СПОСОБ ТЕСТИРОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ С ПРЕДПОЛАГАЕМЫМ ПСИХОТРОПНЫМ ИЛИ АКТОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

Изобретение относится к области исследований, касающихся изучения спектра нейропсихотропной активности и побочных эффектов новых фармакологических веществ, действующих преимущественно на центральную нервную систему, а именно при изучении механизмов влияния новых синтезированных химических соединений и уже известных препаратов (с психотропными и актопротекторными свойствами) на доклиническом этапе наблюдения.

К настоящему времени в практике исследований влияния различных химических веществ на поведение биологических объектов существуют различные способы, базирующиеся на оценке их тревожно-фобических состояний. Разработанные способы отличаются по используемым видам лабораторных животных, поведенческим моделям, последовательности процедуры тестирования, а также по критериям оценки степени выраженности состояния тревожности у биообъектов.

Известен способ оценки тревожно-фобического состояния в открытом поле. Методика открытого поля в традиционном варианте широко используется в психофармакологии для изучения влияния веществ на ориентировочно-исследовательское поведение, двигательную активность и выявление анксиолитического либо анксиогенного действия (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под. ред. В.П. Фисенко. - Москва. 2000. - С. 121-137). Основными оцениваемыми показателями, характеризующими эмоциональную реактивность по данной методике, являются вегетативные проявления. Вегетативные проявления, которые удобно учитывать вместе с измерением активности, - это дефекация, мочеиспускание [Hall C.S. Emotional behavior in the rat. I Defecation and urination as measures of individual differences in emotionality. J. сотр. Physiol. - 1934. - Vol. 18. - P. 385-403].

Однако без учета характера эмоционально-стрессовой реакции животных в условиях этой модели анксиолитическое либо анксиогенное действие не выявляется отчетливо. Ведь известно, что в зависимости от индивидуальных, наследственных, конституционных характеристик эмоционально-стрессовое воздействие по-разному влияет на отдельных особей. У одних стрессовый ответ сопровождается активацией деятельности и ее продуктивности, а у других эмоциональный стресс приводит к дезорганизации поведения или к пассивному отстранению от решения проблем (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под. ред. В.П. Фисенко. Москва. - 2000. - С. 121-137). Поэтому методика открытого поля не является высокочувствительным тестом для оценки тревожно-фобического состояния животных.

Известен метод оценки тревожно-фобического состояния в темно-светлой камере, основанный на исследовании поведения в конфликтной ситуации (конфликт между ориентировочно-исследовательской мотивацией, направленной на ознакомление со всей камерой, и норковым рефлексом - убеганием в предпочитаемый темный отсек) (Куприянов В.В., Караганов Я.Л., Козлов В.И. Микроциркуляторое русло. - М. 1975). Очевидным преимуществом подобного метода является доступность, простота обслуживания, требующая незначительного времени тестирования.

Однако описанный метод не обладает надежной воспроизводимостью полученных результатов. Ни один из испытанных анксиолитиков и анксиогенов не оказывал стабильного воспроизводимого действия на частоту переходов между светлым и темным отсеками и на предпочтение темноты в темно-светлой камере (Лапин И.П. Отсутствие воспроизводимых эффектов анксиолитиков и анксиогенов на поведение мышей разных линий в темно-светлой камере // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1992. - Т. - 55. - №1. - С. 10-13).

Известен многопараметровый метод оценки тревожно-фобического состояния животных, основанный на балльной интерпретации полученных результатов, с использованием оценочной шкалы, для максимальной объективизации оценочных критериев. Метод позволяет дать комплексную характеристику индивидуального уровня тревожности у животных и его изменений при многократном тестировании по совокупности поведенческих реакций в батарее этологически адекватных тестов, основанных на создании эмоциогенных ситуаций (Родина В.И., Крупина Н.А., Крыжановский Г.Н., Окнина Н.Б. Новый метод оценки тревожно-фобических состояний у крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1992. - №7 - С. 11-13).

Недостатком указанного метода является длительность процедуры тестирования.

Известен способ оценки тревожно-фобического состояния с использованием приподнятого крестообразного лабиринта, основанный на конкуренции двух процессов - страха (фобии) и исследовательского любопытства. Способность большинства позвоночных избегать опасных последствий спуска (падения) с поднятой платформы на нижележащую поверхность является врожденной реакцией, имеющей большую адаптивную значимость для всех млекопитающих (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под. ред. В.П. Фисенко. - Москва. - 2000. - С. 127-128).

Следует отметить, что результаты тестирования животных этим способом зависят от множества факторов, из-за чего результаты оценки известных лекарственных препаратов, обладающих анксиогенными побочными эффектами, бывают достаточно неоднозначными. Исходные количественные показатели методики при этом были сопоставимы с изменениями поведения, характерными для тревожного состояния. Кроме того, в существующем способе не учитывается влияние на состояние экспериментальных животных процедуры тестирования и манипуляции введения оцениваемых препаратов. Данные обстоятельства существенно затрудняют интерпретацию полученных результатов и снижают их достоверность из-за сильной зависимости последних от процедуры проведения эксперимента, а также отсутствие возможности учитывать влияние на состояние биообъектов манипуляции введения оцениваемых препаратов.

Известен также способ тестирования препаратов с предполагаемым психотропным или актопротекторным действием, включающий формирование контрольной и экспериментальных групп животных, введение им препарата и тестирование животных, при этом предварительно для каждого животного обеих групп определяют значения когнитивных способностей и исследовательской активности, мотивационно-энергетических показателей и уровня тревожности, которые сопоставляют с ранее полученными характеристиками врожденной формы поведенческой активности и, в соответствии с этим, разделяют животных на три типа, определяющие возможность их эффективного использования для тестирования препаратов того или иного действия, (см. Баталова Т.А. Психобиологические особенности при комплексной коррекции у крыс. Автореф. дисс. докт. биол. наук. Благовещенск. 2011).

Недостаток этого способа - на этапе предварительного отбора лабораторных животных необходимо проводить тестирование в нескольких (открытое поле и (или) приподнятый крестообразный лабиринт, универсальная камера) экспериментальных установках, что требует временных затрат и увеличивает объем математических расчетов при обработке полученных результатов, а также отрицательно влияет на поведенческий статус животного при его транспортировке в различные инструментальные среды. Все это снижает достоверность результатов тестирования препаратов с предполагаемым психотропным или актопротекторным действием, увеличивает продолжительность отбора животных и требует значительного расширения ассортимента испытательного оборудования, задействуемого при их отборе.

Задачей изобретения является повышение достоверности результатов тестирования препаратов с предполагаемым психотропным или актопротекторным действием.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, заключается в обеспечении возможности проведения предварительного отбора животных с использованием одного известного инструментального средства, выполненного с возможностью произвольного изменения его архитектуры, при этом обеспечивается количественная оценка реакций животных, что повышает достоверность их разделения на типы. При этом уменьшается время на проведение процедуры тестирования для предварительного отбора лабораторных крыс, которые при этом в меньшей степени подвергаются дополнительным (непроизвольным) внешним влияниям. Кроме того, обеспечивается возможность эффективного (достоверного) тестирования животных всех поведенческих типов (с применением вариантов лабиринта различной сложности), что открывает дополнительные возможности для выявления биологических свойств новых соединений с предполагаемым психотропными и актопротекторными свойствами.

Для решения поставленной задачи способ тестирования препаратов с предполагаемым психотропным или актопротекторным действием, включающий формирование контрольной и экспериментальных групп животных, введение им препарата и тестирование животных, при этом предварительно для каждого животного обеих групп определяют значения когнитивных способностей и исследовательской активности, мотивационно-энергетических показателей и уровня тревожности, которые сопоставляют с ранее полученными характеристиками врожденной формы поведенческой активности и, в соответствии с этим, разделяют животных на три типа, определяющие возможность их эффективного использования для тестирования препаратов того или иного действия, отличается тем, что первый тип включает особей с изначальным когнитивным показателем от 0 до 45%, имеющих интегральный показатель исследовательской активности в пределах от 60 до 100%, при этом второй тип включает особей с изначальным когнитивным показателем от 45 до 60%, имеющих интегральный показатель исследовательской активности в пределах от 45 до 60%, при этом третий тип включает особей с изначальным когнитивным показателем от 60 до 100%, имеющих интегральный показатель исследовательской активности в пределах от 0 до 45%, кроме того, животных первого типа используют для исследования психотропных препаратов, животных второго типа используют для изучения как психотропных, так и актопротекторных препаратов, а животных третьего типа используют предпочтительно для изучения актопротекторных препаратов, кроме того, тестирование по предварительному отбору лабораторных животных производят на одном и том же инструментальном средстве, выполненном с возможностью произвольного изменения его архитектуры, в виде приподнятого крестообразного лабиринта, открытого поля или универсальной проблемной камеры, при этом регистрируют качественные и количественные показатели как врожденного, так приобретенного поведения. Кроме того, после определения типологической принадлежности животного, при необходимости проведения серийного тестирования с неоднократным его помещением в инструментальное средство, перед последующим испытанием изменяют формы лабиринта. Кроме того, чем выше когнитивный показатель животного, тем более сложной формы лабиринт предъявляется для него. Кроме того, при необходимости использования в тестировании животных третьей группы, его начинают с использования лабиринта более сложной формы, чем использованный при тестировании первого и второго типов.

Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию "новизна".

При этом признаки отличительной части формулы изобретения обеспечивают решение комплекса функциональных задач:

Признаки, указывающие, что «…первый тип включает особей с изначальным когнитивным показателем от 0 до 45%, имеющих интегральный показатель исследовательской активности в пределах от 60 до 100%, при этом второй тип включает особей с изначальным когнитивным показателем от 45 до 60%, имеющих интегральный показатель исследовательской активности в пределах от 45 до 60%, при этом третий тип включает особей с изначальным когнитивным показателем от 60 до 100%, имеющих интегральный показатель исследовательской активности в пределах от 0 до 45%», позволяют разделить животных по типам, в зависимости от количественной оценки показателей количественно, характеризующих их поведение.

Признаки, указывающие, что «…животных первого типа используют для исследования психотропных препаратов, животных второго типа используют для изучения как психотропных, так и актопротекторных препаратов, а животных третьего типа используют предпочтительно для изучения актопротекторных препаратов», определяют области предпочтительного использования каждого типа животных.

Признак, указывающий, что «…тестирование по предварительному отбору лабораторных животных производят на одном и том же инструментальном устройстве, выполненном с возможностью произвольного изменения его архитектуры», исключает операции переноса животного из одного устройства в другое и исключает необходимость использования большого набора таких устройств.

Признак, указывающий, что инструментальное средство выполнено «в виде приподнятого крестообразного лабиринта, открытого поля или универсальной проблемной камеры», конкретизирует формы инструментального средства, которые используют при определении показателей.

Признаки, указывающие, что «…регистрируют качественные и количественные показатели как врожденного, так приобретенного поведения», позволяют оценить степень влияния тестируемого препарата на животное.

Признаки, указывающие, что «…после определения типологической принадлежности животного, при необходимости проведения серийного тестирования с неоднократным его помещением в инструментальное средство, перед последующим испытанием изменяют формы лабиринта», исключают проявление эффекта «привыкания» животного на показатели, оценивающие его поведение.

Признаки, указывающие, что «…чем выше когнитивный показатель животного, тем более сложной формы лабиринт предъявляется для него» , повышают достоверность оценки поведения животных относящихся ко второй и третьей группам.

Признаки, указывающие, что «…при необходимости использования в тестировании животных третьей группы, его начинают с использования лабиринта более сложной формы, чем использованный при тестировании первого и второго типов», повышают достоверность оценки поведения животных относящихся третьей группе.

Изобретение иллюстрируется чертежами, где на фиг. 1 схематически показан общий вид инструментального устройства, на фиг. 2 показан вид блоков, заполняющих пространство инструментального устройства; на фиг. 3-5, показаны варианты лабиринтов разного уровня сложности; На фиг. 6 показаны результаты изучения взаимосвязи когнитивного показателя с исследовательской активностью и тревожностью.

При изучении когнитивных способностей лабораторных животных в эксперименте и способов их коррекции с помощью психотропных соединений необходимо учитывать индивидуальную типологическую принадлежность лабораторных крыс на основании соотношения двух самостоятельных форм поведенческой активности, а именно: поисковой (включающую мотивационно-энергетические и когнитивные показатели) и исследовательской (включающую тревожно-эмоциональный компонент и собственно исследовательский компонент) (см. Сергиевич А.А. Взаимосвязи когнитивных способностей с исследовательской активностью, эмоциональностью и мотивационно-энергетическими показателями. Автореф. Дисс. канд. биол. наук. Благовещенск. 2004).

Исходя из этого лабораторные крысы могут быть разделены на три достоверно дифференцируемых поведенческих типа: первый - с низкими уровнем когнитивных способностей и высоким уровнем исследовательской активности; второй - со средними значениями уровней когнитивных способностей и исследовательской активности; третий - с высокими показателями уровня когнитивных способностей и низкими исследовательской активности (см.Grigor′ev N.R., Batalova Т.А., Kirichenko E.F., Sergievich A.A., Cherbikova G.E. Tipological Features in the Behavior of Rats // Neuroscience and Behavioral Physiology. 2008. №6. P. 597-603).

Для решения поставленной задачи используется универсальное устройство с изменяемой архитектурой (см. RU №2332166).

Используемое устройство включает в себя ограждение 1 прямоугольной формы и заполняющие его блоки 2. Снизу к ограждению 1 крепится электродный пол 3, сверху оно закрыто прозрачной съемной крышкой 4. Каждый блок 2 состоит из двух модулей - призм 5 треугольного поперечного сечения, выполненным с возможностью жесткого скрепления друг с другом, с образованием призмы квадратного сечения.

Во внешних стенках модулей высверлены отверстия 6, которые могут быть использованы для крепления различных вспомогательных устройств, например, манипуляторных колец 7. Кроме того, в отверстия 6 можно вставлять цилиндрические штифты (не показаны), что обеспечит прочную фиксацию блоков 2 друг с другом. Размер ограждения 1 и количество блоков 2 в нем регламентируется только пожеланиями или потребностями экспериментатора и должно быть кратным поперечным размерам блока.

В исходном состоянии вся площадь ограждения 1 заполнена блоками 2 (фиг. 1), установленными плотно один к другому. Разборность блоков 2 позволяет посредством рассоединения модулей - треугольных призм 5, создавать инструментальные среды практически любой формы: гексагональной, ромбовидной и т.д. Блок может быть при необходимости модифицирован в компонент системы регистрации (с помощью крепления чувствительных датчиков (фотоэлементов, герконов) в отверстиях модулей - призм). Для того чтобы в установке сформировать лабиринт (например, простой Т-образный), экспериментатор задает расположение стартовой зоны и, вынимая блоки 2 из ограждения 1, создает необходимой длины ход и рукава требуемого лабиринта.

В эксперименте могут использоваться варианты лабиринта различной сложности (фиг. 3-5). Например, на фиг. 3 показан наиболее простой лабиринт, имеющий Т-образную форму, архитектурно повторяющий известный классический Т-образный лабиринт. Вариант лабиринта, показанный на фиг. 4 - в отличие от предыдущего варианта, представляет собой усложненную структуру, формирующуюся удалением дополнительного числа модулей. Вариант лабиринта, показанный на фиг. 5, является разновидностью сложного, хотя при этом в его центре имеется кольцевая развязка, с помощью которой можно было животному переходить из одного отсека в другой. Имеется техническая возможность моделировать иные варианты в зависимости от целей экспериментальных работ.

Для выявления индивидуальной типологической принадлежности лабораторные крысы помещаются в установку, в которой предварительно экспериментатором сформирован лабиринт, идентичный установке «Приподнятый крестообразный лабиринт», где регистрируются показатели врожденной формы поведения (исследовательская активность и уровень эмоциональности (тревожности). При необходимости (по усмотрению исследователя в зависимости от поставленных задач) в устройстве может быть смоделирована установка, которая будет полностью соответствовать установке «Открытое поле». Таким образом, собирается, обрабатывается и учитывается информация о качественных и количественных характеристиках врожденного поведения, на основании которых при сопоставлении данных строится прогноз об индивидуальном уровне когнитивных способностей крыс и принадлежности к конкретному типу.

На фиг. 6 продемонстрированы результаты тестирования 47 неинбредных крысах, которые графически показывают характер взаимоотношений показателей врожденной и приобретенной форм поведенческой активности. На чертеже показана взаимосвязь когнитивного показателя с исследовательской активностью и тревожностью. Здесь, по оси абсцисс показан № соби; по оси ординат - значения показателей в процентах. Ряд 1 - когнитивный показатель, ряд 2 - исследовательская активность, ряд 3 - уровень тревожности.

После определения исходного состояния ориентировочно-исследовательской сферы, животные подвергаются тестированию в этой же установке, где сформирована инструментальная проблемная модификация, полностью повторяющая таковую в известной установке, описанной в SU №17763864 и RU №2204942, и позволяющей регистрировать показатели приобретенной формы поведенческой (поисковой) активности в структуре различных видов поведения (оборонительного, пищевого или питьевого), в зависимости от поставленной перед исследователем задачи. После обработки полученных данных анализируются показатели мотивационно-энергетической и когнитивной сфер, которые сопоставляются с ранее полученными характеристиками исследовательской (врожденной) формы поведенческой активности. На основании сопоставлении лабораторных животных делят на три типа:

I тип - особи с изначальным когнитивным показателем от 0 до 45%, имеющие при этом высокий интегральный показатель исследовательской активности и эмоциональности (от 60 до 100%). Представители этого типа наиболее оптимально подходят для исследования психотропных средств (ноотропные, анксиолитические и др.) и в меньшей степени - актопротекторных средств, т.к. они имеют изначально высокий уровень физической работоспособности. При изучении психотропных средств рекомендательно необходимо учитывать, что чем ниже когнитивный показатель, тем более простой вариант лабиринта (как, например, показанный на фиг. 3) выбирается в дальнейших тестированиях и усложняется по мере увеличения когнитивной задачи.

II тип - включает особей из категории «золотая середина», у которых имеются средние значения когнитивного показателя (от 45 до 60%), и показателя исследовательской активности и эмоциональности (от 45 до 60%). Именно представители этого типа наиболее оптимально подходят для изучения как психотропных, так и актопротекторных средств. Предъявляемый вариант лабиринта при решении стандартных когнитивных задач животными соответствует показанным на фиг. 4 и 5, а также подобным по сложности модификации.

III тип включает представителей с изначально высоким когнитивным показателем (от 60 до 100%) и низкими значениями исследовательского и тревожного компонента (от 0 до 45%). Его представители наиболее оптимально подходят для изучения актопротекторных средств, а также для создания экспериментальных моделей патофизиологии высшей нервной деятельности с последующим изысканием оптимальных коррелятов. При тестировании психотропных средств рекомендуется использование лабиринтов высшей (см. фиг. 5) и средней (см. фиг. 4) степеней сложности.

Особенностями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

- тестирование по предварительному отбору животных проводят в рамках одного инструментального устройства, что улучшает «чистоту» эксперимента, с поэтапным изменением архитектуры и регистрацией качественных и количественных показателей как врожденного, так приобретенного поведения для последующего разделения животных на три типа;

- животные всех трех поведенческих типов (независимо от изначального когнитивного уровня) участвуют в последующем тестировании психотропных средств, при этом чем выше когнитивный показатель, тем более сложной формы предъявляется лабиринт для животного;

- животные, в зависимости от их типовой принадлежности и характеристик мотивационно-энергетической сферы, избирательно участвуют в эксперименте по выявлению средств с предполагаемой актопротекторной активностью, при этом чем ниже компонент тревожности и исследовательской активности, тем изначально будет ниже уровень физической работоспособности у конкретной особи;

- после процедуры определения типологической принадлежности при необходимости проведения серийного тестирования (например, под влиянием какого-либо фактора) с неоднократным помещением животного в установку, применяется изменение формы лабиринта для предотвращения формирования реакции привыкания к инструментальной среде.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Для выявления предполагаемого психотропного (ноотропного) эффекта средства «CL-V», представляющего собой цеолитсодержащий туф Вангинского месторождения (с размером частиц около 10 мкм) использовали белых неинбредных крыс в количестве 67 особей.

С помощью универсального устройства с изменяемой архитектурой путем создания форм «Приподнятый крестообразный лабиринт» и «Открытое поле» определены значения ориентировочно-исследовательского (врожденного) поведения, а именно: интегральные значения уровня тревожности (эмоциональности) и исследовательского компонента.

Затем, после суточного перерыва, в устройстве была сформирована инструментальная среда «Универсальная проблемная камера», где создавалась аверзивная обстановка (при подаче раздражающего электрического тока на дно устройства, не достигающего порога болевой чувствительности) с последующим инструментальным активным избеганием. Таким образом, определялся изначальный индивидуальный когнитивный уровень и животные подразделялись на три типа.

Далее после 5-дневного перерыва проводилось тестирование лабораторных крыс в структуре оборонительного поведения на фоне ежедневного приема средства «CL-V» (из расчета 5% от массы сухого корма), начиная с первых суток указанного перерыва. В контрольные группы входили крысы из соответствующих типов, но получавшие при этом плацебо.

Посредством универсального устройства с изменяющейся архитектурой представителям I типа - предъявлялась конфигурация лабиринта простого (вариант, показанный на фиг. 3), II типа конфигурация средней степени сложности (вариант, показанный на фиг. 4) и III типа - конфигурация повышенной сложности (вариант, показанный на фиг. 5). Указанные варианты лабиринтов для всех типов являлись обстановочно новыми. Таким образом, анализируя полученные данные, следует отметить, что во всех типологических группах наблюдалась позитивная динамика изменения когнитивного показателя с достоверно значимой разницей по сравнению с контролем. Следовательно, предполагаемое психотропное действие было подтверждено

Пример 2

С целью выявления предполагаемого актопротекторного свойства у средства «CL-V» лабораторные неинбредные крысы подверглись типологической сортировке по схеме, представленной в примере 1.

Далее в тестах на физическую выносливость (тест Порсолта и вертикальный экран-сетка) принимали участие особи всех типов. Эффективность средства достоверно подтвердилась только в группе, относящейся к III типу, где зафиксирована достоверно значимая разница с контролем (p<0,01). У лабораторных животных из I и II типов, входящих в контрольные группы, и получающих плацебо, наблюдались изначально высокие показатели уровня физической работоспособности, в связи с чем разница не определялась. Последнее подтверждает необходимость исключения лабораторных крыс, относящихся к I и II типу из подобных экспериментов. На основании полученных результатов у контрольных и опытных крыс из III типа, можно сделать вывод, что средство «CL-V» обладает актопротекторным эффектом, а в дальнейших тестированиях на выявление актопротекторной активности необходимо использовать животных только III типа.

Пример 3

Проводилось тестирование по изучению изменения

работоспособности у крыс из разных типологических групп, получавших актопротектор (реамберин) в тесте Порсолта.

Реамберин вводился в виде раствора внутривенно в дозе 15 мг/кг веса животного в утренние часы за 20 минут до эксперимента в течение пяти дней тестирования.

Контрольной группой служили животные, получавшие физраствор в аналогичном объеме.

При применении реамберина у подопытных животных, тестируемых в тесте Порсолта, выявлены следующие изменения регистрируемого параметра (время иммобильности) по сравнению с контрольной группой. В таблице 1 представлены средние величины показателей за все дни тестирования.

Пример 4

Проводилось тестирование по изучению изменения работоспособности у крыс из разных типологических групп, получавших психотропное средство (пирацетам) в дозе 50 мг/кг в универсальном устройстве с изменяемой архитектурой.

Пирацетам вводился в виде раствора внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг веса животного, начиная за три дня до тестирования и ежедневно после эксперимента (в течение 5 дней).

Контрольной группой служили животные, получавшие физраствор в аналогичном объеме.

Анализировалось значение когнитивного показателя в процентах в структуре оборонительного поведения при воздействии аверзивного раздражителя на фоне сформированного инструментального рефлекса активного избегания.

В таблице 2 представлены средние величины показателей за все дни тестирования.