Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕЧЕБНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО α-ИНТЕРФЕРОНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ ВИРУСНЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии и медицинской вирусологии и может быть использовано в лабораторной клинической практике для мониторинга интерферонотерапии рекомбинантными α-интерферонами в динамике лечения с целью определения оптимальной эффективной дозы и длительности терапии.

В настоящее время основным методом лечения многих вирусных заболеваний является стандартная комплексная противовирусная терапия препаратами рекомбинантных α-интерферонов различных фирм-производителей. Выбор дозы лечебных препаратов и длительность назначенного курса лечения носят эмпирический характер. Препараты рекомбинантных α-интерферонов весьма дороги, лечение длительно - шесть и более месяцев, сопровождается тяжелыми побочными явлениями, при этом не всегда являясь эффективным. Поэтому для подбора индивидуальной эффективной дозы и длительности интерферонотерапии необходимо определять концентрацию применяемого α-интерферона в сыворотке больного на различных этапах лечения.

На сегодняшний день в медицинской практике отсутствуют способы и препараты для определения концентрации лечебных рекомбинантных α-интерферонов в сыворотках больных. Обычно производится определение концентрации собственного эндогенного α-интерферона человека, продуцируемого иммунокомпетентными клетками - лейкоцитами. Для этого применяется иммуноферментный анализ с помощью иммуноферментных тест-систем как иностранного, так и отечественного производства.

Известны тест-системы «Human IFN-alfa Platinum ELISA» (affimetrix eBIOSCIENCE, США, «Human IFN alpha ELISA Kit (Multi-Subtype)» (Thermo Scientific, США), «VeriKine Human Interferon alpha ELISA Kit» (eBIOSCIENCE, США). Однако данные тест-системы дороги и не всегда доступны, кроме того, большинство диагностикумов предназначены для исследовательских целей и не могут использоваться в диагностических целях.

За прототип взята тест-система для количественного определения собственного человеческого α-интерферона «Набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации альфа-интерферона «Альфа-интерферон-ИФА-Бест»» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Суть метода заключается в использовании «сэндвич»-варианта иммуноферментного анализа, где специфическими компонентами системы являются моноклональные антитела к лейкоцитарному α-интерферону, сорбированные на поверхности лунок полистиролового планшета, конъюгат моноклональных антител с пероксидазой хрена и калибровочные образцы, содержащие лейкоцитарный α-интерферон. Концентрацию α-интерферона в исследуемых сыворотках определяют с помощью калибровочной кривой, исходя из концентрации и оптической плотности калибровочных образцов.

Недостатком известной тест-системы является то, что она способна определять собственный эндогенный α-интерферон и не может определять количество лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотках крови больных, что отражается в подборе эффективных доз в клинической практике.

Технической задачей предлагаемого изобретения является создание препарата-диагностикума, способного выявлять и определять количество лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотках крови больных вирусными инфекциями в ходе лечения.

Поставленная задача достигается тем, что способ получения диагностикума для определения лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотке крови больных вирусными инфекциями включает следующие стадии:

а) получают экспериментальные гипериммунные кроличьи сыворотки путем иммунизации кроликов весом от 2,5 до 3 кг с помощью введения препарата «Альтевир» в дозе 100 мкг по белку в паховый лимфатический узел в количестве 3-х инъекций с интервалом в 14 дней, затем через 14 дней после последней инъекции осуществляют обескровливание кроликов, а из крови готовят сыворотки с последующим определением титра антител;

б) выделяют иммуноглобулины из кроличьих сывороток, для этого предварительно готовят физиологический раствор, забуференный с двузамещенным фосфатом натрия и однозамещенным фосфатом калия при рН 7,2, затем готовят водный раствор метанола, для этого смешивают 6 мл метанола с 8 мл дистиллированной воды, смесь охлаждают, после этого полученную сыворотку в количестве 4 мл соединяют с 2 мл забуференного физиологического раствора, помещают в центрифужные стаканы, ставят на лед и выливают в них сыворотку при температуре 0°С, затем добавляют забуференный физиологический раствор, перемешивают, вливают метанольную воду, при этом понижая температуру до -5°С, после стакан со смесью ставят в холодильник на 30-40 минут, а затем центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 минут при нулевой температуре, полученную надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в от исходного объема сыворотки, определяют количество белка по методу Лоури, получая в результате сенситин;

в) готовят полимерный носитель, используя метод анионной полимеризации мономера - акрилового альдегида в водно-щелочной среде с получением монодисперсных частиц сферической формы диаметром 1,2±0,1 микрон, которые окрашивают сафранином, после этого носитель отмывают дистиллированной водой при 100°С и обрабатывают танином;

г) проводят иммобилизацию сенситина на носитель, для этого суспензию микросфер в количестве 100 мг помещают в центрифужный стакан, суспензируют в 5 мл забуферного физиологического раствора и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при температуре 20°С, отмытый таким образом носитель суспендируют в 2 мл забуференного физиологического раствора и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке соединяют с сенситином в количестве 1,2 мг белка, оставляют для контакта в течение 2-х часов при комнатной температуре, при этом дальнейшую иммобилизацию осуществляют при температуре 4-5°С в течение 16-18 часов;

д) блокируют свободные альдегидные группы путем добавления к суспензии носителя с сенситином 2 мл 0,5% раствора желатозы в забуференном физиологическом растворе при рН 7,1, оставляют на 2 часа при помешивании на электромешалке при комнатной температуре;

е) трижды отмывают полученный диагностикум забуференным физиологическим раствором при рН 7,1, предварительно центрифугируя при 3000 об/мин в течение 10 минут, конечный осадок суспендируют в 8 мл 0,1% раствора желатозы на забуференном физиологическом растворе при рН 7,1;

ж) определяют чувствительность препарата, используя α-интерферон «Альтевир», для этого в лунки планшета вносят 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку первого ряда вносят 50 мкл «Альтевира» с содержанием белка 60 мкл/мл и двукратно титруют до 22-й лунки включительно, причем из последней 22-й лунки удаляют 50 мкл жидкости, 23-я и 24-я лунки служат контролем на спонтанную агглютинацию диагностикума, при этом во все лунки двух рядов вносят по 25 мкл взвеси диагностикума, через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре проводят учет результатов реакции визуально, при этом последняя лунка, а именно 19-я, дающая положительный результат - розовый агломерат, разведение которой равно 23,5 пг белка/мл, что соответствует чувствительности диагностического препарата, а активность и специфичность жидкого антигенного препарата проверяют в реакции агломерации объемной (РАО);

з) лиофилизацию диагностикума осуществляют путем суспендирования препарата в 20 мл 3% желатозно-сахарозной среды, затем суспензию разливают в ампулы по 1 мл с последующим высушиванием при комнатной температуре в течение суток.

При этом реакцию агломерации объемную осуществляют в планшетах путем внесения в лунки 50 мкл 1% нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку каждого ряда вносят 50 мкл исследуемой сыворотки и двукратно титруют до конца ряда, из последней лунки 50 мкл удаляют, а диагностикум в объеме 25 мкл вносят в каждую лунку ряда и оставляют при комнатной температуре, учет результатов реакции РАО осуществляют через 2-2,5 часа, положительный результат дает равномерный агломерат, выстилающий дно лунки, с четко очерченными краями, а в отрицательных случаях и отрицательном контроле образуется колечко или точка в центре лунки.

Кроме того, определяют концентрацию лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотках крови больных, для этого реакцию агломерации ставят по методике РАО, но в лунках планшета с разводящей жидкостью НКС двукратно титруют сыворотки больного, затем вносят по 25 мкл иммуноглобулинового диагностического препарата, при этом последняя лунка с положительной реакцией фиксирует величину последнего разведения исследуемой сыворотки, поэтому концентрацию лечебного препарата α-интерферона рассчитывают по формуле

К=Р·С,

где К - искомая концентрация препарата α-интерферона;

Р - последнее разведение исследуемой сыворотки, в которой фиксировался положительный результат;

С - чувствительность диагностикума в пг/мл.

Способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе готовят диагностический препарат по следующей технологии:

а) Получают экспериментальные гипериммунные кроличьи сыворотки, используя фармакологический препарат «Альтевир» (3 млн. ME).

Для подбора иммунизирующих доз определяют концентрацию белка по Лоури. Затем для иммунизации отбирают самцов кроликов калифорнийской породы весом от 2,5 до 3 кг. Иммунизацию осуществляют путем введения препаратов в дозе 100 мкг по белку в паховый лимфатический узел - 3 инъекции с интервалом в 14 дней. Через 14 дней после последней инъекции осуществляют тотальное обескровливание кроликов с последующим получением сыворотки из этой крови. После определения титра антител полученную гипериммунную сыворотку фасуют и хранят в замороженном состоянии при температуре 30°С.

б) Выделяют иммуноглобулины из кроличьих гипериммунных сывороток с помощью метанольного метода. Перед выделением иммуноглобулинов предварительно готовят физиологический раствор, забуференный с двузамещенным фосфатом натрия и однозамещенным фосфатом калия. Затем готовят водный раствор метанола, для этого смешивают 6 мл метанола с 8 мл дистиллированной воды. Полученную смесь охлаждают.

Кроличью сыворотку в количестве 4 мл соединяют с 2 мл забуференного физиологического раствора, помещают в центрифужные стаканы и охлаждают на льду. Стаканы ставят на лед и выливают в них сыворотку при температуре 0°С, затем добавляют забуференный физиологический раствор и хорошо перемешивают. После этого, покачивая стакан, добавляют метанольную воду, постепенно понижая температуру до -5°С. Стакан со смесью ставят в холодильник на 30-40 минут. После этого центрифугируют 20 минут на холоду при 0°С 2000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в от исходного объема сыворотки, после чего определяют количество белка по методу Лоури, получая таким образом сенситин.

в) Готовят полимерный носитель методом анионной полимеризации мономера - акрилового альдегида в водно-щелочной среде. Полученные монодисперсные частицы сферической формы диаметром 1,2±0,1 микрон окрашивают сафранином. Затем носитель отмывают дистиллированной водой при 100°С и обрабатывают танином для обеспечения связываемости белков.

г) Проводят иммобилизацию сенситина на носитель.

Суспензию микросфер в количестве 100 мг помещают в центрифужный стакан, суспензируют в 5 мл забуферного физиологического раствора и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин при температуре 20°С, таким образом отмытый носитель суспензируют в 2 мл забуферного физиологического раствора и при постоянном перемешивании на магнитной электромешалке Magnetic Stirer MSH 300 (BioSan, Латвия) соединяют с сенситином, последний в количестве 1,2 мг белка, оставляют для контакта в течение 2-х часов при комнатной температуре. Затем проводят иммобилизацию при температуре 4-5°С в течение 16-18 часов.

д) Осуществляют блокирование свободных альдегидных групп. К суспензии носителя с сенситином добавляют 2 мл 0,5% раствора желатозы в забуференном физиологическом растворе при рН 7,1 и оставляют при постоянном перемешивании на магнитной электромешалке на 2 часа при комнатной температуре.

В результате стабилизации желатоза позволяет блокировать реакционные группы на частицах, не связавшиеся с раствором специфического иммуноглобулина в процессе иммобилизации.

е) Отмывание диагностикума. После инкубирования с 0,5%-ным раствором желатозы осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут и трижды отмывают забуференным физиологическим раствором при рН 7,1. Конечный осадок суспендируют в 8 мл 0,1%-ного раствора желатозы на забуференном физиологическом растворе при рН 7,1. Активность и специфичность жидкого антигенного диагностического препарата проверяют в реакции агломерации объемной (РАО).

ж) Определение чувствительности препарата с использованием коммерческого лечебного α-интерферона «Альтевир».

В два ряда (А и В) лунок 96-луночного планшета для иммунологических реакций вносят по 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки, затем в первую лунку первого ряда (А) добавляют 50 мкл «Альтевира» с содержанием белка 60 мкл/мл и двукратно титруют до 22 лунки включительно. Из последней лунки удаляли 50 мкл жидкости. Таким образом, в каждой последующей лунке содержание белка получалось вдвое меньше, чем в предыдущей. Две последние лунки (23-я и 24-я) служили контролем на спонтанную агглютинацию диагностикума. Во все лунки двух рядов вносили по 25 мкл взвеси диагностического препарата. Результат реакции учитывали визуально через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре. Последняя лунка, в которой фиксировался положительный результат - розовый агломерат, равномерно выстилающий дно лунки, - была 19-я, разведение которой соответствовало 23,5 пг белка/мл. В контрольных лунках отмечен отрицательный результат - точка в центре лунки.

Таким образом, чувствительность диагностического препарата составляет 23,5 пг/мл.

з) Лиофилизация диагностикума.

Заключительным этапом в получении диагностикума является лиофилизация, которую осуществляют путем суспендирования препарата в 20 мл 3% желатозо-сахарозной среды, затем суспензию разливают в ампулы по 1 мл с последующим высушиванием при комнатной температуре.

Содержимое ампул замораживают спиртовым охлаждением при температуре -45±5°С в течение 10±2 мин. Замороженный диагностикум помещают в низкотемпературный шкаф для глубокого замораживания при -50°С и выдерживают в течение 17 часов, после чего ампулы с замороженным диагностикумом помещают в камеру вакуумсушильного аппарата.

Второй этап способа заключается в методике постановки реакции РАО и определении концентрации рекомбинантного α-интерферона в лечебных препаратах.

Перед проведением РАО нормальную кроличью сыворотку НКС и исследуемые препараты рекомбинантного α-интерферона разводят 1:10 забуференным физиологическим раствором (рН 7,1). Сыворотки больных вирусными гепатитами, получающих интерферонотерапию, используют цельными.

Для постановки РАО в каждую лунку соответствующего ряда 96-луночного планшета для иммунологических реакций вносят 50 мкл НКС. Затем в первую лунку каждого ряда вносят 50 мкл исследуемого препарата (или сыворотки) и двукратно титруют до конца ряда. Из последней лунки 50 мкл жидкости удаляют. Диагностикум в рабочем разведении вносят в объеме 25 мкл в каждую лунку ряда и оставляют при комнатной температуре.

Для проверки диагностикума на спонтанную агглютинацию в две любые лунки вносят 50 мкл нормальной кроличьей сыворотки и 25 мкл разведенного диагностикума.

Учет результатов реакции осуществляют визуально через 2-2,5 часа.

За положительный результат принимают цветной розовый агломерат, выстилающий все дно лунки равномерно, или агломерат, выстилающий дно лунки с четко очерченными краями. В отрицательных случаях и в отрицательном контроле образуется компактное колечко или «точка» в центре лунки.

Определение концентрации рекомбинантного α-интерферона в коммерческих препаратах.

Пример 1

В 12 лунок одного ряда 96-луночного планшета для иммунологических реакций вносили по 50 мкл разводящей жидкости - НКС.

В первую лунку ряда вносили 50 мкл коммерческого препарата рекомбинантного α-интерферона («Пегинтрон») и титровали двукратно до 10 лунки, две последние лунки служили отрицательным контролем. Результат реакции учитывали визуально через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре. Последняя лунка, в которой фиксировался положительный результат - розовый агломерат, выстилающий все дно лунки, соответствовала разведению 1:2560. Концентрация интерферона в данном препарате составляет:

К=Р·С, где Р=2560, С=23,5 пг/мл,

К=2560·23,5=60,1 нг/мл,

где К - искомая концентрация препарата в сыворотке больного;

2560 - величина последнего разведения сыворотки, в котором фиксировался положительный результат;

23,5 пг/мл - чувствительность диагностического препарата.

Полученный результат соответствует содержанию белка-интерферона в препарате «Пегинтрон», заявленному в инструкции, прилагаемой к препарату.

Пример 2

Отличается от примера 1 тем, что исследуют коммерческий препарат рекомбинантного α-интерферона «Пегасис».

Реакция агломерации объемная ставится аналогично примеру 1, но в лунках планшета с разводящей жидкостью НКС двукратно титруют рекомбинантный интерферон «Пегасис» и затем вносят 25 мкл иммуноглобулинового диагностического препарата. Последняя лунка, в которой фиксировали положительную реакцию, соответствовала разведению 1:640.

Концентрация рекомбинантного интерферона составляет:

К=640·23,5=15 нг/мл.

где К - искомая концентрация препарата в сыворотке больного;

640 - величина последнего разведения сыворотки, в котором фиксировался положительный результат;

23,5 пг/мл - чувствительность диагностического препарата.

Пример 3

Отличается от примеров 1, 2 тем, что исследуют коммерческий препарат эндогенного лейкоцитарного α-интерферона человека.

Реакция агломерации объемная ставится аналогично примерам 1, 2, но в лунках планшета двукратно титруют эндогенный α-интерферон человека и вносят 25 мкл диагностического иммуноглобулинового препарата.

Через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре во всех лунках фиксировали отрицательную реакцию - точку в центре лунки.

Эти примеры показывают, что предлагаемый диагностический препарат дает возможность определять концентрацию различных коммерческих препаратов рекомбинантного α-интерферона в реакции агломерации объемной и при этом не реагирует с собственным эндогенным α-интерфероном человека.

Пример 4

Отличается от других примеров тем, что исследуемым веществом является сыворотка больного, получавшего интерферонотерапию в течение месяца препаратом рекомбинантного α-интерферона «Альтевир».

В лунках 1-го ряда 96-луночного планшета для иммунологических реакций раститровывали двукратно цельную сыворотку больного, получавшего лечение препаратом «Альтевир» в течение месяца. Затем к сыворотке добавляли по 25 мкл иммуноглобулинового диагностического препарата. Через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре визуально учитывали результаты реакции. Последняя лунка, в которой фиксировали положительный результат, соответствовала разведению 1:8.

Определение концентрации лечебного препарата в сыворотке:

К=Р·С, где Р=8, С=23,5 пг/мл,

К=8·23,5=188 пг/мл,

где К - искомая концентрация препарата в сыворотке больного;

8 - величина последнего разведения сыворотки, в которой фиксировался положительный результат;

23,5 пг/мл - чувствительность диагностического препарата.

Пример 5

Отличается от примера 4 тем, что исследуемым веществом является сыворотка больного, получавшего интерферонотерапию препаратом рекомбинантного α-интерферона «Пегасис» в течение 3-х месяцев.

Реакция агломерации объемная ставится аналогично предыдущим примерам. В лунках одного ряда 96-луночного планшета для иммунологических реакций двукратно титровали цельную сыворотку больного, получавшего лечение препаратом рекомбинантного α-интерферона «Пегасис» в течение 3 месяцев. Вносили по 25 мкл взвеси диагностического иммуноглобулинового препарата. Через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре визуально учитывали результаты реакции. Последняя лунка, в которой фиксировали положительный результат, соответствовала разведению 1:4. Концентрация лечебного препарата в сыворотке больного составит:

К=4·23,5 пг/мл=94 пг/мл,

где К - искомая концентрация препарата в сыворотке больного;

4 - величина последнего разведения сыворотки, в которой фиксировался положительный результат;

23,5 пг/мл - чувствительность диагностического препарата.

Пример 6

Отличается от предыдущих примером тем, что исследуемым веществом является сыворотка больного, получавшего лечение лечебным препаратом рекомбинантного α-интерферона «Роферон» в течение 6-ти месяцев.

В лунках одного ряда 96-луночного полистиролового планшета для иммунологических реакций двукратно титровали цельную сыворотку больного, получавшего интерферонотерапию препаратом «Роферон» в течение 6 месяцев. Затем в эти лунки вносили по 25 мкл полимерного иммуноглобулинового диагностического препарата. Результат реакции учитывали через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре. Последняя лунка, в которой фиксировали положительный результат - розовый агломерат, равномерно выстилающий дно лунки, соответствовала разведению 1:2.

Концентрация лечебного интерферона в сыворотке больного в этом случае составит:

К=2·23,5=47 пг/мл,

где К - искомая концентрация препарата в сыворотке больного;

4 - величина последнего разведения сыворотки, в которой фиксировался положительный результат;

23,5 пг/мл - чувствительность диагностического препарата.

Пример 7

Отличается от предыдущих примеров тем, что исследуемым веществом является сыворотка больного, не получавшего лечение препаратами рекомбинантного α-интерферона, но имеющим высокий уровень собственного эндогенного лейкоцитарного α-интерферона.

В лунках полистиролового планшета двукратно титровали цельную сыворотку больного. Затем вносили по 25 мкл полимерного иммуноглобулинового диагностикума и через 2,5 часа инкубации при комнатной температуре визуально учитывали результаты.

Во всех лунках фиксировали отрицательный результат - точка в центре лунки.

Это говорит о том, что в сыворотке данного больного не обнаружено лечебного препарата α-интерферона.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что разработанный специалистами ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора иммуноглобулиновый α-интерфероновый диагностикум на основе антител к одному рекомбинантному α-интерферону «Альтевир» позволяет корректно определять и другие лечебные препараты рекомбинантного α-интерферона и при этом не дает реакции с эндогенным лейкоцитарным α-интерфероном человека. Препарат обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Использование предлагаемого диагностикума позволяет с его помощью определять концентрацию лечебного рекомбинантного α-интерферона в сыворотках больных на разных этапах лечения дифференцированно от собственного эндогенного лейкоцитарного α-интерферона человека. Это дает врачу возможность анализировать эффективность использования лекарственного препарата, а также подобрать индивидуальную дозу и схему лечения.

Предлагаемый способ отличается одностадийностью, простотой постановки и учета результатов, не требует дополнительных специфических реагентов, дорогостоящего оборудования и специально подготовленного персонала.