Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ МИКРОВОДОРОСЛИ CHLORELLA VULGARIS BEYERINCK - ПРОДУЦЕНТ СМЕСИ ДУШИСТЫХ ВЕЩЕСТВ, АНАЛОГИЧНОЙ РЕЗИНОИДУ ДУБОВОГО МХА

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для применения в качестве продуцента душистых соединений. Целью изобретения является получение нового штамма микроводоросли Chlorella vulgaris Beyerinck SMP-1802153, синтезирующего душистые соединения, аналогичные резиноиду дубового мха. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris Beyerinck SMP-1802153 является мутантом, селекционированным в лаборатории Пензенского государственного университета из популяции штамма Chlorella vulgaris BIN (автор Богданов Н.И.).

Настоящее изобретение относится к альгологически чистой культуре штамма микроводоросли Chlorella vulgaris Beyerinck, которая может быть использована в качестве продуцента смеси душистых веществ, аналогичной резиноиду дубового мха.

В настоящее время известны технологии получения индивидуальных душистых веществ с использованием микроорганизмов, способных как продуцировать их de novo, так и биоконвертировать из дополнительно введенных в питательную среду компонентов [1, 2]. За рубежом в производственных условиях осуществляются биотехнологии 4-декалактона с персиковым запахом (BASF), ванилина (Evolva), макроциклических компонентов мускуса (Nippon Mining Co., Quest International) [3, 4]. Однако производство смеси душистых соединений, аналогичной резиноиду дубового мха, не реализовано. Проведенные в 70-е годы прошлого века исследования Велева Ч., Михайловой С. показали возможность получения ароматического продукта, аналогичного резиноиду дубового мха, на основе хлорококковых микроводорослей [6].

Предлагаемый штамм микроводоросли Chlorella vulgaris Beyerinck SMP-1802153 новый, в научной и патентной литературе не описан и депонирован в коллекции микроводорослей ИФР РАН (IPPAS) под номером IPPAS С-2019.

Известен штамм водоросли Chlorella vulgaris ИФР С-66, обладающий высокой продуктивностью и отвечающий требованиям промышленного культивирования [5]. Однако по сравнению с прототипом при одинаковых условиях культивирования и выделения (экстракция этиловым спиртом 96%) предлагаемый штамм отличается большим содержанием целевого продукта (табл. 1).

Идентификацию штамма проводили по основным культурально-морфологическим признакам, физиолого-биохимическим свойствам согласно Определителю низших растений «Водоросли» [7-10].

Для проверки чистоты культуры был произведен посев образца на средах Тамия, Майерса, Хогланда, агар Сабуро и мясо-пептонный агар в течение 14 суток, микроскопический контроль однородности культуры.

Морфология. Молодые клетки слабоэллипсоидной формы, размером от 1,5 до 2,0 мкм. Взрослые - шаровидные (сферические) размером 5-8 мкм.

Имеется пиреноид. Хроматофор чашевидный (широкопоясковидный незамкнутый), иногда сетчато-продырявленный, зеленого или темно-зеленого цвета. Жгутики отсутствуют.

Физиолого-биохимические свойства. Нейтрофил, мезофил, теневынослив, автотроф. Оптимальная температура роста 26-32°С. Освещение естественное или искусственное при 16-18-часовом фотопериоде. Освещенность 14 клк лампами ДРЛФ, ДРИ. Оптимум рН лежит в диапазоне 6,5…7,5. Нетребователен к источникам азотного питания, наравне с аммиачной селитрой хорошо растет на любых азотсодержащих минеральных солях. Не требует подачи в культуру углекислого газа. Устойчивое развитие штамма не зависит от сезона года или источника освещения; культура может длительное время находиться в состоянии анабиоза. Обладает устойчивостью к поражению бактериями (проявляет хорошо выраженные антагонистические свойства при плотности клеток в культуре более 10 млн./мл, гибель бактерий наступает через 6-10 часов культивирования). Резиноид хлореллы содержит глико- и фосфолипиды (52,42%), стеролы (0,03%), триацилглицеролы (2,41%), жирные кислоты (2,16%), каротиноиды (1,01%), хлорофиллы (2,44%). Продуктивность селекционированного штамма Chlorella vulgaris Beyerinck SMP-1802153 по накоплению биомассы составляет (сухой вес, мг/мл в сутки) 1-1,5 и выход продукта 11,88…15,95% сухого вещества.

Условия хранения штамма.

Методы хранения: в пробирках на твердой скошенной агаризованной среде при температуре 8-24°С, выдерживает отрицательные температуры в замороженном состоянии длительное время, освещенность 2-4 клк, возможно на рассеянном свету. Оптимальный срок хранения 6 мес. Максимальный - до 1,5 лет.

Среды хранения: агаризованная Тамия (г/л: KNO₃ - 5,0; MgSO₄*7H₂O - 2,5; KH₂PO₄ - 1,25; FeSO₄*7H₂O - 0,003; ЭДТА - 0,037; агар-агара - 20,0; раствор микроэлементов 1 мл).

Жидкая Тамия (г/л: KNO₃ - 5,0; MgSO₄*7H₂O - 2,5; KH₂PO₄ - 1,25; FeSO₄*7H₂O - 0,003; ЭДТА - 0,037; раствор микроэлементов 1 мл).

Раствор микроэлементов, г/л: KCl - 3,726; H₃BO₃ - 1,546; MnSO₄*H₂O - 0,338; ZnSO₄*7H₂O - 0,575; CuSO₄*5H₂O - 0,125; H₂MoO₄ - 0,08.

Среды культивирования:

Тамия, г/л: KNO₃ - 5,0; MgSO₄*7H₂O - 2,5; KH₂PO₄ - 1,25; FeSO₄*7H₂O - 0,003; ЭДТА - 0,037; раствор микроэлементов 1 мл.

Майерса, г/л: KNO₃ - 1,213; MgSO₄*7H₂O - 1,204; KH₂PO₄ - 1,224; Fe₂(SO₄)₃ - 0,0747; раствор микроэлементов - 0,5 мл.

Раствор микроэлементов, г/л: H₃BO₃ - 2,86; MnCl₂*4H₂O - 1,81; ZnSO₄*7H₂O - 0,222; MoO₃ - 176,4 мг/10 л; NH₄VO₃ - 229,6 мг/10 л; CuSO₄*5H₂O - 0,01 мг/л; Co(NO₃)₂*4H₂O - 0,146; KI - 0,083; NaWO₄*H₂O - 0,033; NiSO₄(NH₄)SO₄*6H₂O - 0,198.

Хогланда, г/л: KNO₃ - 0,25; KH₂PO₄ - 0,05; Ca(NO₃)₂*4H₂O - 0,25; MgSO₄ - 0,1; FeЭДТА - 0,05; раствор микроэлементов - 0,5 мл.

Раствор микроэлементов, г/л: KCl - 3,726; Н₃ВО₃ - 1,546; MnSO₄*H₂O - 0,338; ZnSO₄*7H₂O - 0,575; CuSO₄*5H₂O - 0,125; H₂MoO₄ - 0,081.

Температура и время культивирования: 30°С, 14 суток.

Частота пересевов: 2 раз в год при хранении при температуре 24°С.

Использование нового штамма Chlorella vulgaris иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм выращивали в течение 14 суток при 30°С, освещенности 14 клк, во флаконах 400 мл на среде следующего состава (г/л): KNO₃ - 5,0; MgSO₄*7H₂O - 2,5; KH₂PO₄ - 1,25; FeSO₄*7H₂O - 0,003; ЭДТА - 0,037; раствор микроэлементов (г/л: H₃BO₃ - 2,86; MnCl₂*4H₂O - 1,81; ZnSO₄*7H₂O - 0,222; MoO₃ - 176,4 мг/10 л; NH₄VO₃ - 229,6 мг/10 л; CuSO₄*5H₂O - 0,01 мг/л; Co(NO₃)₂*4H₂O - 0,146; KI - 0,083; NaWO₄*H₂O - 0,033; NiSO₄(NH₄)SO₄*6H₂O - 0,198) - 1 мл; воды дистиллированной до 1 л. Вводили в каждый флакон 40 мл суспензии штамма с плотностью клеток 0,9 млн/мл и выращивали 14 суток. 25 г сухой биомассы использовали для экстракции. Резинойд экстрагировали этиловым спиртом 96%. Количество ароматического продукта составило 3,73 г. Выход 14,91% в расчете на сухую биомассу.

Пример 2. Штамм выращивали в течение 14 суток при 30°С, освещенности 14 клк, во флаконах 400 мл на среде следующего состава (г/л): KNO₃ - 1,213; MgSO₄*7H₂O - 1,204; KH₂PO₄ - 1,224. Fe₂(SO₄)₃ - 0,0747; раствор микроэлементов (г/л: H₃BO₃ - 2,86; MnCl₂*4H₂O - 1,81; ZnSO₄*7H₂O - 0,222; MoO₃ - 176,4 мг/10 л; NH₄VO₃ - 229,6 мг/10 л; CuSO₄*5H₂O - 0,01 мг/л; Co(NO₃)₂*4H₂O - 0,146; KI - 0,083; NaWO₄*H₂O - 0,033; NiSO₄(NH₄)SO₄*6H₂O - 0,198) - 0,5 мл; воды дистиллированной до 1 л.

Инокулировали по 40 мл суспензии штамма с плотностью клеток 0,9 млн/мл и выращивали 14 суток. 25 г сухой биомассы использовали для экстракции. Резиноид экстрагировали этиловым спиртом 96%. Количество ароматического продукта составило 3,44 г с выходом 13,76% в расчете на сухую биомассу.

Пример 3. Штамм выращивали в течение 14 суток при 30°С, освещенности 14 клк, во флаконах 400 мл на среде Хогланда следующего состава (г/л): KNO₃ - 0,25; KH₂PO₄ - 0,05; Ca(NO₃)₂*4H₂O - 0,25; MgSO₄ - 0,1; FeЭДТА - 0,05; раствор микроэлементов (г/л: KCl - 3,726; H₃BO₃ - 1,546; MnSO₄*H₂O - 0,338; ZnSO₄*7H₂O - 0,575; CuSO₄*5H₂O - 0,125; H₂MoO₄ - 0,081) - 0,5 мл; воды дистиллированной до 1 л.

Вносили по 40 мл суспензии штамма с плотностью клеток 0,9 млн/мл и выращивали 14 суток. 25 г сухой биомассы использовали для экстракции. Резиноид экстрагировали этиловым спиртом 96%. Количество ароматического продукта составило 2,97 г (выход 11,88%).

Список литературы

1. Krings, U. Biotechnological production of flavours and fragrances. / U. Krings, R.G. Berger // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1998. - V. 49. - P. 1-8.

2. Biotechnological production of bioflavors and functional sugars. / J.L. Bicas, J.C. Silva, A.P. Dionisio, G.M. Pastore // Ciencia e Technologia de Alimentos. - 2010. - V. 30, №1. - P. 7-18.

3. Production of flavours by microorganisms. / L. Janssens, H.L. De Pooter, N.M. Schamp, E.J. Vandamme // Process Biochemistry. - 1992. - V. 27. - P. 195-215.

4. Bomgardner, M.M. The sweet smell of microbes. / M.M. Bomgardner // Chemical & Engineering News. - 2012. - V. 90, №29. - P. 25-29.

5. A.c. 1638157 СССР. Способ получения резиноида микроводорослей. / Бугорский П.С., Родов B.C., Семенова Е.Ф., Клячко-Гурвич Г.Л. (СССР). - Заявл. 22.03.89 (заявка №4665003 с датой приоритета изобретения 22.03.1989). Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 01.12.1990 г. Опубл. 30.03.91, БИ №12.

6. Белев И., Михайлова С. Технология за получаване на резиноид и абсолю от хлорококални микроводоросли // Растениеводни науки. - 1976. - 13, №4. - С. 10-17.

7. Гарибова Л.В., Дундин Ю.К., Коптяева Т.Ф., Филин В.Р. Водоросли, лишайники и мохообразные СССР. - М.: Мысль, 1978. - 365 с.

8. Зинова А.Д. Определитель зеленых, бурых и красных водорослей южных морей СССР. - Л.: Наука, 1967. - 220 с.

9. Определитель низших растений. Под общей ред. Л.И. Курсанова. - М., 1953. - Т. 1-2 «Водоросли». - 396 с.

10. Андреева В.М. Род Chlorella. Морфология, систематика, принципы классификации. - Л., 1975. - 88 с.

Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris Beyerinck IPPAS C-2019 - продуцент смеси душистых веществ, аналогичной резиноиду дубового мха.