Результат интеллектуальной деятельности: ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к микробиологии и, в частности, к питательным средам, используемым для посева микроорганизмов с целью их дальнейшего изучения.

Для процесса роста и размножения бактерии должны получать все вещества, которые необходимы для биосинтеза клеточных компонентов и получения энергии [Balows Α., Hausler W.J. Jr., Herrmann K.L., Isenberg H.D., Shadow H.J. Manual of clinical Microbiology, 5thed. ASM, 1991, 1226-1288].

Питательные среды разделяют на среды общего назначения, пригодные для выделения многих видов микроорганизмов, и специальные, предназначенные для избирательного культивирования определенных видов бактерий, изучения их свойств и хранения. Среди специальных сред различают элективные (избирательные), дифференциально-диагностические (индикаторные) и консервирующие [Balows Α., Hausler W.J. Jr., Herrmann K.L., Isenberg H.D., Shadow H.J. Manual of clinical Microbiology, 5thed. ASM, 1991, 1226-1288].

Известна среда общего назначения, так называемая «Колумбийская», содержащая панкреатический перевар казеина, пепсиновый перевар мяса, панкреатический перевар сердца, дрожжевой экстракт, крахмал и воду.

Данная среда была выбрана нами в качестве прототипа заявленного изобретения [Ellner, P.D., С.J. Stoessel, Е. Drakeford, and F. Vasi. 1966. A new culture medium for medical bacteriology. Am. J. Clin. Pathol. 45:502-504].

Недостатком прототипа является то обстоятельство, что его использование не учитывает два качества среды, необходимость в которых возникла после открытия бактерий, называемых «пока не культивируемые» [Oliver, JD. "Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria". FEMS Microbiol Rev 2010, 34: 415-25] - рост одновременно на одной чашке (пробирке) смеси максимально разнообразных бактерий и достаточную скорость роста как отдельных бактерий, так и их смешанных сообществ.

Задачей настоящего изобретения является создание питательной среды, обеспечивающей одновременный рост максимально возможного числа бактерий, имеющихся в засеваемом материале.

Согласно изобретению питательная среда дополнительно содержит виалуровую кислоту и настой говядины, при следующем соотношении компонентов, масс %:

- панкреатический перевар казеина - 0,3-1,0;

- пепсиновый перевар мяса - 0,1-1,5;

- панкреатический перевар сердца - 0,1-0,9;

- дрожжевой экстракт - 0,1-2,0;

- крахмал - 0,3-0,8;

- виалуровая кислота - 0,001-0,05;

- настой говядины - 2,0-15;

- вода - остальное.

Питательная среда может дополнительно содержать агар-агар - 0,3-2,5 масс %, и/или цельные или гемолизированные эритроциты крови барана - 1-20 масс %, и/или цельные гемолизированные эритроциты крови человека - 1-20 масс %, и/или сыворотку крови лошади - 1-15 масс %.

Заявителем не выявлены какие-либо технические решения, идентичные заявленному, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения условию патентоспособности «Новизна».

Реализация отличительных признаков изобретения обусловливает технический результат, состоящий в обеспечении достаточного одновременного роста максимально возможного числа бактерий, имеющихся в засеваемом материале.

Заявителем не выявлены источники информации, в которых содержались бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат.

Указанные обстоятельства позволяют сделать вывод о соответствии заявленного технического решения условию патентоспособности «Изобретательский уровень».

Приготовление питательной среды

Среду готовили следующим образом: готовили навески компонентов среды, масс %: панкреатический перевар казеина 0,3-1,0; пепсиновый перевар мяса 0,1-1,5; панкреатический перевар сердца 0,1-0,9; дрожжевой экстракт 0,1-2,0; крахмал 0,3-0,8; виалуровая кислота 0,001-0,05; настой говядины 2,0-15. Компоненты смешивали, добавляли дистиллированную воду до общего объема 1000 мл, устанавливали рН 7,3±0,2 (0,1 н. раствором соляной кислоты или 0,1 н. раствором гидроксида натрия) и доводили до кипения, затем в горячем виде фильтровали через бумажный или ватно-марлевый, или иной фильтр, или полотно, задерживающий механические примеси, или отстаивали.

Для приготовления агаризованной среды к исходной смеси до добавления воды, добавляли агар-агар 0,3-2,5 масс %, после чего приготовление шло так же, как и для жидкой среды. Отстоявшиеся расплавленные агаровые среды фильтровали через ватно-марлевый фильтр.

Среду стерилизовали при помощи высокой температуры в автоклавах под давлением или текучим паром. Обычно среду стерилизовали в автоклаве при 0,5-1,0 атм. (120,6°) в течение 15-30 мин. После остывания до +45°С в среду в соответствии с примером добавляли цельные или гемолизированные эритроциты крови барана или крови человека 1-20 масс %, или сыворотку крови лошади 1-15 масс %.

Оценка микробного разнообразия

На среду засевали искусственную смесь бактерий, имеющих морфологические признаки, различимые при световой микроскопии: грамположительные представители родов Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, различные Corynebacterium, спорообразующие Bacillus, Paenibacillus, Oceanobacillus, различные Actinomyces, Lactobacillus грамотрицательные Neisseria, Escherichia, Brucella, Pseudomonas, Acinetobacter, Proteus, Bordetella. Из колоний микроорганизмов готовили мазки и окрашивали по Граму с последующим использованием метода световой микроскопии.

Результаты сравнения с прототипом заявленной питательной среды и среды с добавлением агар-агар по числу разных выросших бактерий приведены в Таблице 1.

Анализ результатов, приведенных в Таблице 1, показал, что заявленная питательная среда с добавлением агар-агара и без него позволяет выращивать максимальное количество микроорганизмов, превосходящее таковое у прототипа, как с добавками эритроцитов крови барана или человека, или сыворотки, так и без них.

Результаты сравнения с прототипом заявленной жидкой питательной среды по числу разных выросших бактерий приведены в Таблице 2.

Анализ результатов, приведенных в Таблице 2, показал, что заявленная жидкая питательная среда также позволяет выращивать максимальное количество микроорганизмов, превосходящее таковое у прототипа как с добавлением эритроцитов крови барана или человека, или сыворотки, так и без них.

Скорость роста бактерий

Дополнительно на жидкой питательной среде с составом компонентов по примерам 14, 15, 18, 19, 22, 23 осуществляли сравнение с прототипом с составом компонентов по примеру 12 заявленной питательной среды по времени роста выросших колоний микроорганизмов. На среду было засеяно 10 штаммов разных бактерий (смесь включала различные штаммы стафилококков, кишечной палочки, микрокки, коринебактерии, сальмонеллы, псевдомонады, протей, бациллы). Результаты сравнения с прототипом заявленной жидкой питательной среды по времени роста выросших колоний микроорганизмов приведены в таблице 3.

Анализ результатов, приведенных в таблице 3, показал, что заявленная питательная среда позволяет получить максимальное разнообразие микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, уже через 8 часов роста в то время, как на среде-прототипе появление максимального количества морфотипов зарегистрировано только после 12 часов роста.

Эффективность использования питательной среды для выделения бактерий из патологического материала

Испытуемый материал засевали на питательную среду с составом компонентов по примерам 2-11, 13-23. В качестве сравнения использована среда, выбранная в качестве прототипа с составом компонентов по примеру 12. Пробы инкубировали при 37°С, 24 часа.

Метагеномный анализ

Выделение ДНК

Выделение ДНК из патологического материала и выросших на среде бактерий проводили при помощи стандартного набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) согласно имеющемуся протоколу.

Амплификацию проводили, используя эубактериальные праймеры 27F-534R, фланкирующие гипервариабельный участок гена 16S рРНК.

27F: ′5-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′

534R: ′5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′.

Используемая в работе пара олигонуклеотидных праймеров специфична консервативным участкам гена 16S рРНК и применяется в метагеномных исследованиях для выявления бактериального разнообразия различных сообществ [Dong, Qunfeng, et al. "The microbial communities in male first catch urine are highly similar to those in paired urethral swab specimens." PLoS One 6.5 (2011): e19709. Petrosino, Joseph F., et al. "Metagenomic pyrosequencing and microbial identification." Clinical chemistry 55.5 (2009): 856-866]. Метагеномное секвенирование фрагмента гена 16S рРНК произведено на пиросеквенаторе Roche/454 Genome Sequencer FLX Titanium. Максимальная длина полученных последовательностей составила 507 нуклеотидов, химерные последовательности и последовательности короче 300 нуклеотидов не были включены в анализ.

Бактерии в моче

В результате пиросеквенирования установлено значительное видовое разнообразие бактерий в пробе мочи, в составе которой выявлены 1 порядок, 1 семья, 4 вида Enterobacteriales. В патологическом материале были представлены микроорганизмы четырех родов порядка Enterobacteriales. Выделенные на питательной среде с составом компонентов по примерам 2-11, 13-23 виды микроорганизмов, встречающихся в моче, приведены в таблице 4.

На среде, выбранной в качестве прототипа с составом компонентов по примерам 1 и 12, получен рост бактерий только одного вида, идентифицированного как Escherichia coli.

В то время, как на заявленной питательной среде с составом компонентов по всем примерам в результате проведенных исследований установлено почти 100% совпадение видов микроорганизмов, дающих рост на заявленной среде в сравнении с видами, находящимися в моче по данным метагеномного анализа, что свидетельствует о высокой эффективности заявленной питательной среды для обеспечения роста всего разнообразия бактерий, которые встречаются в патологическом материале изучаемой природы.

Бактерии в раневом отделяемом

В результате пиросеквенирования установлено значительное видовое разнообразие бактерий в раневом отделяемом, в составе которого выявлены бактерии, принадлежащие к 1 порядку, 1 семейству, 8 видам. В патологическом материале по количеству последовательностей преобладали бактерии порядка Enterobacteriales. Выделенные на питательной среде с составом компонентов по примерам 2-11, 13-23 виды микроорганизмов, встречающихся в раневом отделяемом, приведены в таблице 5.

На среде, выбранной в качестве прототипа с составом компонентов по примерам 1 и 12, получен рост бактерий только одного вида, идентифицированного как Klebsiella oxytoca.

В то время, как на заявленной питательной среде с составом компонентов по всем примерам в результате проведенных исследований установлено почти 100% совпадение видов микроорганизмов, дающих рост на заявленной среде в сравнении с видами, находящимися в раневом отделяемом по данным метагеномного анализа, что свидетельствует о высокой эффективности заявленной питательной среды для обеспечения роста всего разнообразия бактерий, которые встречаются в патологическом материале изучаемой природы.

Обнаружение при метагеномном анализе большого числа бактерий разных видов одного рода, по нашим данным, свидетельствуют о наличии бактерий с неизученным геномом, т.е. относящихся к группе неизвестных, пока не культивируемых бактерий.

Бактерии в мокроте

В результате пиросеквенирования установлено значительное видовое разнообразие бактерий в мокроте, в составе которого выявлены микроорганизмы: 7 порядков, 8 семей, 15 видов. В патологическом материале по количеству последовательностей преобладали микроорганизмы 2-х порядков: Pseudomonadales и Burkholderiales. В мокроте представленность Pseudomonadales, Burkholderiales составила 88,3% и 8,5%. Выделенные на питательной среде с составом компонентов по примерам 2-11, 13-23 виды микроорганизмов, встречающихся в мокроте, приведены в таблице 6.

На среде, выбранной в качестве прототипа с составом компонентов по примерам 1 и 12, получен рост бактерий только одного вида, идентифицированного как Staphylococcus epidermidis.

В то время, как на заявленной питательной среде с составом компонентов по всем примерам в результате проведенных исследований, установлено почти 100% совпадение видов микроорганизмов, дающих рост на заявленной среде в сравнении с видами, находящимися в мокроте, по данным метагеномного анализа, что свидетельствует о высокой эффективности заявленной питательной среды для обеспечения роста всего разнообразия бактерий, которые встречаются в патологическом материале изучаемой природы.