СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА Pseudomonas

Изобретение относится к области сельского хозяйства и химии и может быть использовано при производстве биотехнологических продуктов в экологической и сельскохозяйственной биотехнологии (производство биоудобрений, биопрепаратов для защиты растений, производство биополимеров, белка одноклеточных, очистка сточных вод, производство биопрепаратов для рекультивации загрязненных территорий и т.д.).

В настоящее время наибольшая стоимость питательных сред при производстве различных биотехнологических продуктов приходится на источники углерода и энергии (энергетический субстрат), при этом, среди перечня критериев эффективности биотехнологического производства, наибольшая роль уделяется экономическому коэффициенту. Экономический коэффициент показывает, какая часть субстрата перешла в биомассу, чем он выше, тем эффективнее микроорганизмы утилизируют субстрат, тем выше выход их биомассы и численности с 1 г потребленного субстрата, тем меньше себестоимость готовой продукции. Поэтому разработка способов и методов уменьшения затрат субстрата при увеличении выхода продукции является одной из основных задач биотехнологии на протяжении всего существования данной науки. Особенно остро этот вопрос возник на современном этапе развития человечества и связан с исчерпанием традиционных субстратов.

Известен способ выращивания бактерий рода Pseudomonas (патент US 4555487, опубл. 26 ноября 1985, МПК C12N 1/38), в котором в питательную среду добавляют по меньшей мере одно амидное соединение, выбранное из группы, состоящей из акриламида, метакриламида, кротонамида и н-бутирамида. Способ позволяет обеспечить производство клеток бактерий рода Pseudomonas, имеющих высокую активность нитрилгидратазы, с высоким выходом.

Известен способ культивирования бактерий рода Pseudomonas (патент US 4880739, опубл. 14.11.1989, МПК C12N 9/78), в котором клетки бактерий рода Pseudomonas получают путем непрерывного или с приращением, но не в одной партии за один раз, добавления к питательной среде в течение воспроизводства и пролиферации клеток бактерий Pseudomonas, по меньшей мере, одного соединения, выбранного из группы, состоящей из пропионитрил, изобутиронитрил, пропионовой кислоты и изобутирамид в количестве, эффективном для повышения активности нитрилгидратазы на единицу культуральной жидкости культуральной среды. Способ позволяет обеспечить производство клеток бактерий рода Pseudomonas, имеющих высокую активность нитрилгидратазы, с высоким выходом.

Недостатками аналогов является увеличение стоимости питательной среды при добавлении органических соединений при активизации нитрилгидратазы бактерий рода Pseudomonas и отсутствие увеличения выхода самих микробов-агентов биотехнологии при увеличении стоимости питательной среды.

Известен способ получения культивирования бактерий Pseudomonas fluorescens АР-33 и Pseudomonas aureofaciens BS 1393 на среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника энергетического субстрата, с добавлением наночастиц диоксида титана (Сухушина О.А., Минаева О.М. Влияние наночастиц диоксида титана на рост культуры клеток бактерий Pseudomonas aureifaciens BS 1393. // Наука XXI века: Новый подход: Материалы VIII молодежной международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (29-29 января 2014 г.). - СПб: Изд-во «Айсинг», 2014. - С. 55-59), выбранный в качестве прототипа.

Способ заключается в засеве культуры на предварительно стерилизованную и обработанную ультразвуком жидкую питательную среду, содержащую глюкозу в качестве единственного источника энергетического субстрата и диоксид титана.

Недостатками прототипа является:

1. невозможность увеличения численности бактериальной популяции и выхода продукции при добавлении наночастиц диоксида титана,

2. культивирование ограниченного круга бактерий, а также увеличенное время культивирования.

3. отсутствие возможности регулирования биотехнологических процессов и прогнозирования получаемых результатов.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа культивирования широкого круга бактерий рода Pseudomonas с увеличением численности бактерий на 1 г потребленного питательного субстрата и уменьшением сроков культивирования до достижения необходимой бактериальной численности путем добавления в богатую питательную среду, оптимизированную по содержанию основных органических и минеральных компонентов, наночастиц диоксида титана размером 5-6 нм в расчетной концентрации.

Поставленная задача решается тем, что бактерии рода Pseudomonas засевают на предварительно стерилизованную и обработанную ультразвуком в течение 20-25 мин при частоте 35 кГц жидкую питательную среду с диоксидом титана, при этом диоксид титана добавляют в виде водной суспензии, предварительно обработанной ультразвуком в течение 20-25 мин при частоте 35 кГц, а засев маточной культуры бактерий с концентрацией 1-8*10⁹ клеток/мл в объеме 10% от общего проводится в обработанную и стерилизованную питательную среду, бактерии выращивают при температуре +28-30°С, с аэрацией при минимальной концентрации растворенного кислорода pO₂=5,0-6,0 мг/л в течение 24-32 ч до достижения фазы замедления бактериального роста, при следующем соотношении компонентов, масс. %:

пептон - 2,0%;

глицерин - 1,0%;

MgSO₄ - 0,15%;

K₂HPO₄ - 0,15%;

диоксид титана - 0,002-0,0025%;

остальное - вода.

В водной суспензии диоксид титана находится в виде наночастиц, которые получают методом электровзрыва. Они имеют размер 5-6 нм. Их верификацию проводят как с помощью электронной микроскопии в проходящем свете, так и методом динамического светорассеяния с помощью анализатора размеров диспергированных частиц.

Таким образом, одной из наиболее основных операций при культивировании бактерий рода Pseudomonas с диоксидом титана является не только его наличие в среде и концентрация, но и введение в питательную среду обязательно суспензии наночастиц диоксида титана во взвешенном состоянии.

Пептон, входящий в состав предложенной среды для культивирования бактерий, является наиболее широко используемым энергетическим субстратом, пригодным для роста и развития практически всех известных почвенных, ризосферных и других видов бактерий рода Pseudomonas, относящихся к аммонификаторам. Пептон является субстратом, содержащим целый набор аминокислот и полипептидов, которые легко усваиваются бактериями различного систематического положения. Глицерин, входящий в состав в среды, является более трудно усваиваемым субстратом, однако способствует росту микроорганизмов на более поздних фазах культивирования и продляет сроки хранения микробных препаратов. В целом, предложенная среда является универсальной и обеспечивает рост и развитие практически всех бактерий рода Pseudomonas.

Техническая сущность изобретения поясняется примером. Для культивирования бактерий рода Pseudomonas готовят в ферментере или других емкостях питательную среду для выращивания бактерий следующего состава (масс. %):

пептон - 2,0%;

глицерин - 1,0%;

MgSO₄ - 0,15%;

K₂HPO₄ - 0,15%;

остальное - вода.

Стерилизуют рабочий объем ферментера с питательной средой при температуре +116°С 20-25 мин или емкости с питательной средой в паровом стерилизаторе при режиме 1 атм 20-25 мин. В колбах в концентрации 1 г/л готовят водную суспензию наночастиц диоксида титана и также стерилизуют. Остывшую водную суспензию наночастиц диоксида титана в колбах обрабатывают ультразвуком в течение 20-25 мин при частоте 35 кГц в ультразвуковой ванной для перевода наночастиц во взвешенное состояние. Немедленно вводят взвешенную суспензию диспергированных наночастиц диоксида титана в питательную среду до достижения концентрации наночастиц в среде (масс. %) 0,002-0,0025%. Осуществляют засев питательной среды предварительно выращенной маточной культурой бактерий с концентрацией 1-8*10⁹ клеток/мл в объеме 10% от общего. Выращивают бактерии при температуре +28-30°С, аэрации на уровне рО₂=4,0-5,0 мг/л в течение 18-24 ч в зависимости от планируемой бактериальной численности.

Контроль численности осуществляют стандартными методами учета (подсчет клеток в камере Горяева, метод Коха, учет численности по оптической плотности культуры и др.).

На фиг. 1 показано изменение концентрации бактерий рода Pseudomonas при их культивировании (средние показатели для пяти изученных штаммов видов P. fluorescence, P. aureofaciens, Pseudomonas sp.). Цифрами обозначено следующее: 1 - контроль (культивирование бактерий в оптимальных условиях без добавления наночастиц диоксида титана), 2 - минимальная среда с глюкозой и наночастицами диоксида титана (25 мг/л), 3 - богатая среда, оптимизированная по составу компонентов для бактерий рода Pseudomonas и наночастицами диоксида титана (25 мг/л).

На фиг. 2 приведено изменение концентрации бактерий рода Pseudomonas при их культивировании (средние показатели с доверительным интервалом (р<0,05) для пяти изученных штаммов видов P. fluorescence, P. aureofaciens, Pseudomonas sp.), где 1 - контроль (культивирование бактерий в оптимальных условиях без добавления наночастиц диоксида титана), 2 - минимальная среда с глюкозой и наночастицами диоксида титана (25 мг/л), 3 - богатая среда, оптимизированная по составу компонентов для бактерий рода Pseudomonas и наночастицами диоксида титана (25 мг/л), 4 - богатая среда, оптимизированная по составу компонентов для бактерий рода Pseudomonas и диоксидом титана в обычной форме (25 мг/л).

Согласно фиг. 1 добавление в состав питательной среды наночастиц диоксида титана способствует более быстрому достижению бактериальной культурой заданных значений численности. Так, если культивирование в оптимальном режиме направлено до достижения бактериальной численности, находящейся на уровне 1*10⁹ клеток/мл, то в контроле (линия 1, среда без наночастиц) достижение данной численности наблюдается через 24-25 ч, добавление в минимальную по составу среду, содержащую глюкозу в качестве единственного источника энергетического субстрата (линия 2), наночастиц диоксида титана в концентрации 25 мг/л приводит к ускорению достижения заданного значения на 4-5 часов. Добавление наночастиц в той же концентрации к питательной среде, оптимизированной по составу (линия 3), дополнительно ускоряет процесс на 1,5-2 часа по сравнению с бедной средой.

Рассчитанные, исходя из полученных кривых, описывающих рост микробной культуры, удельные скорости роста также показывают значительное увеличение в присутствии наночастиц диоксида титана (фиг. 2).

Сходные зависимости были отмечены для целого ряда штаммов бактерий рода Pseudomonas, что свидетельствует об универсальности отмеченного эффекта на данную систематическую группу бактерий.

Экспериментально показано, что использование наночастиц диоксида титана (TiO₂) в концентрации 20-25 мг/л в составе питательных сред увеличивает численность бактерий рода Pseudomonas и их биомассу с одного грамма энергетического субстрата (например, глюкозы или глицерина) в 5-7 раз в зависимости от концентрации, увеличивает удельную скорость роста бактериальной культуры на 12-23% (фиг. 2), а значит, сокращают сроки производства биотехнологического продукта. При использовании богатой по составу питательной среды с включением перечня органических соединений в неопределенном составе (например, пептон основной) выход бактериальных клеток может увеличиваться в 10-20 раз (Таблица 1).

Также показано, что в присутствии наночастиц диоксида титана уменьшается скорость потребления энергетического субстрата в 1,6-6 раз в зависимости от вида бактерии и увеличивается его остаточная концентрация в культуре бактерий на 20-30% по сравнению с контролем (р<0,05).

Технический результат - повышение производительности процесса культивирования, увеличение выхода бактерий в процессе культивирования или производства биопрепарата, снижение энергозатрат на процесс и расход субстратов.