Способ приготовления биологически активной субстанции на основе вермикультуры

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии, в r частности способу получения биологически активной субстанции на основе тканей красного калифорнийского дождевого червя (Eisenia foetidae).

Полученная биологически активная субстанция на основе тканей красного калифорнийского червя включает широкий перечень биологически активных веществ, оказывающих иммуномодулирующий и противовоспалительный эффекты.

Уровень техники

Одним из активно развивающихся направлений современной биологии и медицины является получение и изучение биологически активных веществ из сырья природного происхождения. В настоящее время мировая наука в качестве источника природного сырья для получения биологически активных веществ обращает внимание на вермикультуру различных видов земляных червей, в частности красного калифорнийского червя Eisenia foetida.

Развитие биотехнологии интенсифицировало исследование фармакологических эффектов вермикультур. Исследования, посвященные земляным червям, выявили наличие в их организмах разнообразных биологически активных агентов, которые могут быть использованы как основа для создания фармакологических препаратов. Эти вещества проявляют различные типы биологической активности, такие как антикоагуляционную, противомикробную, фибринолитическую, противоопухолевую. Таким образом, биологически активные вещества, получаемые из вермикультур червей, могут использоваться для лечения различных заболеваний (Cooper E.L. et al., 2012).

Целомоциты земляных червей синтезируют и секретируют иммунопротективные вещества, вызывающие агглютинацию, опсонизацию и последующий лизис антигенов. Кроме того, молекулы этих веществ принимают участие в реакциях коагуляции и фенолоксидазном каскаде (Mohrig W. et al., 1996; Cooper E.L. et al., 2002).

Гликопротеиды под названием лектины, содержащиеся в земляных червях, - важнейший элемент процесса агглютинации. Протеазы земляных червей являются крайне важным фактором для иммунной системы, принимая во внимание их участие в разрушении антигенов ( К., Cerenius L., 1998).

Земляные черви являются многообещающим источником биологически активных соединений и фибринолитических энзимов. Так, некоторые виды земляных червей, в том числе Lumbricus rubellas и Eisenia foetida, являются доказанным источником сильнодействующих и безопасных для организма фибринолитических энзимов, проявляющих клинически подтвержденный терапевтический и профилактический эффект в отношении тромбозных заболеваний (Nakajima N. et al., 1993; М. et al., 1993; М. et al., 2005; P. et al., 2006; et al., 2011).

Противоопухолевый эффект макромолекул, полученных из земляных червей, был показан в исследованиях in vitro и in vivo против клеток гепатомы и гепатоцеллюлярной карциномы, была выявлена индукция апоптического процесса ( М. et al., 1993; Chen Н. et al., 2001; YuanL. et al., 2004; Sherman M., Chen H. et al., 2007).

Кроме того, были выявлены противовоспалительный и регенеринстимулирующий эффекты, а также антибактериальная активность экстрактов земляных червей (Stein Е. et al., 1982; Valembois P. et al., 1982; Hirigoyenberry F. et al., 1990; Milochau A. et al., 1997).

Исследования различных авторов выявляют также и другие биологические функции целомической жидкости земляных червей. В их число входят бактериостатическая ( М. et al., 2005), протеолитическая (Nakajima F. et al., 1993), цито- и гемолитическая ( P. et al., 2006; M. et al., 2011) и митогенная активность ( M. et al., 1993).

Вышеперечисленные данные позволяют сделать вывод об обширных перспективах терапевтического применения биологически активных макромолекул, получаемых из земляных червей.

Известен способ получения мази для лечения инфицированных ран, который заключается в том, что она содержит экстракт биомассы красного навозного, красного калифорнийского червей вида Eisenia foetidae, а в качестве мазевой основы - полиэтиленоксид 400 и 1500, образованные сплавлением их при температуре 35-41°С при соотношении 7:3 (см. патент на изобретение РФ 2180574, кл. A61K 35/56).

Недостатком данного способа является ограниченность области применения и отсутствие информации о способе получения экстракта.

Известна питательная среда для культивирования гетеротрофных бактерий. Среда для культивирования гетеротрофных бактерий содержит в качестве белковой основы красных калифорнийских червей 90-100 г, пептон 9-11 г, хлористый натрий 4-5 г, агар-агар 18-20 г, дистиллированная вода до 1 л. Изобретение обеспечивает простоту приготовления, доступность субстрата высокопитательными свойствами и низкой стоимостью (см. патент на изобретение РФ 2276188, кл. C12N 1/20).

Недостатком данного способа является отсутствие иммунотропного действия.

Известен энтеральный препарат, содержащий экстракт биомассы красного калифорнийского дождевого червя Eisenia foetidae в виде таблеток «Вермин». Сущность изобретения: предлагаемая таблетированная форма препарата содержит в качестве активного компонента экстракт биомассы красного калифорнийского дождевого червя при следующем соотношении масс в граммах на одну таблетку весом 0,200 г: экстракт биомассы красного калифорнийского дождевого червя Eisenia foetidae 0,010-0,020, целлюлоза микрокристаллическая 0,187-0,177, кальция стеарат или магния стеарат 0,001, крахмал картофельный или кукурузный 0,002. Технический результат: расширение ассортимента средств для лечения и профилактики иммунодефицитных состояний различного генеза (см. патент на изобретение РФ 2177784, кл. A61K 9/00, A61K 35/00).

Недостатком данного способа является отсутствие информации о способе получения экстракта и высокая себестоимость.

Известен способ производства белково-витаминной кормовой муки из гибрида красного калифорнийского дождевого червя и вермикомпостированных яблочных выжимок. Способ производства кормовой муки включает введение дождевых червей в субстрат из яблочных выжимок, вермикомпостирование, последующую сушку и измельчение. Измельченный субстрат, увлажненный до 80-90%, размещают буртами на открытых площадках при температуре не ниже 15°С или в отапливаемом помещении, заселяют червями и вермикомпостируют в течение 20 суток. Сушат червей и вермикомпост, конвективным методом в течение 2 часов при температуре 21° и в течение 2 часов при температуре 24-27° в вакууме. Полученную сухую массу измельчают на мельнице до размера частиц 0,02-0,03 мм. Использование заявленного изобретения позволит получить кормовую добавку с высокой питательной ценностью (см. патент на изобретение РФ 2470521, кл. A23K 1/00).

Недостатком данного способа является отсутствие иммунотропного действия.

Известен способ производства сухого порошка из дождевых червей, который включает стадии: нахождение живых дождевых червей на свету, удаление образованных на их коже наносов, контакта дождевых червей с органической кислотой и/или водным раствором органической кислоты, промывка дождевых червей водой, измельчение живых дождевых червей в гомогенат, лиофилизация гомогената и термообработка высушенного продукта при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет получить стерилизованный продукт из дождевых червей с сохраненной ферментативной активностью (см. патент на изобретение РФ 2438681, кл. A61K 35/56).

Недостатком данного способа приготовления препарата является малый выход действующих веществ, отсутствие иммунотропного действия.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ получения сухого порошка из дождевых червей, согласно которому червей помещают в водный раствор органических кислот (например - янтарной кислоты), затем промывают червей водой, измельчают, замораживают полученный гомогенат при температуре от -60 до -100°С, полученный гомогенат лиофильно высушивают. Вышеописанный способ позволяет получить субстанцию для приготовления антигиперлипедимических, антидиабетических, гипотензивных и антигипотензивных средств (см. патент на изобретение US 5024844 А).

Недостатком данного способа приготовления препарата является наличие в субстанции большого количества высокомолекулярных балластных компонентов, отсутствие иммунотропного действия и противовоспалительного эффекта.

Раскрытие изобретения

Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого способа, сводится к иммуномодуляции организма, получению более стабильного низкомолекулярного и эффективного иммунотропного средства с противовоспалительным эффектом.

Технический результат достигается с помощью способа приготовления низкомолекулярной биологически активной субстанции на основе вермикультуры, включающего промывку червей водой, контакт с водным раствором органической кислоты, охлаждение при температуре 2-4°С, заморозку, оттаивание, гомогенизацию под высоким давлением, лиофилизацию, при этом предварительно живых червей помещают в холодильную камеру при температуре 2-4°С на 72 часа, в качестве органической кислоты используют 0,5% янтарную кислоту, залитых кислотой червей охлаждают при температуре 2-4°С в течение 12 часов, затем червей с кислотой помещают на 24 часа в низкотемпературный холодильник при температуре минус 38-40°С, после оттаивают при температуре 2-6°С 12 часов, затем измельчают в блендере и фильтруют трехкратно через ватно-марлевый фильтр, полученный фильтрат гомогенизируют под высоким давлением с использованием гомогенизатора высокого давления при 1000 бар трехкратно, после чего доводят рН экстракта до 7,0-7,2, смешивают с сахарозо-желатиновой защитной средой, автоклавируют и подвергают лиофилизации.

Сущность способа приготовления низкомолекулярной биологически активной субстанции на основе вермикультуры заключается в следующем.

Проводят отбор красных калифорнийских червей в закрытую емкость и помещают в холодильную камеру на 72 часа, затем их промывают под проточной водой и помещают в 0,5% янтарную кислоту - одна часть червей к десяти частям кислоты - и охлаждают при температуре 2-4°С в течение 12 ч. Затем червей с кислотой помещают на 24 часа в низкотемпературный холодильник при температуре минус 38-40°С и оттаивают при температуре 2-6°С 12 часов, затем измельчают в блендере и фильтруют трехкратно через ватно-марлевый фильтр, гомогенизируют с использованием гомогенизатора высокого давления при 1000 бар трехкратно, определяют рН экстракта и добавляют регулятор кислотности - 1,5%-ный водный раствор бикарбоната натрия - в таком количестве, чтобы рН экстракта составлял 7,0-7,2, смешивают с сахарозо-желатиновой средой в соотношении 1 часть экстракта и 1 часть среды, автоклавируют при 120°С 30 мин. Затем полученный раствор замораживают при минус 38-40°С 72-144 часа и подвергают лиофилизации 20-30 часов.

Примеры конкретного выполнения опытов приготовления низкомолекулярной биологически активной субстанции на основе вермикультуры.

Пример 1. Проводят отбор красных калифорнийских червей в закрытую емкость и помещают в холодильную камеру на 72 часа, затем их промывают под проточной водой и помещают в 0,5% янтарную кислоту - одна часть червей к десяти частям кислоты и охлаждают при температуре 2-4°С в течение 12 часов, затем червей с кислотой помещают на 24 часа в низкотемпературный холодильник при температуре минус 38-40°С, после оттаивают при температуре 2-6°С 12 часов, затем червей с кислотой измельчают в блендере и фильтруют трехкратно через ватно-марлевый фильтр, фильтрат смешивают с сахарозо-желатиновой средой в соотношении 1 часть экстракта и 1 часть среды и автоклавируют. Затем полученный раствор замораживают при минус 38-40°С 72-144 часа и подвергают лиофилизации 20-30 часов.

Полученная субстанция обладает недостатками: малый выход продукта, высокая кислотность.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но после измельчения в блендере и фильтрования определяют рН экстракта и добавляют регулятор - кислотности 1,5%-ный водный раствор бикарбоната натрия (пищевой соды) - в таком количестве, чтобы рН экстракта составлял 7,0-7,2.

Полученная субстанция обладает недостатками: неоднородность порошка и низкая иммунотропная активность.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 2, но после измельчения в блендере и фильтрования фильтрат подвергают дополнительному наноструктурированию с использованием гомогенизатора высокого давления при 1000 бар трехкратно, а затем гомогенат смешивают с сахарозо-желатиновой средой в соотношении 1 часть экстракта и 1 часть среды и автоклавируют. Затем полученный раствор замораживают при минус 38-40°С 72-144 часа и подвергают лиофилизации 20-30 часов.

Полученная субстанция при данных параметрах содержит комплекс низкомолекулярных компонентов, обладает стабильностью, широким перечнем биологически активных веществ и высоким иммуномодулирующим и противовоспалительным эффектом.

Исследования по оценке иммуномодулирующей и противовоспалительной активности субстанции, приготовленной согласно примеру 3, были проведены на самцах белых крыс линии Вистар в возрасте 9 месяцев. Животные содержались в виварии в стандартных условиях, на стандартной виварной диете со свободным доступом к воде. Температура воздуха в помещении составляла плюс 20…22°с, влажность воздуха - 40-45%, цикл освещения 12:12.

Все эксперименты на животных были выполнены согласно Директиве ЕС 86/609/ЕЕС и в соответствии с законодательством Российской Федерации, регулирующим проведение экспериментов на животных.

Оценка иммунотропной активности субстанции на основе вермикультуры.

Животные в количестве 40 были рандомизированы и разделены на две группы по 20 животных в каждой группе. Группа I служила интактным контролем. Животным группы II (опытная группа) скармливали биологически активную субстанцию на основе вермикультуры в дозировке 6 мг/кг живой массы в течение 10 дней.

На десятый день эксперимента посредством прямой сердечной пункции с применением эфирной анестезии были забраны образцы крови. Был произведен общий анализ крови с применением гематологического анализатора Abacus junior.

Небольшие доли селезенки и тимуса были забраны и зафиксированы в 10%-ном нейтральном формалине. После нескольких этапов дегидратации в спиртах восходящей плотности, с образцов ткани были сделаны срезы толщиной 5-7 мкм, впоследствии окрашенные гематоксилином и эозином. На представленных срезах был проведен гистопатологический анализ.

Посредством анализатора изображений «Videotest» на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, была определена площадь долек тимуса и соотношение белой и красной пульпы селезенки. Соотношение белой и красной пульпы селезенки определялось по формуле:

S_кр=S_общ-S_бел,

где S_кр - площадь красной пульпы селезенки;

S_общ - площадь поля зрения под текущим увеличением;

S_бел - площадь белой пульпы селезенки.

Все подсчеты проводились в 10 полях зрения для каждого гистологического образца печени с последующим вычислением среднего значения.

Гематологические параметры крыс контрольной и опытной групп находились в пределах возрастной нормы. Однако было выявлено увеличение количества эритроцитов - 8,72±0,39×10⁹/л в крови животных опытной группы против 7,53±0,35×10⁹/л в контрольной группе.

В то же время уменьшилось содержание гемоглобина в эритроците в сравнении с контрольной группой. В контроле этот показатель составлял 20,28±0,96 (fmol/pg), тогда как в экспериментальной группе он был равен 17,84±0,54 (fmol/pg).

Применение биологически активной субстанции на основе вермикультуры привело к увеличению числа лейкоцитов в крови крыс опытной группы до 12,44±1,80×10⁹/л в сравнении с 8,30±0,87×10⁹/л в крови животных контрольной группы. Число лимфоцитов крови животных контрольной группы составило 4,18±0,11×10⁹/л, гранулоцитов - 3,12±0,45×10⁹/л, в то время как содержание аналогичных клеток в крови животных опытной группы было существенно выше - 4,45±0,30×10⁹/л и 6,47±0,15×10⁹/л соответственно.

Результаты морфометрических исследований свидетельствуют об увеличении площади белой пульпы селезенки с 25,73±4,31% в контроле до 41,83±1,90% у экспериментальных животных. Кроме того, наблюдалась интенсивная инфильтрация паренхимы селезенки клетками белой крови, в частности макрофагами и плазматическими клетками.

В это же время выявлено увеличение площади долек тимуса с 561,0±15,1 мкм² в тимусе контрольных животных до 638,0±24,5 мкм² в тимусе животных опытной группы. В тимусе крыс экспериментальной группы, в отличие от контроля, выявлена артериальная гиперемия и лимфоидный инфильтрат вокруг сосудов, а также хорошо выраженная граница между корковым и мозговым веществом.

При применении субстанции у животных в нормальном состоянии наблюдается увеличение числа эритроцитов против снижения гематокрита в пределах стандартных величин и снижения среднего уровня содержания гемоглобина в одном эритроците, что свидетельствует о стимуляции эритропоэза и о выходе в кровь значительного числа молодых эритроцитов; снижение гематокрита может свидетельствовать также о повышении содержания неклеточных компонентов в плазме, в частности белков крови (альбумины, глобулины и т.д.).

Кроме того, за счет как гранулоцитов, так и лимфоцитов увеличивается общее количество лейкоцитов в крови. Изменения в параметрах белой крови здоровых животных при скармливании субстанции свидетельствует о его иммунотропном влиянии.

Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать вывод, что биологически активная субстанция на основе вермикультуры обладает выраженным иммунотропным эффектом, что выражается в стимулирующем действии на ткани тимуса и селезенки.

Оценка противовоспалительной активности субстанции на основе вермикультуры.

Изучение противовоспалительной активности субстанции на основе вермикультуры проводили на модели формалин-индуцированного воспаления у крыс. У животных контрольной (n=12) и опытной (n=16) групп воспроизводилась острая воспалительная реакция путем субплантарного введения 0,1 мл 2% водного раствора формалина в левую заднюю лапу.

Животным опытной группы скармливали биологически активную субстанцию на основе вермикультуры в дозировке 6 мг/кг живой массы за 1 час до инъекции формалина и 1 раз в сутки в последующие дни исследования.

Величину воспалительного отека измеряли онкометрическим методом по изменению объема конечности животных непосредственно перед инъекцией формалина, а также через 3 часа после введения и на 2-й, 3-й, 4-й и 5-й день эксперимента. Воспалительную реакцию также оценивали по гематологическим показателям.

Через 3 часа после субплантарного введения формалина у крыс развивался выраженный отек пораженной конечности, объем которой увеличился от исходного состояния на 60% в контрольной группе и на 37% в опытной.

Выраженность уменьшения местных признаков индуцированного воспаления в динамике 2-5 дней относительно исходного объема конечности в контрольной группе животных составила 137±8,8%, 128±6,4%, 125±6,8%, 121±6,4%, соответственно. В опытной группе животных, которые получали биологически активную субстанцию на основе вермикультуры, изменение объема воспаленной конечности составило 120±5,9%, 110±5,2%, 108±5,1%, 103±2,8%.

Анализ гематологических показателей свидетельствовал о развитии в организме всех экспериментальных животных, которым вводился формалин, выраженной воспалительной реакции, в частности снизилось количество эритроцитов в среднем на 52,58% и гематокрит на 66,01%, а также достоверно повысились показатели среднего содержания и концентрации гемоглобина в эритроцитах, что свидетельствует о массовой гибели эритроцитов в результате действия факторов воспаления и выходе новых клеток из депо крови. Кроме того, наблюдается увеличение общего количества лейкоцитов в среднем на 10,11% за счет гранулоцитов, что классически соответствует первичной иммунной реакции.

Использование субстанции на основе вермикультуры животным с острым течением воспалительной реакции привело к увеличению общего количества гемоглобина на 5,8%, и количества гемоглобина в эритроците на 7,87%, это связано с усилением защитно-компенсаторной реакцией организма. Кроме того, анализируя показатели белой крови, выявлено снижение в пределах нормативных показателей общего количества лейкоцитов на 18,1% в основном за счет снижения гранулоцитов на 15% и количества клеток, относящихся к пулу, объединяющему моноциты, базофилы и эозинофилы (MID, 10⁹/л) на 26,49%, что может свидетельствовать о противовоспалительном действии исследуемой субстанции. При использовании субстанции животным с острым воспалением наблюдается увеличение количества тромбоцитов на 13,4%, повышается тромбокрит на 17,61% и средний объем тромбоцита на 3,45%, что может свидетельствовать о стимулирующем действии субстанции на выработку интерлейкинов оказывающих стимулирующее действие на мегакариоциты.

Анализ гематологических показателей при подостром течении воспаления на фоне применения изучаемой субстанции характеризуется повышением количества эритроцитов на 0,68×10¹²/л при снижении их количества в контрольной группе, а также увеличением количества гемоглобина в одном эритроците на 4,23 пг, это свидетельствует о более быстром восстановлении эритроцитарного звена и снижение воспалительной реакции. Об этом же свидетельствует менее резкая динамика повышения количества лейкоцитов в процессе течения воспалительного процесса, так в контрольной группе их количество повысилось до 14,10±1,10×10⁹/л, а в опытной группе до 10,68±0,86×10⁹/л. Повышение количества лейкоцитов на этапе подострого течения воспалительной реакции в обеих группах происходило в основном за счет лимфоцитов. При изучении особенностей реакции тромбоцитов крови на применение субстанции при подостром течении воспалительной реакции наблюдается снижение количества тромбоцитов по сравнению с контрольной группой на 29,64%, одновременно с повышением тромбокрита на 57,25% и снижением среднего объема тромбоцита на 9,8%, что также свидетельствует о снижении воспалительной реакции в опытной группе по сравнению с контролем.

Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать вывод, что полученная согласно примеру 3 биологически активная субстанция на основе вермикультуры обладает противовоспалительной активностью.

Источники информации

1. Патент РФ №2177784. Энтеральный препарат, содержащий экстракт биомассы красного калифорнийского дождевого червя eisenia foetidae в виде таблеток «Вермин» / В.Ф. Петров, Г.М. Сафонова, М.Г. Хилько, М.Р. Закиров. - Опубл. 10.01.2002.

2. Патент РФ №2180574. Мазь для лечения инфицированных ран / О В.Ф. Петров, Г.М. Сафонова, Е.Н. Перевозчикова, Л.К. Коростелева. - Опубл. 20.03.2002.

3. Патент РФ №2276188. Питательная среда для культивирования гетеротрофных бактерий / О.Ф. Вятчина, Н.Е. Буковская, Т.В. Завезенова, Д.И. Стом, Н.А. Черных. - Опубл. 10.05.2006.

4. Патент РФ №2438681. Способ производства сухого порошка из дождевых червей / Й. Исии, К. Исии, X. Суми, Е. Йосида, С. Исии. - Опубл. 10.01.2012.

5. Патент РФ №2470521. Способ производства белково-витаминной кормовой муки из гибрида красного калифорнийского дождевого червя и вермикомпостированных яблочных выжимок / О.В. Ириков, Ю.И. Забудский. - Опубл. 27.12.2012.

6. Chen Н, Takahashi S, Imamura М, Okutani Е, Zhang Z, Chayama K, et al. Earthworm fibrinolytic enzyme: anti-tumor activity on human hepatoma cells in vitro and in vivo. Chin. Med. J. 120: 898-904, 2007.

7. Cooper EL, Balamurugan M, Huang CY, Tsao CR, Heredia J, Tommaseo-Ponzetta M, et al. Earthworms dilong: Ancient, inexpensive, noncontroversial models my help clarify approaches to integrated medicine emphasizing neuroimmuno systems. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2012: 164152, 2012. (doi: 10.1155/2012/164152).

8. Cooper EL, Kauschke E, Cossariazza A. Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff. BioEssays 24: 319-333, 2002.

9. Hirigoyenberry F, Lassale F, M. Antibacterial activity of Eisenia foetida Andrei coelomic fluid: transcription and translation regulation of lysozyme and proteins evidenced after bacterial infection. Comp. Biochem. Physiol. 95B: 71-75, 1990.

10. M, Kobrehel D, Levanat S, Jurin M, T. Mitogenicity of earthworm (Eisenia foetida) insulin-like proteins. Comp. Biochem. Physiol. 104B: 723-729, 1993.

11. M, M, Micek V, M. Influence of earthworm extract G-90 on the haemostasis in Wistar rats. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 15: 71-78, 2011.

12. Milochau A, M, Valembois P. Purification, characterization and activities of two haemolytic and antimicrobial proteins from coelomic fluid of the annelid Eisenia foetida Andrei. Biochim. Biophys. Acta 1337: 123-132, 1997.

13. Mohrig W, Eue I, Kauschke E, Hennicke F. Crossreactivity of haemolytic and hemagglutinating proteins in the coelomic fluid of earthworms. Comp. Biochem. Physiol. 115A: 19-30, 1996.

14. Nakajima N, Mihara H, Sumi H. Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus. Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1726-1730, 1993.

15. M, M, T. Glycolipoprotein G-90 obtained from the earthworm Eisenia foetida exerts antibacterial activity. Vet. Arch. 75: 119-128, 2005.

16. Р, М, Felsberg J, R, Beschin A, De Baetselier P, et al. Relationship between hemolytic molecules in Eisenia foetida earthworms. Dev. Comp. Immunol. 30: 381-392, 2006.

17. Sherman M, Takayama Y. Screening and treatment for hepatocellular carcinoma. Gastroent. Clin. North Am. 33: 671-691, 2004.

18. K, Cerenius L. Role of prophenoloxidase-activating system in invertebrate immunity. Curr. Opin. Immunol. 10: 23-28, 1998.

19. Yuan L, Xu JM, Zhou YC. Effects of the purified earthworm extracts on various hemal tumor cells. Clin. Med. J. China. 11: 177-179, 2004.

20. Patent №5024844 A US Process for the production of dried earthworm powder and antihyperlipemic, antidiabetic, antihypertensive and antihypotensive preparations containing dried earthworm powder as active ingredient / Yoichi Ishii, Hisashi Mihara. - Опубл. 18.06.1991.