СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ АРОМАТАЗЫ ОВАРИАЛЬНЫХ ФОЛЛИКУЛОВ

Изобретение относится к области медицины, а именно к эндокринологии репродукции, и может быть использовано для оценки активности ароматазы овариальных фолликулов.

Наиболее распространенной формой нарушения репродуктивной функции женщины является нормогонадотропная недостаточность яичников, которая характеризуется неизмененным базальным уровнем ФСГ в крови и может быть обусловлена экстрагонадными и овариальными факторами [Айламазян, Э.К. Патогенез нормогонадотропной ановуляции / Э.К. Айламазян, В.В. Потин, Ф.А. Свечникова [и соавт.] // Вестн. Росс. ассоц. акушеров и гинекологов. - 1994. - №1. - С. 46-55].

По данным ВОЗ [National Collaborating Centre for Women's and Children's Health (UK). Fertility: Assessment and Treatment for People with Fertility Problems. London: Royal College of Obstetricians&Gynaecologists (UK); 2013] распространенность этой патологии составляет до 85% от всех нарушений функции яичников. К настоящему времени установлено, что приблизительно у 35% больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников механизм положительной обратной связи в гипоталамогипофизарно-овариальной системе интактен. Овариальная недостаточность у этих больных, следовательно, связана с первично-яичниковыми факторами. Недостаточная продукция эстрогенов доминантным фолликулом может быть обусловлена хроническим аднекситом или аутоиммунным оофоритом [Ниаури Д.А. Репродуктивное здоровье женщины и недостаточность функции яичников / Д.А. Ниаури, Л.Х. Джемлиханова, A.M. Гзгзян // Ж. акуш. и жен. болезн. - 2010. - №1. - С. 84-90]. Другой возможной причиной первично-овариальных нарушений может быть дефект ферментов, ответственных за стероидогенез в яичниках. Можно предположить, что повреждения в гене ароматазы р450, отвечающей за конверсию андрогенов в эстрогены, могут играть определенную роль в патогенезе данной патологии. Энзимный комплекс ароматазы катализирует превращение С-19андрогенных стероидов в эстрогены, то есть реализует биосинтез эстрадиола из тестостерона и эстрона из андростендиона.

Неоднократно были описаны случаи снижения активности ароматазы, связанные с наличием мутаций в гене CYP19, что клинически выражается развитием внутриутробной вирилизации, а в последующем - гипергонадотропной недостаточностью яичников, аменореей, бесплодием, нарушением толерантности к глюкозе, жировым гепатозом, остеопенией [Shozu, М. A new cause off emalepseu do hermaphroditism: placentalaromatasedeficiency / M. Shozu, K. Akasofu, T. Harada // J Clin Endocrinol Metab. - 1991. - Vol. 72. - P. 560-566]. Частичный дефект гена ароматазы р450 CYP19 может быть ответственен за недостаточную продукцию эстрадиола доминантным фолликулом и играть роль в патогенезе ановуляции и бесплодия.

Известно, что ароматазная активность фолликулов отрицательно коррелирует с числом антральных фолликулов в яичниках [Николаенков И.П. Активность овариальной ароматазы у больных синдромом поликистозных яичников / Николаенков И.П., Потин В.В., Тарасова М.А., Ткаченко Н.Н., Ярмолинская М.И., Тимофеева Е.М., Самойлович Я.А. // Журнал акушерства и женских болезней. - 2014. - Т. 53. - №1. - С. 10-16]. АМГ, вырабатываемый в яичниках женщины антральными фолликулами, соответствует их числу [Fanchin R. Serum anti- hormone is more strongly related to ovarian follicular status than semminhibin B, estradiol, FSH and LH on day 3 / Fanchin R. [et al.] // Hum. Reprod. - 2003. - Vol. 18, N2. - P. 323-327]. В недавно проведенных исследованиях [Николаенков И.П. Активность овариальной ароматазы у больных синдромом поликистозных яичников / Николаенков И.П., Потин B.В., Тарасова М.А., Ткаченко Н.Н., Ярмолинская М.И., Тимофеева Е.М., Самойлович Я.А. // Журнал акушерства и женских болезней. - 2014. - Т. 53. - №1. - C. 10-16] было обнаружено, что почти у половины (48,8%) больных синдромом поликистозных яичников (СПЯ) определяется сниженная ароматазная активность фолликулов, что свидетельствует о неоднородности патогенеза самого распространенного заболевания, сопровождающегося нормогонадотропной ановуляцией.

Известно, что в эутопическом эндометрии пациенток с эндометриозом наблюдается увеличенная экспрессия ароматазы по сравнению с женщинами без эндометриоза. Более того, экспрессия ароматазы в эндометриоидных гетеротопиях в несколько раз выше, чем в эутопическом эндометрии, причем наибольшая экспрессия отмечена в красных гетеротопиях [Inflammatory Status Influences Aromatase and Steroid Recep tor Expression in Endometriosis / O. Bukulmez, D.B. Hardy, B.R. Carr [et al.] // Endocrinology. - 2008. - Vol. 149, N 3 - P. 1190-1204]. Повышение экспрессии ароматазы в эндометрии также наблюдается при других воспалительных и пролиферативных заболеваниях, включая аденомиоз, лейомиому и карциному эндометрия [Reich O. Aromatas eexpression in low-grade endometrial stromal sarcomas: an immune histo chemical study / O. Reich, S. Regauer // ModernPathology. - 2004. - Vol. 17, N 1. - P. 104-108; The effect of oral contraceptives on aromatase and Cox-2 expression in the endometrium of patients with idiopathic men orrhagia or adenomyosis / H. Maia, C. Haddad, N. Pinheiro [et al.] // Int. J. Women's Health. - 2013. - Vol. 5. - P. 293-299; Inflammatory Status Influences Aromatase and Steroid Receptor Expression in Endometriosis / O. Bukulmez, D.B. Hardy, B.R. Carr [et al.] // Endocrinology. - 2008. - Vol. 149, N 3. - P. 1190-1204].

Известен способ оценки активности ароматазы по соотношению содержания андрогенов и эстрогенов в крови [Мишарина Е.В. Содержание эстрона, андростендиона и β-эндорфина у женщин с ожирением и гормональной недостаточностью яичников: автореф. дис. … канд. мед. наук. - СПб., 1993].

Недостаток способа состоит в том, что этот способ приемлем для косвенной оценки суммарной ароматазной активности и не позволяет определить активность именно овариальной ароматазы.

Известен способ оценки активности ароматазы, в котором суммарная ароматазная активность может быть измерена путем белкового иммуноблоттинга [Lin L. Variable phenotypes associated with aromatase (CYP19) insufficiency in humans / L. Lin [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2007. - V. 92. P. 982-990]. В процессе определения ароматазной активности используется электрофорез белков крови в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине или по трехмерной структуре нативных белков. Далее белки переносятся на нитроцеллюлозную мембрану, где ароматаза определяется с использованием специфических антител.

Недостатком способа является его трудоемкость и необходимость специальной аппаратуры.

Известен способ оценки активности ароматазы, используемый в онкологической практике, при котором активность ароматазы в различных тканях определяют радиометрическим методом, основанным на превращении меченого тритием андростендиона в «тяжелую воду» (3Н-H2O) [Ларионов А.А. Конверсия андростендиона в опухолевой и экстрагонадных тканях и ее связь с гормонально-метаболическими факторами у больных раком молочной железы: автореф. дис. … канд. мед. наук. - СПб., 1997].

Недостатком способа является его инвазивность.

Известен способ оценки активности ароматазы, при котором оценку ароматазной активности в отдельных органах и тканях, в том числе в яичниках женщины, осуществляют иммуногистохимическим методом [Suzuki T. Quantitation of Р450 aromatase immunoreactivity in human ovary during the menstrual cycle: relationship between the enzyme activity and immunointensity / T. Suzuki [et al.] // J. Histochem. Cytochem. - 1994. - Vol. 42, N12. - P. 1565-1573]. Способ основан на связывании немаркированных первичных кроличьих поликлональных антител с ароматазой р450 с образованием иммунного комплекса. Далее иммунный комплекс визуализируется при помощи вторичных меченых антител, при этом первичные антитела служат для вторичных антигенами. Иммуногистохимическое исследование проводится на парафиновых срезах. Срезы ткани толщиной 5 мкм помещаются на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина. Количественную оценку результатов иммуногистохимических реакций проводят на микрофотографиях, полученных с помощью системы фиксации микроскопических изображений, состоящей из микроскопа, цифровой камеры, персонального компьютера, программного обеспечения АСТ-1, версия 2.12 и «Видеотест-Морфология 5.0». Фотосъемку поводят на увеличении 400× (окуляр 10×, объектив 40×), с полным закрытием апертурной диафрагмы, при поднятом консендоре, в режиме Photo, время экспозиции 1/20 с, чувствительность камеры - максимальная, размер изображения 1280×1024 пикселей, графический формат изображения JPEG (normal). Определяется ароматазная активность в гранулезных клетках фолликулов, используя показатель интегральной оптической плотности и количества клеток гранулезы в объекте.

Недостатком данного способа является необходимость инвазивных процедур, чрезвычайная трудоемкость.

Известен способ оценки активности ароматазы овариальных фолликулов (ароматазной активности) путем проведения пробы с летрозолом (Патент RU 2481587, опубл. 10.05.2013, бюл. №13). В сыворотке крови определяют содержание гормонов ЛГ, ФСГ, эстрадиола, общего тестостерона и свободного тестостерона до и после перорального приема 10 мг ингибитора ароматазы летрозола. Ароматазную активность определяют по интенсивности снижения эстрадиола (ΔЭ2) и повышению содержания андрогенов и гонадотропинов в крови в баллах.

Недостатком способа является обширное дорогостоящее гормональное обследование. Метод дает представление о суммарной ароматазной активности яичников. Изменения гонадотропинов в крови являются косвенными показателями снижения Э2 в крови и зависят от состояния негативной обратной связи в гипоталамо-гипофизарно-овариальной системе.

Известен способ оценки ароматазной активности (Патент RU 2549491, опубл. 27.04.2015, бюл. №12), в котором на второй день менструального цикла до приема летрозола определяют уровень эстрадиола и уровень антимюллерова гормона (АМГ), отражающий число антральных фолликулов, а после приема летрозола(через 48 часов) - вторично уровень эстрадиола, определяют абсолютное значение изменения уровня эстрадиола(ΔЭ2) и вычисляют коэффициент овариальной ароматазной активности как отношение К=ΔЭ2/АМГ, по значениям которого оценивают овариальную ароматазную активность как низкую, нормальную или высокую.

Недостатком данного способа является использование дорогостоящего препарата ингибитора ароматазы летрозола и относительная продолжительность исследования. Этот способ принят авторами за прототип.

Техническим результатом настоящего изобретения является определение уровня ароматазной активности более простым способом, без использования пробы с летрозолом.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки активности ароматазы овариальных фолликулов, включающем определение базального уровня эстрадиола и уровня антимюллерова гормона в сыворотке крови на 2-й день менструального цикла, согласно изобретению, базальный уровень эстрадиола определяют однократно, без применения ингибитора ароматазы летрозола, и вычисляют коэффициент активности ароматазы овариальных фолликулов по следующей формуле:

,

где К_А - коэффициент активности ароматазы овариальных фолликулов;

Э2 - базальный уровень эстрадиола в крови на 2-й день менструального цикла, пмоль/л;

АМГ - уровень антимюллерова гормона в крови на 2-й день менструального цикла, нг/мл;

и оценивают активность ароматазы овариальных фолликулов следующим образом: при К_А<37,8 - низкая овариальная ароматазная активность, при 37,8≤К_А≤90,7 - нормальная, при К_А>90,7 - высокая.

Для верификации предложенного способа было обследовано 15 здоровых женщин репродуктивного возраста (средний возраст составил 26,9±0,7 лет) с полноценным овуляторным циклом и 190 женщин с нормогонадотропной недостаточностью яичников, подтвержденных ультразвуковым исследованием органов малого таза и уровнем прогестерона в крови на 20-21 день менструального цикла. Женщинам обеих групп проведена проба с пероральным приемом 10 мг ингибитора ароматазылетрозола, с определением в крови эстрадиола и АМГ до приема и эстрадиола через 48 часов после приема летрозола (по способу, взятому за прототип). В группе здоровых женщин имелась статистически значимая (р=0,01) корреляция между коэффициентами К и К_А, определенными способом-прототипом и предлагаемым способом соответственно (r=0,7). В группе больных с нормогонадотропной ановуляцией также имелась статистически значимая (р=0,01) корреляция между указанными коэффициентами Ки К_А (r=0,9).

У здоровых женщин границы доверительного интервала коэффициента К_А при р=0,01 составили: нижняя - 37,8, верхняя - 90,7. Отсюда следует, что значение К_А<37,8 указывает на низкую активность ароматазы овариальных фолликулов, тогда как значение К_А>90,7 соответствует высокой активности ароматазы овариальных фолликулов.

Из 190 больных с нормогонадотропной ановуляцией с помощью предложенного способа у 75 выявлена низкая, у 70 - неизмененная, у 45 женщин - высокая овариальная ароматазная активность.

Способ выполняется, например, следующим образом.

Утром на 2-й день менструального цикла из локтевой вены больной забирают 10 мл крови для гормонального исследования. Иммуноферментным методом определяют уровни АМГ и Э2. Об активности ароматазыовариальных фолликулов судят по коэффициенту К_А=Э2/АМГ, с последующей его оценкой: при К_А<37,8 - низкая активность, при К_А>90,7 - высокая, при 37,8≤К_А≤90,7 - нормальная.

Сущность способа иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Больная Л.Т.Н., 25 лет. Диагноз: Синдром поликистозных яичников. Нормогонадотропная недостаточность яичников. Ановуляция. Гирсутизм I ст. Бесплодие первичное - 2 года.

Больная обследована предлагаемым способом. Базальный уровень эстрадиола на 2-й день менструального цикла составил 126,5 пмоль/л, уровень АМГ - 12,8 нг/мл. Соотношение Э2/АМГ составило 9,9, что соответствует низкой активности ароматазы овариальных фолликулов.

Пример 2. Больная С.Т.Н., 29 лет. Диагноз: Наружный генитальный эндометриоз. Нормогонадотропная недостаточность яичников. Ановуляция. Бесплодие первичное - 1 год.

Больная обследована предлагаемым способом. Базальный уровень эстрадиола на 2-й день менструального цикла составил 174,4 пмоль/л, уровень АМГ - 1,2 нг/мл. Соотношение Э2/АМГ составило 145,3, что соответствует высокой активности ароматазы овариальных фолликулов.

Пример 3. Больная М.Т.Ф., 27 лет. Диагноз: Синдром поликистозных яичников. Нормогонадотропная недостаточность яичников. Ановуляция. Опсоменорея. Гирсутизм 1 ст.

Больная обследована предлагаемым способом. Базальный уровень эстрадиола на 2-й день менструального цикла составил 162,1 пмоль/л, уровень АМГ - 3,9 нг/мл. Соотношение Э2/АМГ составило 41,6, что соответствует нормальной активности ароматазы овариальных фолликулов.

Предлагаемый способ позволяет с высокой точностью (99%) оценивать активность ароматазы овариальных фолликулов неинвазивным путем и без использования ингибитора ароматазы летрозола, прост в исполнении. Метод определения активности ароматазы антральных фолликулов может быть использован для выбора способа индукции овуляци при ановуляторном бесплодии. Диагностика высокой овариальной ароматазной активности может иметь существенное значение для решения вопроса о лечебном применении ингибиторов ароматазы при эстрогензависимых заболеваниях (эндометриоз, миома матки, рак эндометрия, опухоли молочной железы).