителя.

Перенесенная гипоксическая травма вызывает дисбаланс взаимоотношений систем свободнорадикального окисления и общей антиоксидантной активности в организме животных, о чем свидетельствует увеличение показателя антиоксидантной активности в тканях головного мозга животных после гипоксического воздействия в 2,8 раза по сравнению с интактным контролем (таблица).

Курсовое введение предлагаемого сбора в виде порошка, отвара, настоя, содержащего побеги княжика сибирского, зеленые листья бадана толстолистного и траву лабазника вязолистного, оказывает защитное действие на мозг животных, перенесших гипоксическую травму, от свободных радикалов (таблица). Применение сбора снижает значение показателя антиоксидантной активности в реакции с ДФПГ по J. Glavind в мозге животных после воздействия в 1,9-3,5 раза по сравнению с животными группы гипоксического контроля. Использование сбора в виде порошка, отвара или настоя способствует восстановлению показателя антиоксидантной активности преимущественно за счет их антирадикального действия. При введении отвара и настоя отмечается более выраженное снижение указанного показателя в сравнении с группой гипоксического контроля. В данных группах уменьшение показателя антиоксидантной активности происходит до уровня интактного контроля. Однако в сравнении с ними препарат сравнения оказывает меньшее восстанавливающее влияние на исследуемый показатель антиоксидантной активности мозга животных, перенесших гипоксическую травму.

Пример 5. Определение содержания ТБК-активных продуктов (ТБК-АП) в гомогенате головного мозга мышей [6]. Об активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в головном мозге животных судили по накоплению ТБК-АП, основную долю которых составляет малоновый диальдегид (МДА), образующийся на конечных этапах процесса. МДА взаимодействует с 2-тиобарбитуровой кислотой (2-ТБК) в кислой среде при высокой температуре, образующийся при этом триметиновый комплекс, состоящий из двух молекул 2-ТБК и одной молекулы МДА, окрашен в розовый цвет и имеет максимум поглощения при длине волны 532±2 нм.

К 2,5 мл гомогената мозга приливали 1 мл охлажденного 17% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), перемешивали и осадок коагулированных белков отделяли центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. В пробирке к 2 мл прозрачной надосадочной жидкости добавляли 1 мл 0,8% раствора ТБК и помещали в кипящую водяную баню на 15 мин. Пробу охлаждали и проводили измерения в кюветах с толщиной слоя 5 мм при длине волны 532±2 нм относительно контроля (2 мл исследуемого материала заменяли таким же объемом буфера). Содержание ТБК-АП рассчитывали по формуле

где ТБК-АП - содержание ТБК-активных продуктов, пкмоль/г мозга на мг общих липидов;

М_МОЗГА - масса мозга, г;

МОЛ - масса общих липидов в г мозга, мг;

242,3 - коэффициент, учитывающий разведение проб и молярный коэффициент экстинкции триметинового комплекса

Для расчета содержания ТБК-АП в биоматериале использовали молярный коэффициент экстинкции для триметинового комплекса (ε), равный 1,56×10⁵ моль^-1 × см^-1 × л, в значение которого учтена толщина слоя кюветы (5 мм).

У животных, перенесших гипоксическую травму, наблюдается увеличение содержание ТБК-АП в головном мозге в 1,7 по сравнению с интактными животными, что свидетельствует о выраженности процессов ПОЛ после гипоксического воздействия (таблица).

Курсовое введение предлагаемого сбора в виде порошка, отвара, настоя, содержащего побеги княжика сибирского, зеленые листья бадана толстолистного и траву лабазника вязолистного, снижает содержание ТБК-АП и способствует нормализации данного показателя практически до уровня интактного контроля у животных, перенесших гипоксическую травму (таблица). При этом препарат сравнения уступает всем объектам исследования (порошок, отвар, настой сбора) по уровню снижения количества ТБК-АП в тканях головного мозга после гипоксической травмы.

Таким образом, при изучении влияния сбора, содержащего побеги княжика сибирского, зеленые листья бадана толстолистного и траву лабазника вязолистного, на некоторые показатели состояния антиоксидантной защиты организма (показатель антиоксидантной активности в реакции с ДФПГ по J. Glavind и содержание ТБК-АП в тканях головного мозга после гипоксической травмы) установлено его выраженное антиоксидантное действие, превосходящее настой растительного сбора «Эуфразин» (препарат сравнения) по уровню снижения показателя антиоксидантной активности в реакции с ДФПГ по J. Glavind и количества ТБК-АП в тканях головного мозга после гипоксической травмы.

На основании проведенных экспериментальных исследований можно сделать вывод о том, что применение сбора, содержащего побеги княжика сибирского, зеленые листья бадана толстолистного и траву лабазника вязолистного, является перспективным для получения более высокого лечебного эффекта.

Технический результат достигнут благодаря использованию сбора, содержащего побеги княжика сибирского, зеленые листья бадана толстолистного и траву лабазника вязолистного, в качестве антиоксидантного, что позволило расширить арсенал средств растительного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, с повышенной терапевтической эффективностью.

Литература

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая Волна, 2002. - Т. 2. - С. 182-188.

2. Оковитый С.В. Клиническая фармакология антиоксидантов // ФАРМиндекс: ПРАКТИК. - 2003. - Вып. 5. - С. 85-111.

3. Пат. 2560077 Российская Федерация, МПК A61K A61P «Растительный сбор «Эуфразин», обладающий антиоксидантной и ноотропной активностью» / Мирович В.М., Самбаров А.Л., Мурашкина И.А., Шапкин Ю.Г., Ляхов А.А.; заявитель и патентообладатель Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU). - №2014120326; заявл. 20.05.2014; опубл. 20.08. 2015; Бюл. №23. - 8 с.: 1 ил.

4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 276-296.

5. Glavind J. Antioxidants in animal tissues // Acta Chemica Scandinavica. - 1963. - Vol. 17, №6. - P. 1635-1640.

6. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1978. - С. 66-68.