СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРМУАЗИНА В СОКАХ

Изобретение относится к области пищевой промышленности и касается способа определения синтетического пищевого красителя кармуазина (азорубина, Ε 122) в соках.

В настоящее время известно изобретение «Способ идентификации синтетических пищевых красителей» (Патент РФ №2398217 от 15.12.2008). В данном изобретении описывается способ идентификации шести синтетических пищевых красителей при аналитическом контроле пищевых продуктов и фармацевтических препаратов методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Способ заключается в том, что смесь красителей разделяют методом хроматографии в тонком слое на пластинах «Silufol». При этом в качестве подвижной фазы используют смесь ацетон-изобутиловый спирт-раствор гидроксида калия с концентрацией 0,1 моль/дм³ в объемном соотношении 0,5:1:0,5:0,7. Продолжительность хроматографического разделения не более 60 минут.

Известен способ тонкослойной хроматографии с применением компьютерной денситометрии для определения наличия водорастворимых синтетических красителей, в том числе и кармуазина (E122) в леденцовой карамели. (Хальзова С.Α., Зяблов А.Н., Селеменев В.Ф. Определение синтетических красителей методом ТСХ // Сорбционные и хроматографические процессы. 2014. Т. 14. №3. С. 544-547.) Определение красителей проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинах - «силикагель СТХ-1ВЭ». Наилучшее разделение и качество зон получается в элюирующей системе: бутанол-этилацетат-ледяная уксусная кислота-вода (5:3:3:3). Пластинки после хроматографирования и высушивания сканировали на планшетном сканере. Полученные изображения обрабатывали с помощью компьютерной программы «ТСХ-менеджер». Принцип обработки графических файлов данной программой аналогичен работе двухлучевого денситометра. Наилучшее разделение и качество зон получается в элюирующей системе: бутанол-этилацетат-ледяная уксусная кислота-вода (5:3:3:3). В соответствии с выбранными условиями хроматографирования было проведено определение синтетических красителей в безалкогольных напитках и леденцовой карамели.

Известен способ тонкослойной хроматографии для выявления наличия в газированных напитках «Фанта» и «Кола» производства ООО «Кока-Кола Эйчбиси Евразия» (г. Самара) синтетических красителей (Брынских Г.Т., Михеева Л.А., Терехина Н.В., Брынских В.Э. Качественное и количественное определение содержания пищевых красителей в газированных напитках // Ульяновский медико-биологический журнал. 2014. №4. С. 74-77). В качестве неподвижной фазы в эксперименте использовали пластины «силикагель СТХ-1ВЭ», а подвижной фазы - смесь «н-бутанол-этанол-вода» в соотношении 60:60:150. Для количественной оценки синтетических красителей определяли поглощение чистых растворов на спектрофотометре при характерных для каждого красителя длинах волн максимума поглощения

Однако предложенные методы ТСХ для количественного определения содержания кармуазина в пищевых продуктах и напитках не обладают необходимой чувствительностью для определения кармуазина на уровне микропримесей.

Известен спектрофотометрический метод количественного определения кармуазина (Материенко А.С., Грудько В.А., Георгиянц В.А. Разработка методик определения тартразина и кармуазина в сиропе «Грипаут бэйби» // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. 2013. Т. 24. №25 (168). С. 232-238). Адсорбционные спектры снимали на спектрофотометре Evolution 60S в диапазоне длин волн 350-600 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм; как раствор сравнения использовали воду очищенную. Адсорбционный спектр водного слоя, содержащего кармуазин, характеризуется широким максимумом при длине волны 516-519 нм, и может быть использован как аналитическая полоса поглощения. Недостатком данного метода является то, что если раствор красителя замутнен или имеет нехарактерные для спектрофотометрического анализа включения, то анализ провести невозможно.

Одним из эффективных способов проведения химического анализа является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Основным преимуществом метода ВЭЖХ является высокая чувствительность, что дает возможность определять синтетические красители при их низком содержании в пищевых продуктах.

В настоящее время из методик количественного определения синтетических красителей используются методы хроматографии с различными способами детектирования.

Известен метод определения водорастворимых синтетических красителей, в том числе кармуазина, в пищевых продуктах использующий высокоэффективную жидкостную хроматографию без использования органических растворителей (Khanavi M., Ardekani M.R.S., Hajimahmoodi M., Oveisi M.R., Mogaddam G., Ranjbar A.M. Development of a green chromatographic method for simultaneous determination of food colorants // Food Analytical Methods. 2012. V. 5. №3. p. 408-415).

Ближайшим аналогом является способ микроколоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии для определения синтетических красителей, в том числе и кармуазина (Е122) в безалкогольных напитках и соках (Онучак Л.А., Пивоварова Н.А., Зотова А.В., Макарова Н.В. Анализ синтетических красителей в безалкогольных напитках и соках с использованием нового метода микроколоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии // Техника и технология пищевых производств. 2012. Т. 2. №25. с. 144-148). Для реализации метода микроколоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии используют капилляры из стекла с внутренним диаметром 0,5 мм и длиной 4,5-5,0 см. В качестве сорбента, помещенного внутрь капилляра, используют силикагель марки СТХ-1 ВЭ (ЗАО «Сорбполимер», г. Краснодар, Россия). При проведении анализа раствор пробы исследуемой системы вносят в начальную часть капиллярной колонки. Заполненную сорбентом капиллярную колонку вертикально погружают одним концом в элюент. Движение элюента и зон сорбатов происходит, как и в планарной ТСХ, под действием капиллярных сил. Способ отличается более высокой экспрессностью из-за меньшей длины разделяющего слоя сорбента, эффективностью, воспроизводимостью, минимальным расходом сорбента и элюента, отсутствием необходимости использования камер, насыщенных парами элюента. Однако, несмотря на все достоинства, данный способ позволяет выполнить только качественную оценку присутствия того или иного красителя в безалкогольных напитках и соках, без определения количественных составляющих.

Актуальным является разработка методов ВЭЖХ определения кармуазина в соках со сложной компонентной матрицей с привлечением нового способа идентификации компонентов.

Задача - разработать способ определения синтетического пищевого красителя кармуазина (Е 122) в соках.

Способ определения кармуазина в соках включает пробоподготовку и его определение методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии с многоканальным УФ-спектрофотометрическим детектированием. Хроматографирование выполняется в градиентном режиме элюирования ацетонитрила в водном растворе 0,05 M LiClO₄ от 0 до 100%. Расчет концентрации кармуазина в соках проводится методом внешнего стандарта путем оценки спектральных отношений площадей пиков кармуазина S_λ/S₂₁₀ при времени удерживания 11 мин.

На фиг. 1 представлена структурная формула кармуазина.

На фиг. 2 представлена хроматограмма стандартного раствора кармуазина.

На фиг. 3 представлена градуировочная зависимость оптической плотности от концентрации стандартного раствора кармуазина.

В таблице 1 представлены метрологические характеристики измерений концентрации кармуазина.

Анализ проводят при следующих условиях: хроматограф «Милихром А-02», колонка - Luna C18 с размером 2×75 мм из нержавеющей стали, подвижной фаза - элюент А (0,05 M LiClO₄) и элюент Б (ацетонитрил), градиентное элюирование ацетонитрила от 0 до 100%, скорость потока - 100 мкл/мин.

Хроматограмма стандартного раствора кармуазина с концентрацией 0,01 мг/мл при градиентном элюировании ацетонитрила в водном растворе 0,05 M LiClO₄ от 0 до 100% представлена на фиг. 2.

При определении кармуазина в соках спектральные отношения площадей пиков S_λ/S₂₁₀ при времени удерживания 11 мин соответствует спектральным отношениям площадей пиков S_λ/S₂₁₀ стандартного вещества кармуазина.

При расчете концентрации кармуазина в соках, используя метод внешнего стандарта, анализ проводят при следующих условиях: хроматограф «Милихром А-02», колонка - Luna C18 с размером 2×75 мм из нержавеющей стали, подвижная фаза - элюент А (0,05 M LiClO₄) и элюент Б (ацетонитрил), градиентное элюирование ацетонитрила от 0 до 100%, скорость потока - 100 мкл/мин, УФ-детектирование при длине волны 220 нм.

Область определяемых концентраций кармуазина от 8,5 10^-4 до 1,0 10^-2 мг/мл.

Градуировочная зависимость оптической плотности при длине волны 220 нм от концентрации стандартного раствора кармуазина приведена на фиг. 3

Область прямолинейной зависимости оптической плотности от концентрации стандартного раствора кармуазина достаточна для оценки количественного содержания кармуазина в соках.

Значения пределов повторяемости, воспроизводимости и критического диапазона измерений концентрации кармуазина при доверительной вероятности P=0,95 представлена в таблице 1.

Пример. Определение кармуазина в ягодном соке с мякотью красно-фиолетового цвета.

Навеску сока 0,1000 г взвешивают и вносят в эппендорф, добавляют 1.5 мл бидистиллированной воды с температурой 90°C. После этого проводят последовательную экстракцию: в миницентрифуге вортекс Комбиспин FVL-2400N с постоянной скоростью вращения 3500 об/мин в течение 3 минут, в ультразвуковой ванне в течение 30 минут и в центрифуге типа MiniSpin, с постоянной скоростью вращения 13000 об/мин в течение 10 минут.

Затем в новый эппендорф отбирают надосадочную жидкость, добавляют 1.5 мл бидистиллированной воды с температурой 90°C и еще раз проводят последовательную экстракцию. Данный процесс повторяют еще 2 раза.

Предложенная в несколько стадий пробоподготовка дает возможность исключить из объектов сока мешающие компоненты и максимально экстрагировать из системы кармуазин.

Полученную надосадочную жидкость закалывают в пробирки и проводят определение кармуазина методом микроколоночной ВЭЖХ многокональном УФ-спектрофотометрическом измерении сигнала оптической плотности при разных длин волн - 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 и 320 нм в режиме остановки записи хроматограммы с использованием градиентного режима элюирования ацетонитрила в водном растворе 0,05 M LiClO4 от 0 до 100% и сравнении спектральных отношений площадей пиков S_λ/S₂₁₀ при времени удерживания 11 мин в соке со спектральным отношением площадей пиков S_λ/S₂₁₀ стандартного вещества кармуазина. Анализ проводят при следующих условиях: хроматограф «Милихром А-02», колонка - Luna C18 с размером 2×75 мм из нержавеющей стали, подвижной фаза - элюент А (0,05 M LiClO₄) и элюент Б (ацетонитрил), градиентное элюирование ацетонитрила от 0 до 100%, скорость потока - 100 мкл/мин.

При определении кармуазина в соках спектральные отношения площадей пиков S_λ/S₂₁₀ при времени удерживания 11 мин соответствует спектральным отношениям площадей пиков S_λ/S₂₁₀ стандартного вещества кармуазина.

При расчете концентрации кармуазина в соках, используя метод внешнего стандарта, анализ проводят при следующих условиях: хроматограф «Милихром А-02», колонка - Luna C18 с размером 2×75 мм из нержавеющей стали, подвижная фаза - элюент А (0,05 M LiClO₄) и элюент Б (ацетонитрил), градиентное элюирование ацетонитрила от 0 до 100%, скорость потока - 100 мкл/мин, УФ-спектрофотометрическое детектирование при длине волны 220 нм.

Предложенный способ используется для количественного определения кармуазина в соках в диапазоне концентраций от 8,5 10^-4 до 1,0 10^-2 мг/мл.

Предложенный способ определения синтетического пищевого красителя кармуазина (Е 122) в соках не требует больших трудозатрат, значительного количества реактивов. Оценка концентрации кармуазина, используя метод внешнего стандарта, отличается высокой селективностью и чувствительностью определения.