Результат интеллектуальной деятельности: Штамм вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота Dermatitis nodularis bovum, рода Capripoxvirus для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму нодулярного дерматита (НД) КРС, который может быть использован при разработке и производстве средств диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота.

Нодулярный дерматит (узелковый дерматит, кожно-узелковая сыпь, лоскутная болезнь кожи, кожная бугорчатка, Dermatitis nodularis bovum, Lumpy Skin Disease) - контагиозная инфекционная болезнь, характеризующаяся персистентной лихорадкой, поражением лимфатической системы, отеками подкожной клетчатки внутренних органов, образованием кожных узлов (бугорков), поражением глаз и слизистых оболочек органов дыхания и пищеварения [1, 2, 8].

Возбудитель - ДНК-содержащий оболочечный вирус, имеет антигенной родство со штаммами вирусов, вызывающих оспу у овец и коз, которые отличаются на генетическом уровне, и вместе с ним образуют самостоятельный род Capripoxvirus семейства Poxviridae [2,8].

Вирусы рода Capripoxvirus имеют кирпичеобразную форму размером 300×270×200 нм. В центре вириона находится нуклеотид, содержащий ДНК. К нему прилегают боковые тела, придающие нуклеотиду вид гантели, и наружная двухслойная оболочка. Геном состоит из 150÷160 тыс. пар нуклеотидов. ДНК не обладает инфекционностью; 88% массы вириона составляют белки, 5% - ДНК, 4% - липиды и 3% - углеводы [2].

Нодулярный дерматит относят к особо опасным болезням животных, способным вызывать эпизоотии и наносить значительный экономический ущерб. В соответствии с новой классификацией он включен в список болезней МЭБ, подлежащих обязательному уведомлению (нотификации), в категорию «Болезни и инфекции крупного рогатого скота» [3, 4, 6].

В настоящее время заболевание встречается в 34 странах Африки и Азии. По официальным сводкам МЭБ за три года (с 2013 по 2015 г.) это заболевание широко распространилось в странах Ближнего Востока. По данным национальных ветеринарных служб в 2014 г. заболевание КРС ВНД было выявлено в Турции - 230 очагов, Ливане - 32, Азербайджане и Ираке - по 16, Египте и Иране - по 6 очагов. В 2014-2015 г. болезнь была диагностирована на Кипре и в Греции [4, 6].

В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данному заболеванию. Однако в 2015 г. первые случаи нодулярного дерматита в России были зарегистрированы на территории Республики Дагестан и Чеченской Республики. Это обстоятельство указывает на то, что угроза возникновения заболевания в других регионах Северного Кавказа и его дальнейшее распространение в Российской Федерации крайне велика и может способствовать серьезным социально-экономическим последствиям для отечественного животноводства [4, 6].

В связи с этим необходимо иметь высокоэффективные диагностические препараты и средства специфической профилактики, которые в короткие сроки позволили бы идентифицировать возбудитель нодулярного дерматита и быстро купировать распространение инфекции. Это обстоятельство требует постоянных поисков новых штаммов, пригодных для изготовления средств диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита КРС.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов ВНД КРС, обладающих высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифичных биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита КРС.

Указанная задача решена получением штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 (авторское наименование), используемого для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита КРС.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма ВНД КРС/Дагестан/2015, был выделен в 2015 г. от коров, больных нодулярным дерматитом КРС на территории Республики Дагестан.

Для получения штамма ВНД КРС, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали субкультуру тестикул ягненка (ТЯ) и перевиваемую линию культуры клеток яичников домашней козы (ЯДК-04) [5], как высокочувствительные к ВНД КРС. В результате проведения серии последовательных пассажей изолята на данных культурах клеток был получен штамм ВНД КРС/Дагестан/2015, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства и пригодный для изготовления средств диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита КРС.

Накопление вируса штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 в культурах клеток ТЯ и ЯДК-04 обеспечивалось на уровне от 4,5 до 5,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 депонирован 28 марта 2016 г. в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером (ссылкой) - ВНД КРС/Дагестан/2015 (диагностический).

Сущность изобретения пояснена на графических изображениях, на которых:

Фиг. 1 - представлено положение штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 на филогенетическом древе каприпоксвирусов (дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей фрагмента открытой рамки считывания 026 (ОРС-026));

Фиг. 2 - монослой незараженной культуры клеток ЯДК-04 (контроль культуры клеток);

Фиг. 3 - клетки монослоя культуры клеток ЯДК-04, после инфицирования ВНД КРС через 48 ч;

Фиг. 4 - монослой незараженной культуры клеток ТЯ (контроль культуры клеток);

Фиг. 5 - клетки монослоя культуры клеток ТЯ, после инфицирования ВНД КРС через 48 ч.

Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 относится к семейству Poxviridae, роду Capripoxvirus, виду Dermatitis nodularis bovum (лат.) или Lumpy Skin Disease (англ.) и обладает морфологическими признаками, характерными для представителей каприпоквирусов: вирионы кирпичеобразной формы, имеют двойную липидную оболочку, плотную сердцевину и боковые тельца.

Антигенные свойства

Антигенные свойства, вариабельность и родство ВНД полностью не изучены. В антигеном отношении ВНД родственен вирусу оспы овец и оспы коз. В реакции нейтрализации в культуре клеток показать существенное отличие вируса оспы овец от ВНД штамма Neethling не удается [7].

У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в ИФА и РМН. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в РМН на культуре клеток ЯДК-04.

Введение штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 крупному рогатому скоту сопровождается образованием у них вируснейтрализующих антител в крови в титре 1:4÷1:64.

При гипериммунизации морских свинок и кроликов концентрированный антиген ВНД штамм Дагестан/2015 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РМН в титре 1:128÷1:512 или в ИФА в разведении 1:640÷1:2560.

Биотехнологические характеристики

Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 проявляет высокую биологическую, антигенную активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 репродуцируется в монослойных культурах клеток: ТЯ и ЯДК-04, в которых в течение 2÷3 суток инкубирования накапливается в титре не менее 4,5 lg ТЦД₅₀/см³. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).

Генотаксономическая характеристика

Геном вируса имеет двухспиральную линейную молекулу ДНК, содержащую 150÷160 тыс. пар нуклеотидов. ДНК не обладает инфекционностью. В составе вирионов обнаружено более 100 полипептидов. Белки составляют 88% массы вириона, 5% - ДНК, 4% - липиды и 3% - углеводы.

Физические свойства

Плавучая плотность в CsCl 1,19 г/см³. Наиболее стабилен при рН 6,6÷8,6.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус стабилен в окружающей среде при комнатной температуре с сохранением инфекционной активности до 18 дн, в пораженных участках кожи - не менее 33 дн, в слюне - 11 дн, сперме быков - 22 дн, в культуре клеток при 4°С÷6 мес. Показывает незначительное снижение титра при 37°С в течение 5 дн, переносит 3-кратное замораживание и оттаивание, чувствителен к эфиру, хлороформу, высокой температуре. Сохраняет жизнеспособность в течение 10 лет при температуре минус 80°С.

Сущность предложенного изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коров, в культурах клеток ТЯ и ЯДК-04. В процессе адаптации было установлено, что культуры клеток ТЯ и ЯДК-04 высокочувствительны к ВНД и оказались оптимальными культурами для получения расплодки штамма.

В дальнейшем, для получения расплодки, вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре 37°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при 37°С до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) культуральные матрасы промораживали при минус 20°С и после оттаивания при комнатной температуре производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса микротитрованием в культуре клеток ЯДК-04.

Титрование проводили в стерильных 96-луночных плоскодонных культуральных планшетах в объеме 0,2 см³/лунку. Предварительно готовили десятикратные разведения вируссодержащего материала на среде ПСП, начиная с 10^-1 до 10^-7. Подготовленные разведения вируса переносили, начиная с наивысшего разведения, в культуральные планшеты по 0,1 см³. К полученным разведениям вируса добавляли по 0,1 см³ клеточной суспензии ЯДК-04 на среде ПСП с содержанием 1÷2% фетальной сыворотки КРС.

Планшет закрывали крышкой, помещали в CO₂ - инкубатор с содержанием 5% CO₂ при температуре 37°С и вели наблюдения с использованием инвертируемого микроскопа. Заключительный учет результатов титрования вируса проводили через 96-120 ч инкубирования при условии сохранения целостности монослоя клеток в контрольных лунках. Расчет инфекционной активности проводили по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД₅₀/см³.

Биологическая активность штамма ВНД/Дагестан/2015 при титровании в культуре клеток ЯДК-04 составила 5,03 ТЦД₅₀/см³. Результаты представлены в таблице 1.

Проявление ЦПД в КК ЯДК-04 характеризовалось образованием большого числа округлых клеток. К 96 ч культивирования большая часть клеток отслаивалась от стекла и деградировала до детрита, а не разрушенные пораженные клетки собирались в крупные конгломераты (фиг.2, фиг.3).

При последовательной репродукции ВНД в КК ТЯ через 24 ч после заражения в монослое отмечали появление веретенообразных клеток, которые позже округлялись и через 48-72 ч в большей части отслаивались от стекла (фиг. 4, фиг. 5).

Контроль стабильности штамма определяли в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток ЯДК-04 и ТЯ. Результаты изучения стабильности штамма по его биологической активности в течение 5 пассажей представлены в таблице 2.

В ходе проведенных исследований установлено, что штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток ЯДК-04 и ТЯ проявлял стабильную биологическую активность, которая находилась в пределах 5,0-5,17 lg ТЦД₅₀/см³ и 5,0-5,5 ТЦД₅₀/см³ соответственно.

Пример 2

Контроль отсутствия контаминации бактериями, грибами и микоплазмами (микробиологическими методами).

Для проведения испытания на стерильность использовали 5 флаконов с образцом исследуемого штамма ВНД КРС/Дагестан/2015. Подтверждение отсутствия контаминации бактериальной, грибной микрофлорой и микоплазмами проводили в соответствии с ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».

Содержимое флаконов растворяли в стерильном физиологическом растворе до первоначального объема перед лиофилизацией (2 см³), т.е. ресуспензировали.

Суспензию из каждого флакона по 1 см³ высевали в 3 пробирки с тиогликолевой средой. Две засеянные пробирки выдерживали в термостате в течение 14 суток: одну - при 21÷22°С, другую - при 37°С, а третью выдерживали в течение 7 суток при (37±0,5)°С. Затем из нее делали пересев по 0,5 см³ по одной пробирке на следующие среды: МПА, МППБ, МПБ, Сабуро жидкий и по 1 см³ на МППБ.

Пересевы на МПА, МПБ, МППБ выдерживали еще в течение 7 суток при 37°С, а пересев на Сабуро - при 21÷22°С.

При микробиологическом испытании образца штамма проводили контроль стерильности сред: три пробирки с каждой средой выдерживали в термостате в течение 14 суток при 37°С, со средой Сабуро - при 21÷22°С.

Для исключения контаминации микоплазмами суспензию образца штамма по 0,5 см³ высевали в пробирку, содержащую 4,5 см³ жидкой среды Каган 0,3%, и выдерживали в термостате при 37°С.

При отсутствии роста микоплазм в течение 7 суток на жидкой среде (сохранение цвета индикатора) далее через каждые 7 суток проводили 2 последовательных пассажа на твердую среду Каган 1,3%.

При отсутствии специфических для микоплазм колоний, врастающих в толщу агара, делали заключение о чистоте образца штамма.

В результате исследований установлено, что штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 не контамирован бактериями, грибами и микоплазмами.

Высевы ресуспензированного образца штамма вируса на соответствующие питательные среды были без проростов в течение всех сроков наблюдения.

Пример 3

Получение антигена ВНД КРС.

Для приготовления антигена для диагностических целей содержимое 3-х флаконов штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 растворяли стерильной средой ПСП до исходного объема (2 см³), тщательно перемешивали и объединяли. Двухсуточную культуру клеток ЯДК-04 или ТЯ, выращенную в 1,5-литровых клинских матрасах, предварительно слив с них ростовую среду, заражали в дозе 0,3÷0,5 lg ТЦД₅₀/см³. Матрасы помещали на один час в термостат при температуре 37°С для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносили поддерживающую среду ПСП с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса, которое характеризовалось округлением клеток, их скоплением и в дальнейшем разрушением монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% культуральные матрасы подвергали двукратному промораживанию при температуре минус 20°С и оттаиванию.

Полученную вирусную суспензию использовали в качестве матровой расплодки, которой заражали клинские матрасы с культурой клеток ЯДК-04 или ТЯ, как описано выше. При появлении ЦПД на 70÷80% площади монослоя культуральные матрасы подвергали двукратному промораживанию при температуре минус 20°С и оттаиванию.

Вируссодержащую культуральную жидкость очищали от балластных белков и фрагментов клеток низкоскоростным центрифугированием при 4800 g в течение 40 минут.

Полученную осветленную надосадочную жидкость центрифугировали при 45000 g в течение 120 минут, после чего надосадочную жидкость удаляли, а осадок суспендировали в 10 мл буферном растворе TNE и подвергали дальнейшему центрифугированию через слой 30% сахарозы при 10600 g в течение 180 минут. Полученный осадок ресуспендировали в TNE буферном растворе в соотношении 1/100 от начального объема.

Полученный данным способом антиген использовали в серологических реакциях для определения уровня антител к ВНД КРС, а также для изготовления диагностических сывороток.

Результаты исследований, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что способом, описанным в примере 3, получен антиген с активностью в культуре клеток 6,0 lg ТЦД/см³, в ИФА 1:640.

Пример 4

Получение гипериммунной сыворотки.

Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 используют для получения высокоактивной гипериммунной сыворотки, предназначенной для оценки иммунобиологических свойств ВНД КРС, а также контроля качества антигенного сырья, используемого при производстве диагностических препаратов.

Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный антиген ВНД КРС, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-70 производства фирмы "SEPPIC"(в соотношении 1:1).

Кроликов иммунизировали в дозе 2 см³ трехкратно по схеме:

1) в мякиши задних конечностей;

2) через 7÷10 дней после первой иммунизации в подколенные лимфоузлы;

3) через 21 день после первой - внутримышечно.

Морских свинок иммунизировали полученной эмульсией в дозе 1 см³ в заднебедренную группу мышц. Инъекцию повторяли через 7, 14, 21 день, меняя при этом место введения.

Через 10÷15 дней после окончания гипериммунизации доноров обескровливали и получали сыворотку крови для исследования на наличие антител. Титр антител определяли в РМН и ИФА.

Данные, представленные в таблице 4, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 4, получены диагностические сыворотки со специфической активностью.

Пример 5

Контроль специфичности штамма в реакции микронейтрализации (РМН).

Для проведения РМН использовали гипериммунные сыворотки крови кроликов, полученные на штамм ВНД КРС/Дагестан/2015. В качестве тест-системы использовали суспензию перевиваемой культуры клеток ЯДК-04.

Постановку РМН проводили в 96-луночных планшетах, используя штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 в последовательных десятикратных разведениях и гипериммунную сыворотку крови кроликов с постоянной дозой. В качестве контроля использовали нормальную сыворотку крови кроликов. Реакцию учитывали через 5÷6 суток по мере развития цитопатического действия вируса в контрольных лунках, не содержащих исследуемые сыворотки. Титром вируса считали предельное ее разведение, тормозящее развитие цитопатического действия вируса в 50% зараженных лунок с культурой клеток. Индекс нейтрализации рассчитывали по стандартной формуле [2]. Результаты представлены в таблице 5.

Из данных таблицы 5 видно, что цитопатический эффект вируса со специфической сывороткой крови кроликов наблюдали в разведениях вируса от 10^-1 до 10^-3, титр вируса составлял 2,05 lg ТЦД₅₀/см³. В лунках, куда вносили вирус с нормальной сывороткой, титр вируса составлял 5,00 lg ТЦД₅₀/см³.

Индекс нейтрализации составил 2,44 lg ТЦД₅₀/см³, что свидетельствует о том, что тип исследуемого вируса соответствует типу специфической сыворотки.

Пример 6

Антигенную активность штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 определяли на 5 быках. Для этого использовали суспензию патологического материала (нодулы), полученные от КРС, а также суспензию вируса, полученную после проведения 4-х пассажей на культуре клеток ТЯ.

Суспензию патологического материала приготавливали стандартным способом и вводили внутрикожно в области средней трети шеи первому животному 5,0, второму 10,0 см³. В дальнейшем двум другим животным вводили культуральную вируссодержащую суспензию в области средней трети шеи с обеих сторон: первому животному по 5,0 см, второму по 10,0 см³. Также проводили внутривенное заражение одного животного культуральной суспензией.

До введения вируса, через 14, 21, 28 день после введения вируссодержащей суспензии у животных отбирали кровь для определения титра вируснейтрализующих антител в сыворотке крови.

За зараженными животными наблюдали в течение 28 суток. При этом ежедневно регистрировали клинические признаки проявления данного заболевания и проводили отбор проб биоматериала.

Вируснейтрализующую активность антител сывороток крови определяли в РМН. С этой целью готовили двукратные разведения испытуемых сывороток. К полученным разведениям сывороток добавляли равные объемы вируссодержащего культурального материала с активностью 2,0 lg ТЦД₅₀/см³. Смеси вируса с сывороткой выдерживали в CO₂-инкубаторе при температуре 37°С в течение одного часа.

После часового контакта во все лунки планшета вносили суспензию культуры клеток ЯДК-04 и помещали в CO₂-инкубатор с содержанием 5% CO₂ при температуре 37°С на 96-120 ч. Наблюдения проводили с использованием инвертируемого микроскопа, регистрируя лунки с выраженным ЦПД вируса и/или с цельным неповрежденным монослоем.

При постановке РМН использовали контроли на токсичность сывороток, контроли культуры клеток и дозы вируса.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 6. Титр вируснейтрализующих антител находился в пределах 1:4÷1:64.

Пример 7

Идентификация и филогенетическое родство штамма (ПЦР). Видовая принадлежность штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 к вирусу нодулярного дерматита подтверждена методом видовой дифференциации каприпоксвирусов, основанном на ПЦР. Из вируссодержащего материала штамма ВНД КРС выделяли ДНК. Проводили мультиплексную ПЦР с тремя парами праймеров, специфичными для ВНД, вируса оспы овец (BOO) и вируса оспы коз (ВОК). В результате филогенетического анализа был получен специфический фрагмент ДНК длиной 254 пары нуклеотидов с праймерами, специфичными для ВНД. С двумя другими парами праймеров, специфичными для BOO и ВОК, в ПЦР был получен отрицательный результат.

Вместе с этим было установлено, что штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 без контаминации другими штаммами/изолятами вирусов рода Capripoxvirus.

Источники информации1. Гуненков В.В. Заразный узелковый дерматит крупного рогатого скота // Сборник науч. тр. ВГНКИ. - М, 2005. - Т. 66. - С.46-54.

2. Инфекционная патология животных / Под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонов, Е.С. Воронина // М.: Академкнига, 2006. - Т. 1. -С.782-786.

3. Кодекс здоровья наземных животных МЭБ / Т.1. - 23 изд. - Paris, 2014. - Гл. 1.2. Критерии включения болезней, инфекций и инфестаций в список МЭБ. - С.5.

4. Официальный сайт Международного эпизоотического бюро (МЭБ) - URL: http://www.oie.int/eng/info/

5. Пат. РФ 235537, МПК C12N 5/06 Линия клеток яичников домашней Capra hircus L. ЯДК-04 для репродукции вирусов животных / Герасимов В.Н., Герасимова Н.И., Дьяконов Л.П., Груздев К.Н., Захаров В.М., Манин Б.Л. - №2006114337/13; заявл. 26.04.2006, опубл. 10.10.2008

6. Россельхознадзор / Официальный сайт федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. - URL: http://www.fsvps.ru/fsvps/iac/foreign.html

7. Evaluation of different diagnostic methods for diagnosis of lumpy skin diseases in cows / W.S. Awad, A.K. Ibrahim, K. Mahran [et al.] // Trop.Anim. Health. Prod. - 2010. - Vol.42. - P. 777-783.

8. Weiss K.E. Lumpy skin disease // Virol. Monogr. - Vienna, New York, 1968.-Vol. 3.- P. 111-131.