Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОГО ПРЕПАРАТА ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к области ветеринарной фармакологии, в частности к способам получения комбинированных антигельминтных препаратов пролонгированного действия.

Паразитарные болезни, вызываемые различными видами гельминтов и простейших, широко распространены на территории России среди домашних и бродячих животных и наносят большой экономический ущерб животноводству. При попадании в организм животного-хозяина, гельминты паразитируют в разных органах и тканях, при этом некоторые их виды совершают миграцию по организму, причиняя разнообразный вред своему хозяину. Часто данные болезни протекают латентно, без выраженных клинических признаков, однако при этом неблагоприятно влияют на состояние здоровья, работоспособность и продуктивность животных. Кроме того, зараженные животные на длительное время становятся источником заражения для других. Некоторые паразитарные болезни являются антропозоонозами, и поэтому разработка эффективных средств для их профилактики и лечения имеет огромное медико-социальное значение.

Возможность создания антигельминтных препаратов пролонгированного действия активно изучается как в нашей стране, так и за рубежом.

Результатом этих усилий было создание инъекционного пролонгированного препарата LONGRANGE™, Merial, на основе эприномектина. Препарат эффективен не менее 150 суток, однако содержит только одно активное действующее вещество, что ограничивает область его использования (см., например, SOLL М. et all, An eprinomectin extended-release injection formulation providing nematode control in cattle for up to 150 days, Vet. Parasitol, 2013, Mar 1; 192(4); 313-20).

Создание же комбинированных антигельминтных препаратов пролонгированного действия на основе активных веществ различного спектра действия позволит значительно упростить дегельминтизацию, снизить периодичность санации животных при повышении эффективности их обработки и снижении затрат на нее. Все это делает разработку таких препаратов весьма актуальной задачей.

Известны следующие комбинированные антигельминтные препараты и способы их получения:

- US 2006068020 А1, 30.03.2006 - препарат содержит ивермектин, празиквантел и пирантела памоат, каждый из которых предварительно инкапсулируют путем покрытия полимером, затем смешивают с липидами или гелеобразными полимерами, сушат.

- CN 101926813 А, 29.12.2010 - препарат содержит ивермектин и празиквантел. Способ получения препарата включает растворение ивермектина и празиквантела в двух или более органических растворителях, добавление антиоксидантов, анальгетиков и солюбилизаторов.

Препараты обладают высокой эффективностью против широкого спектра паразитарных заболеваний, однако они не обладают пролонгированным действием, способы их получения длительны, а состав сложен.

Известен противопаразитарный препарат широкого спектра действия, содержащий ивермектин, празиквантел и альбендазол (см., например, CN 103800355 А, 21.05.2014).

Препарат выпускается в форме микросфер и обладает пролонгированным действием. В качестве носителя в способе получения препарата используют полимолочную кислоту.

Однако при производстве микросфер наблюдаются достаточно большие потери празиквантела, и, соответственно, относительно низкое его содержание в конечном продукте.

Способ получения данного препарата является наиболее близким аналогом заявленного изобретения.

Задачей изобретения является разработка высокоэффективного комбинированного отечественного противопаразитарного препарата пролонгированного действия, обладающего хорошей биодоступностью, нетоксичного, безвредного, стойкого при хранении, при производстве которого потери активных компонентов минимальны.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения противопаразитарного препарата пролонгированного действия для животных согласно изобретению смешивают празиквантел, ивермектин, сополимер молочной и гликолевой кислот и растворитель при следующем соотношении ингредиентов (в мас. %):

причем сначала последовательно растворяют празиквантел и ивермектин в растворителе, после чего полученный раствор продувают аргоном или азотом и помещают в ультразвуковую ванну, где выдерживают в течение 50-60 минут до полного растворения компонентов, а затем добавляют сополимер молочной и гликолевой кислот, и для его полного растворения полученную смесь выдерживают в течение 4-5 часов при периодическом перемешивании со скоростью вращения 1600-2000 об/мин, после чего полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, разливают во флаконы и укупоривают.

Поставленная задача решается и тем, что растворитель выбирают из группы: N-метилпирролидон, пирролидон, триацетин, бензиловый спирт или используют смесь данных растворителей.

Целесообразно в качестве сополимера молочной и гликолевой кислот использовать сополимеры с соотношением молочной и гликолевой кислот 50:50 или 75:25.

Поставленная задача решается также тем, что стерилизующую фильтрацию осуществляют путем последовательного пропускания препарата через фильтры при избыточном давлении 2×10⁵-4×10⁵Па.

Целесообразно процессы стерилизующей фильтрации и розлива проводить под ламинарным потоком.

Техническим результатом заявленного изобретения является то, что способ позволяет до минимума снизить потери активных веществ при производстве препарата, а полученный препарат обладает минимальной скоростью освобождения активных веществ, широким спектром действия и пролонгированным эффектом, нетоксичен и не дает каких-либо побочных реакций после его введения, хорошо хранится.

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами его выполнения, которые, однако, не сужают объем притязаний заявителя.

Пример 1

Последовательно растворяют 1.3 г празиквантела и 0.5 г ивермектина в 82.7 г N-метилпирролидона. Полученный раствор продувают аргоном и помещают в ультразвуковую ванну, где выдерживают в течение 50 минут до полного растворения компонентов. Затем добавляют 15.5 г сополимера молочной и гликолевой кислот (далее PLGA) с соотношением молочной и гликолевой кислот 75:25. Для полного растворения PLGA полученную смесь выдерживают в течение 4 часов при периодическом перемешивании со скоростью вращения 1600 об/мин. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации путем последовательного пропускания препарата через фильтры на основе регенерированной целлюлозы при избыточном давлении 3×10⁵ Па, разливают во флаконы и укупоривают. При этом процесс стерилизующей фильтрации и розлива проводят под ламинарным потоком. Выход препарата составляет 92,3%.

Содержание лекарственных веществ в полученных препаратах определяли методом ВЭЖХ.

Пример 2

Последовательно растворяют 8.66 г празиквантела и 0.62 г ивермектина в 80.2 г пирролидона. Полученный раствор продувают азотом и помещают в ультразвуковую ванну, где выдерживают в течение 55 минут до полного растворения компонентов. Затем добавляют 10.52 г PLGA 75:25. Для полного растворения PLGA полученную смесь выдерживают в течение 4,5 часов при периодическом перемешивании со скоростью вращения 1800 об/мин. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации путем последовательного пропускания препарата через фильтры на основе регенерированной целлюлозы при избыточном давлении 2×10⁵ Па, разливают во флаконы и укупоривают. При этом процесс стерилизующей фильтрации и розлива проводят под ламинарным потоком. Выход препарата составляет 91,8%.

Пример 3

Последовательно растворяют 12.5 г празиквантела и 0.74 г ивермектина в 80.0 г N-метилпирролидона. Полученный раствор продувают аргоном и помещают в ультразвуковую ванну, где выдерживают в течение 55 минут до полного растворения компонентов. Затем добавляют 6.76 г PLGA 75:25. Для полного растворения PLGA полученную смесь выдерживают в течение 5 часов при периодическом перемешивании со скоростью вращения 1900 об/мин. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации путем последовательного пропускания препарата через фильтры на основе регенерированной целлюлозы при избыточном давлении 4×10⁵ Па, разливают во флаконы и укупоривают. При этом процесс стерилизующей фильтрации и розлива проводят под ламинарным потоком. Выход препарата составляет 91,5%.

Пример 4

Последовательно растворяют 15.3 г празиквантела и 7.68 г ивермектина в 60.52 г N-метилпирролидона. Полученный раствор продувают азотом и помещают в ультразвуковую ванну, где выдерживают в течение 60 минут до полного растворения компонентов. Затем добавляют 16.5 г PLGA 50:50. Для полного растворения PLGA полученную смесь выдерживают в течение 4,5 часов при периодическом перемешивании со скоростью вращения 1700 об/мин. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации путем последовательного пропускания препарата через фильтры на основе регенерированной целлюлозы при избыточном давлении 3×10⁵ Па, разливают во флаконы и укупоривают. При этом процесс стерилизующей фильтрации и розлива проводят под ламинарным потоком. Выход препарата составляет 90,9%.

Пример 5

Последовательно растворяют 14.2 г празиквантела и 7.18 г ивермектина в смеси N-метилпирролидона и бензилового спирта (соответственно 58.08 г и 5.0 г). Полученный раствор продувают аргоном и помещают в ультразвуковую ванну, где выдерживают в течение 60 минут до полного растворения компонентов. Затем добавляют 15.54 г PLGA 75:25. Для полного растворения PLGA полученную смесь выдерживают в течение 4,5 часов при периодическом перемешивании со скоростью вращения 1600 об/мин. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации путем последовательного пропускания препарата через фильтры на основе регенерированной целлюлозы при избыточном давлении 3×10⁵ Па, разливают во флаконы и укупоривают. При этом процесс стерилизующей фильтрации и розлива проводят под ламинарным потоком. Выход препарата составляет 90,1%.

Пример 6

Последовательно растворяют 14.5 г празиквантела и 7.2 г ивермектина в смеси 57.5 г N-метилпирролидона и 5.0 г триацетина. Полученный раствор продувают азотом и помещают в ультразвуковую ванну, где выдерживают в течение 60 минут до полного растворения компонентов. Затем добавляют 15.8 г PLGA 75:25. Для полного растворения PLGA полученную смесь выдерживают в течение 5 часов при периодическом перемешивании со скоростью вращения 1700 об/мин. Полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации путем последовательного пропускания препарата через фильтры на основе регенерированной целлюлозы при избыточном давлении 3×10⁵ Па, разливают во флаконы и укупоривают. При этом процесс стерилизующей фильтрации и розлива проводят под ламинарным потоком. Выход препарата составляет 89,9%.

Таким образом, потери активных веществ при производстве препарата минимальны.

Пример 7

Исследование полученных по примерам 1-6 образцов препаратов было проведено как in vitro, так и in vivo.

Была изучена острая токсичность полученных препаратов, их иммунотоксические и аллергенные свойства, а также раздражающее действие. Препараты были испытаны на стерильность, была проведена оценка их воздействия на гуморальный и клеточный иммунитет.

Острую токсичность изучали на белых крысах-самцах. Препарат вводили животным в желудок. Были испытаны дозы - 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 и 6,0 г/кг. Расчет доз проводили на 100% лекарственную форму.

Данные смертельного эффекта использовали для определения смертельных параметров - ЛД₁₆, ЛД₅₀ и ЛД₈₄, величин отношения смертельных доз (ЛД₈₄/ЛД₁₆), а также среднего времени гибели - TL₅₀.

Полученные результаты свидетельствует о том, что образцы препарата по токсичности относятся к умеренно токсичными препаратами - 3 класс опасности (ГОСТ 12.1.007-76. «ССБТ Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности», М., 1976).

У животных, получавших смертельные дозы, наблюдали клиническую картину интоксикации. На следующие сутки после введения образцов препарата у опытных мышей наблюдали нарушение координации движения, шаткость походки, вскоре животные впадали в кому. На 4-6 сутки часть из них погибла.

Для суждения о скорости развития интоксикации определяли время гибели 50% животных (ЕТ₅₀). Для определения ЕТ₅₀ также использовали результаты острого опыта.

Из уровня техники известно, что величина ЕТ₅₀ характеризует индивидуальную чувствительность животных к действию данного вещества в дозах ниже и выше смертельной и является простым и довольно объективным методом оценки способности препарата кумулировать в организме (Красовский Г.Н., Егорова Н.А. и др. Среднее время гибели животных как параметр для прогнозирования хронической токсичности веществ. Кн. Актуальные вопросы экологической токсикологии. М., 1978, с. 44-76).

После обработки полученных данных установлено, что ЕТ₅₀ для образцов препарата составила 4,9 суток (118 часов), что свидетельствует о том, что препарат способен активно кумулировать в организме животных.

Иммунотоксические и аллергенные свойства препарата изучали согласно Методическим рекомендациям (Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, Москва, 2000).

Оценку гуморального и клеточного иммунитета проводили на белых беспородных мышах.

Оценку гуморального и клеточного иммунитета проводили на основе тестирования способности организма мышей к выработке антител против тест-антигена при введении испытуемого препарата и реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Клеточный иммунитет изучали в реакции гиперчувствительности замедленного типа при введении в качестве антигенов эритроцитов барана, гуморальный - путем определения числа антителообразующих клеток после иммунизации эритроцитами барана.

Проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что препарат не оказывает как стимулирующего, так и ингибирующего действия на клеточный иммунитет животного. Об этом свидетельствует тот факт, что индекс реакции в контрольной и опытной группах не имел достоверных различий. Установлено также отсутствие влияния препарата на гуморальный иммунитет в реакции локального гемолиза. Препарат вызывает умеренное усиление клеточной реакции формирования гиперчувствительности замедленного типа и не обладает токсическим действием на клетки иммунной системы, функционирование которых обеспечивает развитие гуморальных реакций. Таким образом, препарат не обладает иммунотоксическим действием.

Оценку раздражающего действия препарата проводили методом накожной и конъюнктивальной проб на кроликах породы шиншилла.

Установлено, что препарат после 20 ежедневных накожных аппликаций не вызывает каких-либо изменений кожного покрова, а однократная инсталляция препарата в конъюнктивальный мешок также не вызывает ответной реакции.

Таким образом, препарат не оказывает раздражающего действия на кожу кроликов и не влияет на слизистые оболочки глаз.

По результатам эпикутанного тестирования, внутрикожной и конъюнктивальной проб, реакции дегрануляции тучных клеток и содержанию эозинофилов можно сделать вывод об отсутствии у препарата аллергенных свойств.

Для определения стерильности использовали жидкую среду Сабуро и тиогликолевую среду. Исследования проводили прямым посевом в питательные среды. Среды с посевами инкубировали при t 37°С – тиогликолевую среду и 25°С - Сабуро в течение 5 суток. По истечении 5 суток повели пересев с тиогликолевой среды на МПА, с жидкой среды Сабуро - на плотную среду Сабуро.

Полученные по примерам 1-6 образцы препарата являются стерильными: после инкубирования посевов на МПА в течение 24 часов при 37°С рост микроорганизмов отмечен не был; помутнения питательных сред отмечено не было; после инкубирования посевов на МПА в течение 24 часов при 37°С рост микроорганизмов отмечен не был; на плотной среде Сабуро рост дрожжеподобных и плесневых грибов отсутствовал.

Таким образом, полученный по заявленному способу препарат удовлетворяет требованиям стерильности.

Пример 8

Образцы препарата, полученные по примерам 1-6, были исследованы на скорость высвобождения активных веществ in vitro.

В результате исследования установлено, что все образцы обладают замедленной скоростью высвобождения активных веществ. Минимальной же скоростью высвобождения активных веществ обладает образец, полученный по примеру 2.

Данный образец был использован для дальнейших исследований и изучения фармакокинетики празиквантела и ивермектина.

Результаты анализа содержания ивермектина и празиквантела в сыворотке крови овец показывают, что ивермектин всасывается в системный кровоток с относительно постоянной скоростью, и его концентрация достигает максимума через 48 часов. Затем концентрация ивермектина постепенно понижается. Анализируя полученные средние концентрации ивермектина в сыворотке крови овец, можно отметить, что наличие полимера в препарате способствует поддержанию концентрации ивермектина на уровне, превышающем минимальную эффективную концентрацию, до 25 суток. Максимальную же концентрацию празиквантела в сыворотке крови овец наблюдали приблизительно через 8 часов. Как известно, празиквантел достаточно интенсивно метаболизируется в печени и почках животных до гидроксилированных производных и выводится в виде метаболитов, часть из которых являются конъюгатами с глюкуроновой кислотой и/или серной кислотой. Однако, суммируя полученные результаты элиминации празиквантела, как исходного соединения, из организма овец, можно сделать вывод о том, что при данном пути введения празиквантел возможно отнести к «долгоживущим» соединениям.

Таким образом, хорошая биодоступность ивермектина и празиквантела, а также длительная элиминация остаточных количеств активных веществ из организма овец обеспечивают присутствие необходимых противопаразитарных концентраций в организме животного на протяжении продолжительного периода времени, что в свою очередь обусловливает высокие противопаразитарные свойства препарата.

Препарат применяется крупному рогатому скоту, овцам для лечения и профилактики нематод озов: диктиокаулеза, трихостронгилятоза, аскаридатоза, буностомоза, телязиоза, а также для лечения и профилактики гиподерматоза, эстроза, псороптоза, саркоптоза, сифункулятоза, маллофагоза и для борьбы с падальными и мясными мухами.

Изложенное выше позволяет сделать вывод о том, что заявленный способ позволяет сократить потерю активных веществ во время производства и получить эффективный препарат пролонгированного действия для обработки животных против широкого спектра паразитарных инфекций.