СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОНЦЕНТРАТА ИЗ СЫРЫХ ПАНТОВ ОЛЕНЕЙ (ВАРИАНТЫ)

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, точнее к технологии переработки сырых пантов для получения биологически активного концентрата в виде порошка.

По патенту RU №2386444 известен способ получения биологически активного концентрата из сырых пантов оленей, включающий измельчение (размороженных и высушенных при комнатной температуре) пантов до частиц размером 100 мкм, смешивание измельченных пантов с водой при соотношении 1:5, гомогенизацию смеси и экстракцию в течение 4 часов при температуре 90-93°C с последующим ферментативным гидролизом при температуре 38-40°С и рН 4,5 в присутствии папаина активностью 30 тыс. ЕД из расчета 1-2% от веса пантов в течение 5 часов. После окончания гидролиза гидролизат центрифугируют, фильтруют и сушат при температуре 45-50°С и вакууме 0,9 атм.

Однако разработанный способ переработки сырых пантов, используя на первом этапе высокотемпературную экстракцию, вызывает необратимую денатурацию белков (большей части гормонов, факторов роста и т.д.) до аминокислот, получая конечный продукт с высоким содержанием аминокислот, минеральных веществ, жирных кислот и небольшой концентрации гормонов и факторов роста. При этом на современном рынке наиболее востребованным является сырье с высоким содержанием натуральных витаминов, гормонов, факторов роста.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является известный по патенту RU 2461384 способ получения биологически активного концентрата из консервированных пантов, характеризующийся тем, что панты измельчают до частиц размером 100 мкм и подвергают ферментативному гидролизу с последующей экстракцией, при этом ферментативный гидролиз осуществляют в две стадии, на первой стадии в присутствии фермента пепсина из расчета 2% от веса пантов при соотношении панты:вода 1:3 в течение 4 часов и температуре 40°C с последующим центрифугированием и фильтрацией гидролизата, а на второй стадии проводят ферментативный гидролиз жмыха, полученного после первой стадии ферментации, в присутствии фермента папаина активностью 30 тыс. ЕД из расчета 2% от первоначального веса пантов при соотношении жмых:вода 1:1,5 в течение 4 часов при температуре 40°С, при этом экстракции подвергается жмых, полученный после центрифугирования и фильтрации гидролизата после второй стадии ферментации при соотношении жмых:вода 1:5 в течение 3 часов и температуре 95-98°С, а сушку всех фильтратов проводят при температуре не выше 50°С и вакууме 0,9 атм.

Технологические приемы известного способа получения концентрата из консервированных пантов обеспечивают выход концентрата (до 43,5%), при выходе гормонов (3087 пг/г) и факторов роста (2378 у.е.). Однако концентрация факторов роста и гормонов в концентрате является наиболее значимой в силу природы данных биохимических веществ, что отражается на биологических свойствах концентрата. Поэтому повышение их содержания в конечном продукте (концентрате) путем создания оптимальных условий для их экстрагирования из нативного материала является необходимым фактором, обеспечивающим высокую, с широким спектром действия, биологическую активность концентрата из пантов. Недостатком известного способа является невысокая концентрация факторов роста, гормонов и аминокислот, а также неполное извлечение полезных веществ из пантов, в частности отсутствие переработки жмыха.

Так, на сегодняшний день из пантов оленей выделено 10 основных факторов роста и 2 гормона. Факторы роста, подобно гормонам, обладают широким спектром биологического воздействия на многие клетки организма - стимулируют или ингибируют митогенез, хемотаксис и дифференцировку (созревание) клеток. Так, клетки делятся под действием инсулиноподобного (IGF) и эпидермального (EGF) факторов роста, а созревают при помощи трансформирующего (TGF) фактора роста. Факторы роста отодвигают «плановую старость» клетки, то есть оказывают омолаживающее действие на ткани и весь организм: заново запускают отключившиеся по старости или из-за болезни гены, тем самым продлевая жизнь клетки, увеличивают число деления клеток, направленно стимулируют в них обмен веществ. Факторы роста стимулируют рост ребенка, особенно развитие костно-мышечной системы, что особенно важно в подростковом возрасте. По последним данным клинических исследований факторы роста облегчают течение заболеваний пищеварительного тракта, наиболее эффективно применяются при острых кишечных заболеваниях. Изучается влияние факторов роста для предотвращения развития гиперпластических процессов (мастопатия, миома матки, эндометриоз) и уменьшения прогрессирования онкологических заболеваний. В частности, фактор роста нервов (NGF) играет важную роль в процессах развития и функционирования нервной системы, а также в регенерации поврежденных нейрональных структур. Трансформирующий фактор (TGF₂) является ангиогенным фактором, участвует в пролиферации клеток, а также в регуляции роста опухолевых клеток. В процессе метаболизма дегидроэпиандростерона (ДГЭА) в периферических тканях образуется тестостерон и дегидротестостерон. Эпидермальный фактор (EGF) контролирует и стимулирует пролиферацию эпидермальных и эпителиальных клеток, включая фибробласты, почечный эпителий, глиальные клетки, клетки гранулезы яичников. Цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) рассматривается как ключевой фактор дифференцировки для развивающихся нейронов и глиальных клеток. Костный морфогенетический протеин (ВМР-4) обладает ярко выраженным терапевтическим эффектом при артритах по регенерации костных тканей. Инсулиноподобный фактор роста (IGF) осуществляет эндокринную, аутокринную и паракринную регуляцию процессов роста, развития и дифференцировки клеток и тканей организма. Следует сказать, что действие факторов роста необходимо рассматривать в связи с другими стимуляторами, прежде всего с гормонами, а именно гормоны в биологически активных препаратах из пантовой продукции при надлежащей технологии производства (кстати сказать, довольно близкой по технологическим параметрам, как показали исследования, к технологии оптимального выхода факторов роста) находятся в достаточном количестве.

Востребованность в продуктах обогащенных факторами роста в мире велика, однако синтезированные прототипы данных биохимических веществ, не всегда на практике обладают теми же свойствами, что и оригиналы. Поэтому основным источником данных веществ является сырье животного происхождения, в том числе и панты оленей.

Техническим результатом, на решение которой направлено заявленное изобретение, является разработка способа получения биологически активного концентрата из сырых пантов оленей с более высоким выходом факторов роста, гормонов и аминокислот и максимальным извлечением полезных веществ из имеющегося биологического материала, а именно пантов оленя.

Технический результат достигается тем, что, согласно первому и второму варианту изобретения, сырые панты измельчают и проводят последовательную, в три стадии, водную экстракцию при разведении сырье:вода 1:1-1:2 под воздействием ультразвуковых колебаний частотой от 20 до 50 кГц с последующей фильтрацией и вакуумной сушкой гидролизатов, при этом на первой стадии водную экстракцию проводят при температуре не выше 39°С в течение 1-3 часов, на второй стадии экстракцию осуществляют в процессе проведения ферментативного гидролиза жмыха после первой стадии в присутствии фермента пепсина при рН 1-3 при температуре 32-39°С, на третьей стадии проводят экстракцию жмыха после второй стадии экстракции в присутствии фермента папаина активностью 30 тыс. ЕД при рН 5-7,5 при температуре от 30-40°С, при длительности процесса на каждой стадии 3-5 часов и концентрации ферментов в субстрате 0,8-1,2%. Согласно второму варианту изобретения, жмых после третьей стадии экстракции подвергают высокотемпературной экстракции при температуре не выше 120°С при соотношении жмых:вода 1:6-1:12 в течение 8-12 часов и после центрифугирования и фильтрации.

Согласно первому и второму варианту изобретения сырые панты очищают от механических загрязнений, моют и сушат при комнатной температуре, измельчают до размера частиц 5-20 мм.

Согласно первому и второму варианту изобретения вакуумную сушку гидролизатов после трех стадий экстракции проводят при температуре не выше 40°С и давлении 0,9 атм.

Согласно второму варианту изобретения вакуумную сушку гидролизата после высокотемпературной экстракции при температуре не выше 50°С и давлении 0,9 атм.

Таким образом, данный способ, осуществляемый, согласно первому и второму варианту изобретения, позволяет получать из сырых пантов два вида продукта, которые могут быть использованы (в зависимости от требований потребителя) как совместно, дополняя друг друга, так и самостоятельно.

В процессе отработки оптимальных параметров способа были проведены опыты по оптимальному сочетанию степени разведения субстрата: сырье:вода 0,5:1, 1:1, 1:2, 1:3 при концентрации ферментов в субстрате 0,5, 0,8, 1,0, 1,2%. Наиболее высокий уровень содержания гормонов и факторов роста наблюдался при соотношении сырье:вода 1:1 и 1:2 при концентрации ферментов в субстрате 0,8-1,2%. Ряд опытов были направлены на определение оптимальной частоты ультразвуковых колебаний, а именно в пределах 20, 30, 40, 50 и 60 кГц в течение 2, 3, 4, 5, 6 часов воздействия ультразвука (при ферментативном гидролизе) и в течение 0,5, 1, 2, 3, 4 часов на подготовительной (первой) стадии экстракции. Наиболее высокий уровень выхода гормонов и факторов роста наблюдался при частоте ультразвуковых колебаний 20-50 кГЦ при времени воздействия при ферментативном гидролизе 3-5 часов, при подготовительной стадии 1-3 часа.

Температурные параметры и величина рН при проведении ферментативного гидролиза были обоснованы исходя из следующего: активность фермента пепсина варьирует в пределах рН 1,0-3,9 при оптимуме рН 1,5-2,0 и температуре 32-35°С, а после 40°С начинается резкое снижение его активности, фермент папаин активен при рН 3-12 при оптимуме рН 5,0-7,5 при температуре от 5 до 60°С, а после 60°С снижает свои свойства. Температурный режим проведения подготовительной (первой) стадии экстракции (не выше 39°С) был предопределен тем, что некоторые гормоны и факторы роста, как показали исследования, при температуре выше 40°С инактивируются.

Параметры высокотемпературной экстракции (не выше 120°С) были исследованы в пределах: разведение при соотношении жмых:вода 1:5, 1:6, 1:8, 1:10, 1:12 в течение 6, 8, 10, 12, 14 часов.

В процессе отработки оптимальных параметров способа было выявлено, что интенсификация процесса ферментации в значительной степени зависит от предварительной подготовки сырья, в результате чего были проведены две подготовительные водные экстракции размолотых сырых пантов (опыт 1, опыт 2) и далее опыт 3, 4, 5, 6 с проведением ферментативного гидролиза, опыт 7 - по прототипу. При этом измельчение пантов осуществляли до размера 5-20 мм, что, как показывает практика, позволяет в процессе экстракции избежать чрезмерного слипания частиц и образования конгломерата, что снижает процесс перехода биологически активных веществ из сырья в экстракт.

В таблице 1 отражены результаты по содержанию в полученных концентратах гормонов и факторов роста при средних значениях технологических параметров способа.

Опыт 1. Первая стадия заявленного способа, согласно первому и второму варианту изобретения, без использования ультразвука, являющаяся подготовительной стадией перед ферментативным гидролизом. Водную экстракцию проводили при разведении сырье (панты):вода 1:1 при температуре не выше 39°С в течение 2-х часов (среднее значение при режиме 1-3 часа) с последующей фильтрацией гидролизата.

Опыт 2. Первая стадия заявленного способа, согласно первому и второму варианту изобретения, при использовании ультразвука, с частотой колебаний 37 кГц (среднее значение при режиме 20-50 кГц), являющаяся подготовительной стадией перед ферментативным гидролизом. Водная экстракция при тех же технологических параметрах процесса, как в опыте 1.

Данные исследования были направлены на выявление степени влияния ультразвука, использованного на подготовительной (первой) стадии экстракции на выход гормонов и факторов роста на ферментативных стадиях процесса.

Опыт 3. Вторая и третья стадия заявленного способа, согласно первому и второму варианту изобретения, без использования ультразвука. Водная экстракция жмыха, полученного после проведения опыта 1 в присутствии фермента пепсина, и далее водная экстракция жмыха, полученного после второй стадии в присутствии фермента папаина, при концентрации каждого фермента в субстрате 1,0% (среднее значение от 0,8-1,2%), при разведении жмых:вода 1:1 в течение 4-х (среднее значение 3-5 часов) часов и температуре 35°С при использовании пепсина и 37°С при использовании папаина. Температурные режимы 35°С и 37°С являются средними значениями режима проведения экстракции в присутствии пепсина и папаина при температурных пределах использования этих ферментов 32-39°С и 30-40°С соответственно.

Опыт 4. Вторая и третья стадия заявленного способа, согласно первому и второму варианту изобретения, при использовании ультразвука с частотой колебания 37 кГц, по технологическим параметрам, отраженным в опыте 3.

Опыт 5. Вторая и третья стадия заявленного способа, согласно первому и второму варианту изобретения, без использования ультразвука. Водная экстракция жмыха, полученного после проведения опыта 2, по технологическим параметрам, отраженным в опыте 3.

Опыт 6. Вторая и третья стадия заявленного способа, согласно первому и второму варианту изобретения, при использовании ультразвука с частотой колебания 37 кГц. Водная экстракция жмыха, полученного после проведения опыта 2, по технологическим параметрам, отраженным в опыте 3.

Опыт 7. Ферментативный гидролиз по прототипу при концентрации пепсина и папаина - 2,0% от первоначального веса пантов, при разведении сырье:вода 1:3 при использовании пепсина и разведении 1:1,5 при использовании папаина, при температуре 40°С в течение 4 часов.

Сравнительные опытные данные суммарному выходу гормонов, факторов роста и других биохимических показателей, полученных в процессе проведения ферментативного гидролиза в опытах 3, 4, 5, 6 и по прототипу (опыт 7), представлены в таблице 1.

Как показали исследования (табл. 1), проведение подготовительной стадии (первая стадия заявленного способа) под воздействием ультразвука (опыт 5) по сравнению с опытом 3, где подготовительная стадия проходила без использования ультразвука (при одинаковом ферментативном гидролизе в обоих опытах) позволило увеличить выход гормонов, факторов роста и общих аминокислот на 21,5. 8,0, 10,3% соответственно. Проведение ферментативного гидролиза под воздействием ультразвука (опыт 4) по сравнению с его проведением без ультразвука (опыт 3) при одинаковых условиях проведения подготовительной стадии, позволило увеличить выход гормонов, факторов роста и общих аминокислот на 49,4, 40,7, 18,8% соответственно.

При использовании ультразвука как на подготовительной стадии, так и в процессе ферментативного гидролиза (вторая и третья стадия способа), опыт 6, повышение этих показателей относительно опыта 3 составило 60,2, 58,2, 23,4% соответственно.

Аналогичная тенденция наблюдалась по выходу остальных веществ, что в конечном итоге (опыт 6 относительно опыта 3) составило увеличение показателей для липидов, жирных кислот, макро- и микроэлементов на 11,1, 39,5, 38,8 и 11,9% соответственно. Что касается сравнительных данных суммарного выхода гормонов и факторов роста при использовании заявленного способа (опыт 6) и прототипа (опыт 7), то выход гормонов превысил показатель по прототипу почти в два раза, факторов роста в 1,85 раза, свободных аминокислот в 1,3 раза, как и концентрацию липидов, жирных кислот, макро- и микроэлементов на 14,9, 40,7, 39,7 и 12,0% соответственно.

Кроме этого следует отметить, что пантовый концентрат, полученный в опыте 3 (без ультразвука) и по прототипу (без использования ультразвука) (опыт 7), имеют практически равные показатели по содержанию липидов, жирных кислот и минеральных элементов, однако по концентрации гормонов, факторов роста и аминокислот концентрат, полученный из сырых пантов (опыт 3), превосходит прототип (концентрат на основе консервированных пантов) на 22,6, 18,4 и 5,9% соответственно. Это связано не только с тем, что в процессе консервирования пантов происходит частичное разрушение белковых структур, в том числе гормонов, факторов роста и аминокислот, но и с технологическими параметрами заявленного способа, предопределяющими их высокий выход.

В ходе проведения данных опытов установили, что использование на первой (подготовительной) стадии экстракции чистой воды (без добавления ферментов), но с использованием ультразвуковых колебаний, позволяет максимально экстрагировать кровь из сырых пантов, сохранив ее нативные свойства, в конечном продукте (концентрате). Так, если панты сразу подвергнуть ферментации, например, пепсином при рН 1-3, то белки крови с рН 7,2-7,4 (водородный показатель крови) денатурируются, потеряв свои нативные свойства.

В связи с тем, что в процессе ферментативной реакции происходит образование фермент-субстратных комплексов, которые, подвергаясь химической реакции, разрушаются затем до свободного фермента и продукта распада, а общая скорость реакции зависит от скорости образования и распада этих комплексов, то целесообразно было предположить, что чем выше концентрация субстрата (разведение сырье:вода 1:1-1:2 в заявленном способе) при достаточно высокой концентрации ферментов (при в концентрации фермента в смеси жмых:вода 0,8-1,2% в отличие от 2,0% фермента от количества сырья по прототипу, что при разведении 1:3 значительно снижает концентрацию фермента в субстрате), тем выше скорость протекания процесса ферментации, когда все молекулы фермента насыщены субстратом. Исследования заявленных параметров в ходе проведения предварительных опытов подтвердились высокой эффективностью их использования в заявленном способе в совокупности с другими параметрами.

В таблице 2 отражены результаты серии опытов, проведенных с целью определения оптимального соотношения между концентрацией ферментов в субстрате и концентрацией субстрата.

Исходя из таблицы 2 установлено, что оптимальным содержанием ферментов от массы субстрата является 0,8-1,2%, при разведении субстрата жмых:вода 1:1-1:2. С увеличением степени разведения (1:3) в связи со снижением концентрации субстрата снижался и уровень содержания гормонов и факторов роста, вероятно, из-за снижения скорости протекания ферментации, вследствие слабого насыщения молекул фермента субстратом.

Ферментация пантов ферментами из расчета 0,8-1,2% (от массы полученного субстрата) позволяет максимально эффективно использовать дорогостоящие ферменты, так как после каждой стадии масса пантового жмыха уменьшается вследствие перехода веществ в экстракт, поэтому перед началом следующей стадии после отфильтровывания экстракта проводили взвешивание жмыха добавляли идентичное количества воды и получали количество фермента (0,8-1,2%), необходимого для данной стадии гидролиза.

В ходе проведения ультразвуковой экстракции на второй стадии в присутствие фермента пепсина температура субстрата сохранялась на уровне 35°С, что не отражалась на реакции перехода биологически активных веществ из пантов в экстракт, тогда как для эффективного взаимодействия папаина и пантов (третья стадия) температура процесса на уровне 37°С. При этом по мере разработки заявленного способа были определены оптимальные значения рН при проведении ферментативного гидролиза: с пепсином рН 1-3, с папаином - рН 5,0-7,5.

Ферментативный гидролиз субстрата из сырых пантов при низких температурах позволяет максимально экстрагировать термонестабильные факторы роста и гормоны, поэтому с целью максимального выхода биологически активных веществ.

Согласно второму варианту изобретения, при переработке жмыха, полученного после третьей стадии, использовали критическую температуру (не выше 120°С) (так называемая выварка) и время экстракции (8-12 часов) при соотношении 1:6-1:12, при этом сушка полученного концентрата осуществлялась при более высокой температуре (в отличие от первых трех стадий), однако она не должна превышать 50°С.

Сравнительная эффективность высокотемпературной экстракции жмыха, полученного после окончания ферментативного гидролиза по заявленному способу (при средних значениях технологических параметров) и прототипу, отражена в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, высокотемпературная экстракция жмыха после третьей стадии экстракции по заявленному способу оказалась более эффективной, чем аналогичная экстракция по прототипу, только в отношении выхода общих аминокислот (на 29,7%), липидов (на 16,6%), жирных кислот (на 22,6%), макро- и микроэлементов (на 15,7 и 16,4% соответственно).

Продукт, полученный в процессе высокотемпературной экстракции, согласно первому и второму варианту изобретения, может быть использован как самостоятельно, так и в составе концентрата полученного в процессе первых трех стадий способа согласно первому варианту изобретения.

Сравнительные биохимические свойства концентратов, полученных по заявленному способу и по прототипу, приведены в таблице 4.

Согласно таблице 4 видно, что заявленный способ позволяет получить концентрат с максимальным содержанием факторов роста и гормонов, при этом концентрат превосходит продукт, полученный по способу-прототипу и по другим биологически активным веществам.

При этом необходимо отметить, что если ранее разработанные способы получения пантового концентрата из сырых пантов позволяли получать не более 13,5-15,0% выхода конечного продукта, тогда как заявленный способ обеспечивает выход не менее 28,0-30,0%.

Пример. Один килограмм сырых пантов очищают от механических загрязнений, моют, сушат при комнатной температуре, измельчают до размера частиц 5-20 мм. На первой стадии измельченные панты заливают дистиллированной водой в соотношении панты:вода 1:1 и экстрагируют в течение 3-х часов под воздействием ультразвуковых колебаний частотой 37 кГц (температура субстрата не должна превышать 39°С).

Через три часа полученный экстракт центрифугируют, сливают и фильтруют (вторая стадия), взвешивают пантовый жмых, определяя количество воды, необходимое для его разбавления (из расчета жмых:вода 1:2), и определив массу субстрата (масса воды и жмых), добавляют фермент пепсин из расчета 1,2% от массы субстрата. Экстракцию проводят в течение 4-х часов под воздействием ультразвука (37 кГц) при температуре не выше 35°С.

На третьей стадии (через четыре часа) полученный экстракт центрифугируют, сливают и фильтруют, взвешивают пантовый жмых, определяя количество воды, необходимое для его разбавления (жмых:вода 1:2), после определения массы субстрата (масса воды и жмыха) добавляют к нему 1,0% папаина (30 тыс. ЕД), после чего полученный субстрат экстрагируют в поле ультразвука (37 кГц) в течение 4-х часов при температуре не выше 40°С.

Через четыре часа экстракт сливают, фильтруют, объединяют с первыми двумя и сушат при температуре не более 40°С и давлением не менее - 0,9 атм. Полученный концентрат фасуют в герметичную тару.

Полученный после третьей стадии жмых разбавляют водой (жмых:вода 1:8) подвергают высокотемпературной экстракции (120°С) в течение 10 часов, после чего экстракт центрифугируют, сливают, фильтруют и сушат при температуре не выше 50°С и давлением не менее - 0,9 атм. Полученный концентрат расфасовывают в герметичную тару.

Таким образом, из сырых пантов изготавливается два продукта (концентрата). Первый, с высоким содержанием факторов роста и гормонов, полученный в процессе ферментации при щадящей температуре (не выше 40°С) и в целом при других технологических параметрах (ультразвук, степень разведения в сочетании с концентрацией ферментов) характеризуется их высокой концентрацией. Второй продукт (концентрат) получен, согласно второму варианту изобретения, путем высокотемпературной экстракции и характеризуется высокой концентрацией аминокислот, липидов и минеральных веществ.