Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО АНАЛИЗА КЛЕТОК КРОВИ ПОСРЕДСТВОМ ОПИСАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ НА ОСНОВЕ ОПТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ СТРУКТУРЫ ЯДЕР

Изобретение относится к медицине и направлено на автоматизацию морфологического исследования при диагностике острого лейкоза посредством измерения характеристик структуры ядер клеток крови для снижения ошибки их классификации.

В решении предложен подход к количественному описанию структуры хроматина ядра бластных клеток крови. Предложен способ классификации клеток крови на основе измерения характеристик структуры ядер и их описания набором признаков. Применение метода компьютерного анализа изображений клеток крови может дать дополнительную информацию о строении клетки, на основе чего позволит отнести ее к разряду нормальной или патологической. Информация о принадлежности клеток к той или иной линии кроветворения, степени их дифференцировки позволяет уточнить направление диагностических исследований, сориентироваться в выборе схемы лечения.

В работах, посвященных компьютерному анализу микроскопических изображений мазков крови, рассматривается решение задач обнаружения и классификации лейкоцитов в микроскопическом изображении мазков крови, при этом расчет формулы крови проводится по следующим типам клеток: «лимфоциты», «моноциты», «нейтрофилы (палочкоядерные и сегментоядерные)», «базофилы», «эозинофилы», «прочие». Одной из важных нерешенных проблем остается задача выявления среди типа «прочих клеток» разных видов бластных клеток (монобласты, миелобласты, лимфобласты, эритробласты, мегакариобласты), незрелых клеток (пролимфоцитов, промиелоцитов, и т.п.) и реактивных клеток (атипичные мононуклеары, активированные лимфоциты и т.п.) В1. В рамках отмеченной задачи особо следует отметить необходимость разработки методов, направленных на снижение ошибки обнаружения бластных клеток.

Известно решение [1]:

1. Способ визуализации форменных элементов крови птиц (тромбоцитов, ретикулоцитов, эритроцитов), включающий перемешивание крови с основным красителем, суправитальное окрашивание, сушку сделанных на предметных стеклах мазков, фиксацию их в течение трех минут, докрашивание и микроскопирование под иммерсией, отличающееся тем, что окрашивание нестабилизированной крови проводят красителем бриллианткрезилблау при температуре 18-20°C в течение 20-40 мин, причем перемешивание ее с красителем проводят ламинарно в замкнутом объеме в течение 30 с, после сушки мазков фиксируют их в растворе-фиксаторе по Лейшману, докрашивают в течение 10 мин разбавленным раствором красителя-фиксатора по Лейшману, промывают буферным раствором, причем при микроскопировании дополнительно получают информацию о наличии клеток лимфоцитарного ряда на одном мазке.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что разбавленный раствор красителя-фиксатора по Лейшману готовят путем разведения его с буфером в соотношении 1:1, используют буферный раствор с pH=6,8-7,2, состоящий из 0,95% натрия фосфорнокислого двузамещенного и 0,907% калия фосфорнокислого однозамещенного.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для промывания мазков используют буферный раствор по п. 2.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на мазке одномоментно визуализируют эритроциты - в виде вытянутых эллипсоидов с резко оксифильной цитоплазмой, насыщенной гемоглобином, ядром интенсивного сине-фиолетового цвета с плотной структурой хроматина, ретикулоциты - в форме вытянутых эллипсоидов с четко выделяющейся зернисто-ниточной субстанцией в виде синей сеточки на розовом (оксифильном) фоне и ядром от светло-синего до фиолетового цвета, базофилы - в виде темно-фиолетовых клеток округлой формы с плохо просматривающимися ядрами из-за зернистости, которая накладывается на ядерные и цитоплазматические структуры, эозинофилы - в виде клеток округлой формы с эксцентрично расположенным светло-фиолетовым ядром и светло-голубой цитоплазмой с круглой зернистостью от темно-красного до светло-розового цвета, псевдоэозинофилы - в виде клеток округлой формы с бесцветной цитоплазмой и сегментированным ядром, хроматином светло-фиолетового цвета, светло-розовой зернистостью в форме веретена с острым концом, лимфоциты - в виде клеток округлой формы, с цитоплазмой голубого или серо-голубого цвета, ярко выраженной перинуклеарной зоной, ядро округлое, фиолетово-розового цвета, моноциты - в виде клеток угловато-округлой формы с протоплазмой от голубоватого до серовато-синего цвета, иногда с вакуолями, ядро различной формы, иногда эксцентрично расположенное, тромбоциты - в виде мелких клеток овальной формы с округлым ядром сине-фиолетового цвета, вокруг которого выделяется более светлая перинуклеарная зона, и цитоплазмой, окрашенной в цвета от нежно-розового до серовато-голубого.

Однако указанное решение не позволяет достоверно выявлять наличие бластных клеток, в частности, посредством количественного описания структуры хроматина ядра клеток крови для снижения ошибки их классификации.

Известно решение [2] для определения эффективности противоопухолевого лечения, включающего патоморфологическое исследование результатов противоопухолевого лечения, отличающееся тем, что проводят ультраструктурное исследование раковой опухоли ректосигмоидного отдела, сигмовидной кишки после аутогемохимиотерапии, выявляют некроз, выраженный апоптоз, большое количество активных лимфоцитов, фибриллогенез, дистрофические изменения в сосудах, явления эктазии, что свидетельствует о необратимых некротических изменениях в раковых клетках и их гибель, замещение некротизированных опухолевых пластов. При исследовании рака прямой кишки после аутогемохимиотерапии в сочетании с СВЧ-гипертермией на уровне электронной микроскопии выявляют однотипные с вышеперечисленными факторы некроза, но с большей степенью выраженности, в сохранившихся раковых клетках ядерный хроматин конденсирован, в цитоплазме процесс маргиналии, лизис и порциальные некрозы различной величины, обнаруженные изменения в клетках свидетельствуют о снижении синтеза нуклеиновых кислот и белка в ядрах, нарушении проницаемости цитоплазматической мембраны и, как следствие, - изменений в цитоплазме, затем на этом же материале после указанного лечения выполняют иммуногистохимическое исследование: проводят реакции с маркерами факторов пролиферации Ki-67, PCNA, ЭМА, РЭА, наблюдают положительную реакцию в виде отчетливого окрашивания, выявляют экспрессию маркеров, связанных с факторами пролиферации, маркеры соединительной ткани, что свидетельствует о блокаде маркеров эндотелия, базальных мембран, коллагена IV типа, подавление ангиогенеза, наличие сосудов капиллярного типа, гиперпластические изменения в эндотелии, а также о пролиферативных процессах в сосудистом русле.

В указанном решении отсутствует комплексный анализ и обоснованные заключения о наличии бластных клеток в периферической крови, а процедура обследования весьма трудоемка.

Известно также решение, согласно публикации [3], где описан стандартный состав компьютерного анализатора изображений. Прибор состоит из светового микроскопа, цветной цифровой видеокамеры, платы захвата изображения (фреймграббер), компьютера с программным обеспечением (рис. 1). Микроскоп оснащен оборудованием для перемещения и фокусировки препарата - моторизованным столиком, способным передвигаться во всех плоскостях. Блок управления позволяет программно управлять перемещениями столика и соединен с компьютером. Автоматическое сканирование мазка крови обычно состоит из двух, вообще говоря, независимых этапов: анализа эритроцитов в тонкой части мазка и формирования выборки лейкоцитов. Основные временные затраты связаны именно с поиском лейкоцитов.

Данное решение не оптимально для выявления особенностей структуры хроматина ядра при автоматизации процесса анализа, а также имеет ограничения по использованию и не оптимальную конструкцию по связям элементов.

Также известно решение [4]. Согласно публикации «На изображении ядро лейкоцита представляет собой оптически плотное образование, цвет… Это связано как с высокой вариабельностью клеток и клеточных структур, так и с высоким… На изображениях препаратов крови, такими элементами являются только ядра лейкоцитов».

Решение не оптимально для выявления особенностей структуры хроматина ядра при автоматизации процесса анализа, а также имеет ограничения по использованию.

Также известно техническое решение [5] для автоматического обнаружения бластных клеток в периферической крови, где описываются средства автоматизированного микроскопического анализа, ориентированные на поддержку принятия решений по идентификации бластных клеток при исследовании препаратов периферической крови на основе компьютерной обработки изображений для выявления онкологических заболеваний.

Однако указанное решение не позволяет выявлять особенности структуры хроматина ядра клеток крови, необходимые для различения лейкоцитов по разным типам клеток.

Известно решение для автоматизированной диагностики острых лейкозов [6].

По мнению заявителя, указанное решение является наиболее близким аналогом заявленного решения - прототипом.

Однако указанное решение не оптимально для выявления особенностей структуры хроматина ядра при автоматизации процесса анализа в связи с тем, что не обеспечивает однозначное отнесение клеток к известным типам (В1).

Технический результат заявленного решения достигается тем, что в способе автоматизированного анализа клеток крови посредством описания лейкоцитов на основе оптических особенностей структуры ядер, включающем представление изображения в компьютерном анализаторе изображений, отличающемся тем, что определяют количественные характеристики клетки крови, значения которых получают расчетным путем на основании измерений, выполненных по микроскопическим изображениям внутренних структур ядра клетки крови, и при этом рассчитываемые характеристики определены таким образом, чтобы соответствовать тем качественным признакам структуры хроматина ядра клетки крови, которые используют врачи при визуальном анализе микроскопических изображений мазков крови, при этом представляют изображения ядра клетки крови в виде совокупности светлых и темных объектов - структурных элементов, отражающих такие визуально наблюдаемые в микроскопическом изображении характерные объекты анализа, как «зерна» в изображении грубой структуры хроматина, «ячейки» в сетчатой структуре хроматина; выделение светлых и темных структурных элементов в изображении ядра клетки крови выполняют путем сегментации, сочетающей бинаризацию с различными уровнями порогового ограничения с применением логических функций конъюнкции и дизъюнкции для объединения частей объектов ввиду того, что один уровень может представлять только часть объекта, причем для количественного описания выделенных структурных элементов соответствующих оптическим характеристикам структуры ядра клетки крови измеряют следующие морфологические характеристики объектов: площадь S, средний радиус Ra, среднеквадратический радиус Rms, максимальный Rmax и минимальный радиусы Rmin, момент инерции Mi, относительный момент инерции Kmi (отношение момента инерции объекта к моменту инерции равновеликого круга), относительный периметр Кр (отношение половины периметра к корню из площади, умноженной на π), средний диаметр Фере Da, максимальный Dmax, минимальный Dmin и среднеквадратический Dms диаметр Фере, Kd - отношение максимального диаметра Фере к минимальному диаметру Фере; для группы структурных элементов ядра клетки крови рассчитывают количественные характеристики клетки крови: Sda - сумма средних диаметров Фере, Sf - сумма коэффициентов формы, Srms - сумма среднеквадратических радиусов; Sdms - сумма среднеквадратических диаметров, Smir - сумма относительных моментов инерции объектов; в дополнение количественных характеристик клетки крови рассчитывают статистические оценки параметров распределения значений морфологических характеристик, по выборке выделенных на изображении ядра клетки структурных элементов:

где X_i - значение морфологической характеристики X для i-го структурного элемента ядра клетки крови, под X понимается одна из морфологических характеристик, рассмотренных выше, - S, или Ra, или Ra, или Rms, или Rmax, или Rmin, или Mi, или Kmi, или Kp, или Da, или Dmax, или Dmin, или Dms, или Kd; n - количество структурных элементов, выделенных на изображении ядра клетки крови.

При практическом применении способа автоматизированного анализа клеток крови посредством описания лейкоцитов на основе оптических особенностей структуры ядер рассчитанные количественные характеристики исследуемой клетки крови соотносятся (сравниваются) с соответствующими количественными характеристиками клеток крови на изображениях в базе эталонов - образцов клеток крови разных классов (лимфоцитов, или лимфоидных клеток, или моноцитов, или моноцитоидных клеток, или промиелоцитов, или миелоцитов, или атипичных мононуклеаров, или бластов (в том числе или лимфобластов, или миелобластов, или монобластов, или мегакариобластов, или эритробластов)), в результате чего находится класс клеток крови, эталон которых по рассчитанным количественным характеристикам наиболее близок к исследуемой клетке крови, на основе этого принимается решение об отнесении исследуемой клетки к классу или лимфоцитов, или лимфоидных клеток, или моноцитов, или моноцитоидных клеток, или промиелоцитов, или миелоцитов, или атипичных мононуклеаров, или бластов (в том числе или лимфобластов, или миелобластов, или монобластов, или мегакариобластов, или эритробластов)

Для автоматизации процесса классификации клеток крови в анализаторе изображений определяются количественные характеристики клеток крови, значения которых получаются расчетным путем на основании измерений, выполненных по микроскопическим изображениям ядер клеток, и при этом расчетные характеристики соответствуют тем качественным признакам структуры хроматина, которые используют врачи при визуальном анализе микроскопических изображений мазков крови. В ходе исследования мазков крови при диагностике острых лейкозов врачи подсчитывают процентное количество разных типов лейкоцитов и выявляют клетки крови характерные для лейкозов (лимфобласты, миелобласты, монобласты). При формировании модели количественного описания структуры хроматина в предлагаемом способе использованы такие качественные оптические признаки структуры хроматина ядра клеток крови, как грубость, сетчатость и нежность хроматина.

Фиг. 1. Изображения клеток крови: а) бластная клетка, с указанием области D, содержащей светлый структурный элемент; б) лимфоцит с грубой структурой хроматина.

Предлагаемый способ основан на представлении изображения ядра в виде совокупности светлых и темных объектов - структурных элементов (Фиг. 1а, б). Эти структуры наблюдаются в оптическом диапазоне длин волн и характеризуются такими параметрами, как размер зерен в изображении грубой структуры хроматина, размер ячейки в сетчатой структуре. Иллюстрация разных типов хроматина приведена на Фиг. 1а (изображение бластной клетки с сетчатой структурой хроматика ядра) и Фиг. 1б (изображение лимфоцита с грубой структурой хроматина ядра).

Выделение светлых и темных структурных элементов в изображении ядра клетки предложено выполнять путем сегментации, сочетающей бинаризацию с различными уровнями порогового ограничения с применением логических функций конъюнкции и дизъюнкции для объединения частей объектов.

Фиг. 2, а) изображение бластной клетки с указанием области D со светлым структурным элементом и линии АВ для анализа изменения яркости в точках этой линии (здесь линия АВ приводится для иллюстрации характера яркостных изменений изображения ядра по точкам этой линии); б) график зависимости яркости изображения ядра от координаты x по линии АВ, Y - значение яркости, выраженное в условных единицах 7G[0,255], x - значение пространственной координаты точек изображения по линии АВ, выраженное в мкм.

На Фиг. 2 представлено изображение бластной клетки а) и соответствующий ему профиль яркости по линии АВ б). Светлому структурному элементу в области D Фиг. 2 а) на графике Фиг. 2 б) соответствует локальный экстремум функции яркости и Фиг. 3 пример получившихся структур.

Последовательность действий при формировании количественного описания структурных элементов ядра клетки: приготовленный стандартный окрашенный препарат мазка крови размещается на предметном столике микроскопа и устанавливается освещение микроскопа. Таким образом, система подготавливается к работе. При помощи автоматизированного привода управления предметного столика препарат позиционируется так, чтобы клетка крови оказалась в поле наблюдения через объектив тринокуляра микроскопа с закрепленной камерой. Посредством автоматизированного управления привода управления предметного столика настраивается максимальная резкость изображения клетки крови и подается сигнал на электронную регистрацию изображения клетки. По полученному изображению ядра клетки формируется множество структурных элементов, отвечающих оптическим характеристикам хроматина ядра рассматриваемой клетки, затем рассчитываются характеристики структурных элементов по вышеприведенным формулам. Рассчитанные характеристики сравниваются с характеристиками изображений, хранящимися в базе эталонов типов клеток (лимфоцитов, лимфоидных клеток, моноцитов, моноцитоидных клеток, промиелоцитов, миелоцитов, атипичных мононуклеаров, лимфобластов, миелобластов, монобластов), и по рассчитанным количественным характеристикам находится ближайший эталон типа клетки, на основе этого принимается решение об отнесении клетки к классу или лимфоцитов, или лимфоидных клеток, или моноцитов, или моноцитоидных клеток, или промиелоцитов, или миелоцитов, или атипичных мононуклеаров, или лимфобластов, или миелобластов, или монобластов. Выявленные типы клеток дают основание врачу для вынесения диагностического заключения о возможном наличии у пациента заболевания «острый лейкоз» и необходимости дальнейших диагностических исследований. Например, выявление клеток крови типа миелобластов при анализе периферической крови является основанием для предположения о наличии у пациента заболевания «острый лейкоз» и необходимости проведения дальнейших диагностических исследований костного мозга для установления типа острого лейкоза. В случае выявления клеток «атипичный мононуклеар» и отсутствия бластных клеток врач получает основание для предположений о наличии у пациента заболевания «инфекционный мононуклеоз». Пояснения по тексту заявки.

Для оценки адекватности предложенной модели была сформирована тестовая выборка из 1058 изображений клеток крови, разделенных по 9-ти типам: бластов (462, в том числе миелобластов - 167), пролимфоцитов (55), лимфоцитов (177), лимфоидных клеток (75), моноцитов (32), моноцитоидных клеток (30), промиелоцитов (90), миелоцитов (82), атипичных мононуклеаров (55). Проведен эксперимент по классификации клеток крови на основе структурных элементов и определены ошибки распознавания при дифференцировке клеток крови лейкоцитарного ряда. По результатам эксперимента рассчитаны ошибки классификации для различных сочетаний типов клеток в классифицируемой выборке: 10% для группы бластных и не бластных клеток, 3% для лимфоцитов и миелобластов, 6% для миелоцитов и миелобластов, 7% для моноцитов и миелобластов, 20% для пролимфоцитов и миелобластов, 3% для атипичных мононуклеаров и миелобластов.

По результатам эксперимента к наиболее эффективным среди рассмотренных признаков можно отнести следующие: среднеарифметическое значение Kd - отношение максимального диаметра к минимальному диаметру; Sda - сумма средних диаметров; Sf - сумма коэффициентов формы; Srms - сумма среднеквадратических радиусов; Sdms - сумма среднеквадратических диаметров; Smir - сумма относительных моментов инерции объекта.

В итоге проведенных исследований можно сделать вывод, что предложенный способ позволяет соотнести оптические качественные признаки, используемые врачом при диагностическом исследовании мазков крови, с количественными характеристиками в соответствии с предложенным способом. Использование этих характеристик при автоматической классификации позволит создать систему автоматизированного анализа мазков крови, ориентированной на распознавание бластных клеток и определение их типов для диагностики острых лейкозов. Определение типа клетки, в свою очередь, поможет определить тип острого лейкоза при диагностике острых лейкозов и соответственно проводить более направленное лечение.

Литературные источники:

1. РФ, ФИПС, (19) RU (11) 2002112129 (13) А (51) МПК 7 G01N 1/30 (12) ЗАЯВКА НА ИЗОБРЕТЕНИЕ. По данным на 04.12.2014 состояние делопроизводства: Нет данных. (21), (22) Заявка: 2002112129/13, 06.05.2002 (43) Дата публикации заявки: 27.01.2004. Адрес для переписки: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85, БелГУ, Т.М. Токтаревой (71) Заявитель(и): Белгородский государственный университет. (72) Автор(ы): Липунова Елена Андреевна и др. (54) Способ визуализации форменных элементов крови птиц на одном мазке.

2. РФ, ФИПС, (19) E.U (11) 2001128416 (13) А (51) МПК 7 А61В 10/00. (12) ЗАЯВКА НА ИЗОБРЕТЕНИЕ (21), (22) Заявка: 2001128416/14, 18.10.2001. (43) Дата публикации заявки: 27.06.2003. Адрес для переписки: 344037, г. Ростов-на-Дону, 14 линия, 63, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт. (71) Заявитель(и): Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Непомнящая Евгения Марковна, Петров Семен Венедиктович, Гудцкова Татьяна Николаевна (72) Автор(ы): Непомнящая Евгения Марковна и др. (54) Способ определения эффективности противоопухолевого лечения.

3. Обнаружение ядер лейкоцитов на мазке крови с помощью компьютерного анализатора изображений. A.M. Пятницкий ЗАО «Медицинские Компьютерные Системы», www.mecos.ru».

4. Технология выделения лейкоцитов на изображениях препаратов крови. Е.С. Жулькова, Н.Ю. Ильясова и А.В. Куприянов.

5. (19) RU (11) 61890 (13) U1 (51) МПК G01N 33/48 (2006.01) G01N 33/49 (2006.01), (21), (22) Заявка: 2006135515/22, 09.10.2006. (54) Устройство для автоматического обнаружения бластных клеток в периферической крови.

6. Методы и средства автоматизированной обработки микроскопических изображений мазков периферической крови для диагностики острых лейкозов, Автореферат на соискание уч.ст.к.т.н., Москва, 2007, С. 11-12.