Результат интеллектуальной деятельности: Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и предназначено для исследования вне- и внутриклеточной локализации амилоида в тканях, а также жидких средах.

Известен флуоресцентный способ выявления растворенных в воде фибрилл амилоида с помощью бензантрона (3-морфолино-7Н-бензо[de]антрацен-7-он) (Gorbenko G., Trusova V., Kirilova Ε., Kirilov G., Kalnina I., Vasilev Α., Kaloyanova S., Deligeorgiev T. New fluorescent probes for detection and characterization of amyloid fibrils // Chemical Physics Letters. - 2010. - Vol. 495. - P. 275-279).

Недостатками данного способа являются то, что этот препарат не апробирован на гистологических срезах, не производится в промышленных масштабах для лабораторного использования и не лицензирован. Как антраценовое производное 3-морфолино-7Н-бензо[de]антрацен-7-он возможно является канцерогеном, что исключает возможность его использования как лекарственного средства.

Известен способ гистохимического определения амилоида с помощью красителя Конго красный [по Н.Н. Benhold (1923), в кн.: Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969. 646 с]. Недостатком данного способа является низкая информативность, заключающаяся в отсутствии возможности получения количественного результата.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является диагностический способ флуоресцентного выявления амилоида в гистологических срезах органов людей, умерших от амилоидоза, с помощью окрашивания срезов тиофлавином Т, либо S (Bums J., Pennock C.A., Steward P.J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine Τ // Journal of pathology and bacteriology. - 1967. - Vol.94. - P. 337; Bancroft J.D., Stevens A. Theory and practice of histological techniques Ed. 2 / Churchill Livingstone. - Edinburgh & London, 1982 UK.), который заключается в том, что парафиновые срезы органов, зафиксированные в 10% формалине, предварительно окрашивают железным гематоксилином, после чего докрашивают 1% раствором тиофлавина Τ или S.

Докрашенные срезы подкисляют в растворе лимонной кислоты, высушивают, заделывают в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопируют на флуоресцентном микроскопе. При окрашивании тиофлавином Τ амилоид выглядит как зелено-коричневые флуоресцирующие объекты (рисунки 1а, 1б). Например, на рис. 1а изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочке (Кл), канальцах (Кн) и цитоплазме эпителия канальцев (Э) (объектив 40^х), а на рис. 1б - свечение амилоидных депозитов в клубочке, после окрашивания тиофлавином Т.

На препаратах почки амилоидные депозиты в просвете канальцев и растворенные в цитоплазме эпителия канальцев выглядят как ярко-зеленые практически однородные объекты. В стенках сосудов и между капиллярными петлями почечных клубочков амилоид светится менее интенсивно коричневатым оттенком. Участки тканей, не содержащие амилоид, выглядят темно-зелеными, практически черными. Клеточные ядра дифференцируются как округлые несветящиеся объекты.

При замерах интенсивности свечения с помощью фотоумножителя максимум флуоресценции тиофлавина приходился на 534 нм. Интенсивность свечения интактных и пораженных амилоидом тканей приведена в таблице 1. Высокий размах вариационного ряда свидетельствует о том, что интенсивность флуоресценции амилоида, меченого тиофлавином, значительно различается в разных участках ткани почки, что может свидетельствовать о наличии концентрационной зависимости.

Этот же способ используется для выявления амилоида в биологических средах (плазма крови, спинно-мозговая жидкость) больных людей, а также изучения амилоида in vitro, как выделенного из тканей больных людей или животных, так и искусственно приготовленных из белков-амилоидогенов (Козлов В.А., Сапожников С.П., Шептухина А.И., Голенков А.В. Сравнительный анализ различных моделей амилоидоза // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2015. - №1. - С. 5-11; Сулацкая А.И., Волова Е.А., Комиссарчик Я.Ю., Снигиревская Е.С., Маскевич Α.Α., Дробченко Е.А., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. Исследование кинетики образования амилоидных фибрилл на основе инсулина // Цитология. - 2013. - Ν 11. - С.809-814).

Недостатком данного способа является дороговизна тиофлавинов (стоимость 25 г составляет 3318,16 руб., http://www.zymophore.ru/), они не производятся в Российской Федерации и закупаются за рубежом.

Задачей изобретения является расширение ассортимента препаратов со свойствами окрашивания гистологических срезов для оценки интенсивности амилоидогенеза, которые могут заменить дорогостоящий тиофлавин.

Технический результат - повышение экономичности за счет пониженной стоимости препаратов, информативности за счет увеличенной контрастности рельефа поверхности.

Технический результат достигается тем, что способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида, включающий фиксирование срезов ткани органов в 10%-ном формалине, окрашивание флуоресцентным красителем, промывку водой, обезвоживание, заделку в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопирование на флуоресцентном микроскопе согласно изобретению, в качестве флуоресцентного красителя используют производные 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.1¹⁷.0^2.6]дец-8-енов формулы

где Y=2-NO₂, 3-NO₂, 4-NO₂, 3-COOH, 4-COOH, а окрашивание осуществляют 1,5% спиртовым раствором красителя, смешанным с 1% водным раствором гидроксида натрия в соотношении 1:1.

Сущность способа флуоресцентного гистологического выявления амилоида заключается в следующем.

На основе представлений о супрамолекулярном неферментативном взаимодействии амилоида с известными флуоресцентными зондами тиофлавином Т (Сулацкая А.И. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик красителя: автореф. дис. … докт.биол. наук / А.И. Сулацкая; Институт цитологии РАН. - Санкт-Петербург, 2013. - 22 с. ) и конго-красным (Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. Quantitative evaluation of Congo red binding to amyloid like proteins with a pleated sheet conformation // J. Histochem. and Cytochem. - 1989. - Vol.37. - N 1273. 1281) осуществлен синтез производных 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.^1.7.0^2.6]дец-8-енов формулы (1a-д), перспективных как флуоресцентные зонды, селективных к амилоиду.

Синтез исследуемых веществ (1a-д) осуществляли взаимодействием легкодоступных N-арил-2,5-дигидропиррол-2,5-дионов с фуран-2-карбальдегидом при эквимольном соотношении реагентов при комнатной температуре. В качестве растворителя использовали абсолютный 1,4-диоксан. Чистоту синтезированных продуктов контролировали по данным тонкослойной хроматографии, а структуру подтверждали методами ИК, ЯМР ¹Н-спектроскопии.

Соединения (1a-д) представляют собой кристаллические вещества светло-желтого или оранжевого цвета, константы и данные элементного анализа которых приведены в таблице №2.

Флуоресцентные свойства апробированных веществ (1a-д), имеющих, подобно тиофлавину Т, строение молекулярного ротора, в сухом кристаллическом виде проявлялись при возбуждении ультрафиолетом в видимом диапазоне 421-435,5 нм. Ни спиртовой, ни водно-спиртовой растворы этих веществ в диапазоне концентраций от 0,75% до 1,5% регистрируемой с помощью ФЭУ-39 флуоресценции не обнаруживали.

Примеры выполнения способа.

Пример 1

Эксперименты проведены на 5 мкм парафиновых срезах почек человека с ранее клинически установленным и гистологически подтвержденным диагнозом амилоидоза. Обезличенные препараты были предоставлены «Республиканским бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Чебоксары. Депарафинированные срезы были предварительно окрашены гематоксилином, а затем в течение 3 мин дополнительно обработаны водно-спиртовыми растворами любого из производных 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло-[5.2.1^1.7.0^2.6]дец-8-енов формулы (1а-д). Водно-спиртовые растворы были получены следующим путем. Вначале соединения формулы (1а-д) растворяли в 96% спирте с получением спиртового раствора 1,5% концентрации, а затем к полученному раствору добавляли 1% водный раствор гидроксида натрия в соотношении 1:1 по объему. Конечная концентрация препаратов (1а-д) в полученном водно-спиртовом растворе составляла 0,75%, а среда такого раствора щелочная (рН>7). После окрашивания срезы были промыты водой, обезвожены и заделаны в полистирол.

Микроскопию срезов осуществляли на микроскопе «Люмам-4». Флуориметрию осуществляли с помощью микролюминиметра ФМЭЛ-1А, запирающий светофильтр ЖС18, λ_{возбужд.}=410 нм, светофильтры ФС, БС, СЗС. Электрические параметры на всех замерах определялись следующими параметрами: входное напряжение 900 В, сопротивление усилителя 10⁶ Ом. В насадке был установлен зонд 0,5. Для измерения использовали ФЭУ-39, показания снимали с цифрового вольтметра, данные представлены в милливольтах (мВ). Микрофотографии получены с помощью цифровой камеры Levenhuk С800 NG 8М, USB 2.0.

На окрашенных препаратах максимум флуоресценции наблюдался при 534 нм.

После обработки парафиновых срезов амилоидной почки подщелоченными водно-спиртовыми растворами всех исследуемых веществ структуры (1a-д) наблюдалось интенсивное зеленое свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцевых структурах (рисунки 2а-2д, объектив 40^х). Например, на рис. 2а изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцевых структурах, после окрашивания препаратом (1а); на рис. 2г изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцах, после окрашивания препаратом (1г); на рис. 2д изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцах, после окрашивания препаратом (1д).

Меньшее по интенсивности свечение обнаруживалось в клубочках с хорошо выявляемым париетальным листком капсулы и темно-зелеными депозитами амилоида, расположенными между петель клубочка, эпителия канальцев и эндотелии артериол. Например, на рис. 2а¹ изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1а); на рис. 2б изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1б); на рис. 2в изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1в).

Обнаруживаемое свечение равномерно располагалось в цитоплазме клеток. Клеточные ядра выглядели как темные нефлуоресцирующие овальные объекты. Интенсивность флуоресценции депозитов в канальцах различается на порядок, что может быть обусловлено количественными различиями содержания амилоида на разных участках срезов (таблица 3).

Как следует из данных, представленных в таблице, интенсивность флуоресценции исследуемых препаратов (1а-д) значительно не различается, что объясняется близостью их химического строения.

При применении соединений (1а-д), по сравнению с окраской тиофлавином Т, увеличивается информативность окраски за счет увеличенной контрастности рельефа поверхности. Кроме того, при окрашивании тиофлавином необходима инкубация срезов в 1% растворе лимонной кислоты, что необходимо для возбуждения флуоресценции тиофлавина. Тогда как в заявленном способе окрашивания необходимости в такой обработке нет. Поскольку рН растворов красителей, приготавливаемых по заявленному способу, имеет щелочную реакцию, то он более физиологичен, поскольку нативные (живые) ткани имеют рН≥7,37 (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник / Под. ред. акад. АМН СССР С.С. Дебова. - 2-е изд., перераб. и доп.- М.: Медицина, 1990. - 528 с, С. 452-455. ISBN 5-225-01515-8). Данное обстоятельство должно способствовать большей сохранности гистологических срезов, чем при их обработке кислотами.

Заявленный способ позволяет селективно локализовать амилоид как свободно расположенный в межклеточном пространстве, так и внутриклеточно, а также в жидких средах и может быть использован в судебно-медицинской экспертизе, клинической диагностике амилоидоза, экспериментальной биологии и медицине.