СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ХАРАКТЕРА ПОРАЖЕНИЯ ЖЕЛЧНОГО ПУЗЫРЯ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ КАЛЬКУЛЕЗНЫМ ХОЛЕЦИСТИТОМ

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования характера поражения желчного пузыря у женщин, больных хроническим калькулезным холециститом (далее ХКХ).

Желчнокаменная болезнь (далее ЖКБ) - мультифакториальное заболевание, характеризующееся образованием камней в желчевыводящих путях: желчном пузыре или в желчных протоках. Почти 90% всех случаев желчнокаменной болезни составляет хронический калькулезный холецистит [Коханенко Н. Желчнокаменная болезнь /Н. Коханенко, А. Глебова //Медицинская газета. - 2011. - 2 марта. - С. 8-9]. Заболеваемость ХКХ в последние десятилетия резко повысилась и продолжает возрастать. У современных жителей Земли желчные камни обнаруживают у 24% женщин и 12% мужчин. В России холецистэктомии по поводу ХКХ занимают второе место среди всех операций, ежегодно выполняемых населению. При этом значительную долю заболевших составляет трудоспособное население [Саакян О.В. Лазерное излучение и эндобилиарная литотрипсия в хирургическом лечении осложнений желчнокаменной болезни: дис. … канд. мед. наук: 14.01.17 /О.В. Саакян. - Москва, 2011. - 149 с.].

Изучение роли генетических факторов в формировании ХКХ является одной из важных задач современной медицины. Известно, что полиморфизмы ряда генов участвуют в регуляции воспаления, клеточной пролиферации, метаболизма липидов и желчных кислот при формировании ХКХ [Григорьева И. Основные факторы риска желчнокаменной болезни /И. Григорьева //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2007. - Т. 17, №6. - С. 17-21]. Среди генов-кандитатов, регулирующих преимущественно процессы воспаления, важное значение имеют интерлейкины. Интерлейкины, взаимодействуя со специфическими рецепторами, являются одними из главных звеньев в воспалительном каскаде при ЖКБ, изменяя интенсивность и длительность воспалительных, склеротических и литогенных процессов в желчном пузыре [Царегородцева Т.М. Цитокины при заболеваниях органов пищеварения [Электронный ресурс /Т.М. Царегородцева //Регистр лекарственных средств России: энцикл. лекарств и товаров аптечного ассортимента: офиц. сайт /группа компаний РЛС. - Москва, 2009. - 28 апр. - Режим доступа: http://www.rlsnet.ru/articles_426.htm.].

В норме желчный пузырь представляет собой эхонегативное образование овоидной формы с четкими контурами. Его длина от наиболее узкой части (шейки) до дна составляет 60-100 мм, ширина (поперечник) - 30-50 мм, толщина стенок не должна превышать 3 мм. При хроническом калькулезном холецистите обнаруживаются следующие эхографические признаки: диффузное утолщение, уплотнение или слоистость стенок желчного пузыря, снижение объема и негомогенность полости органа [Блок Б. УЗИ внутренних органов /Б. Блок; пер. с нем. под общ. ред. А.В. Зубарева. - 2-е изд. - Москва: Медпресс-информ, 2007. - 256 с.].

IL-1А - белок, кодируемый геном IL-1А, который располагается на второй хромосоме (2q14). IL-1А - провоспалительный цитокин, обладающий широким спектром метаболической, физиологической, кроветворной деятельности, а также играет одну из центральных ролей в регуляции иммунного ответа. После попадания инфекции в организм IL-1А активизирует множество процессов системы иммунного ответа. В частности: стимулирует распространение фибробластов, индуцирует синтез протеаз и белков острой фазы, влияет на увеличение числа нейтрофилов крови, активизирует распространение лимфоцитов и вызывает лихорадку [Dinarello С.А. Induction of interleukin-1 and interleukin-1 receptor antagonist /С.А. Dinarello //Semin. Оnсоl. - 1997. - №24, №3, suppl. 9. - P. S981-S993].

Ген IL-1А содержит 7 экзонов и 6 интронов, на 3 и 5 концах он имеет нетранслируемые области. Кроме того, он обладает высокой степенью гомологии интронных последовательностей, что, возможно, регулирует экспрессию этого гена [Громова А.Ю. Полиморфизм генов семейства IL-1 человека /А.Ю.Громова, А.С.Симбирцев //Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, №2. - С. 3-12].

IL-4 - лимфокин массой 15-20 кДа. Ген IL-4 располагается на пятой хромосоме. Основными продуцентами IL-4 являются Т-клетки (Th2). Данный цитокин принимает участие в дифференцировке Т- и В-лимфоцитов. Наиболее мощный эффект интерлейкина-4 связывают с регуляцией синтеза других цитокинов. Он принимает участие в многочисленных биологических процессах, таких как воспалительные реакции и иммунный ответ [Характер распределения аллелей генов ARIL-1 и IL-4 у больных ревматоидным артритом русской национальности, проживающих в Челябинской области /Д.С. Сташкевич, А.Л. Бурмистрова Т.А. Суслова [и др.] //Успехи современного естествознания. - 2006. - №3. - С. 52-53].

Повышение уровня IL-4 отмечается и при регенераторно-восстановительных процессах хронических рецидивирующих заболеваний органов пищеварения, таких как язвенная болезнь желудка, панкреатит, желчнокаменная болезнь [Царегородцева Т.М. Цитокины при заболеваниях органов пищеварения /Т.М. Царегородцева //Регистр лекарственных средств России: энцикл. лекарств и товаров аптечного ассортимента: офиц. сайт /группа компаний РЛС. - Москва, 2009. - 28 апр. - Режим доступа: http://www.rlsnet.ru/articles_426.htm].

IL-6 - мономер массой 19-34 кДа. Ген IL-6 располагается на седьмой хромосоме 7p15-21. IL-6 принимает участие в дифференцировке В-клеток, стимулируя созревание В-лимфоцитов в антителопродуцирующие клетки. IL-6 - важнейший медиатор острой фазы воспаления. Он стимулирует мобилизацию энергии в мышцах и жировой ткани, что способствует повышению температуры тела [Krook А. IL-6 and metabolism-new evidence and new questions [Text] /А. Krook //Diabetologia. - 2008. - Vol. 51, №7. - P. 1097-1099].

Уровень IL-6 может повышаться при различных патологических состояниях, включая аутоиммунные заболевания. IL-6 участвует в регуляции пролиферации эпителиальных клеток желчных протоков, клеток печени, образовании гранулем и развитии фиброза при циррозе печени. Отмечено, что повышение уровня IL-6 наблюдается при обострениях желчнокаменной болезни, панкреатита, язвенной болезни, глютеновой энтеропатии, неспецифического язвенного колита, болезни Крона, вирусного гепатита, первичного билиарного цирроза [Царегородцева Т.М. Цитокины при заболеваниях органов пищеварения /Т.М. Царегородцева //Регистр лекарственных средств России: энцикл. лекарств и товаров аптечного ассортимента: офиц. сайт /группа компаний РЛС. - Москва, 2009. - 28 апр. - Режим доступа: http://www.rlsnet.ru/articles_426.htm].

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2014 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования характера поражения желчного пузыря у женщин, больных хроническим калькулезным холециститом, на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов интерлейкинов.

Источник информации: сайт Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования характера поражения желчного пузыря у больных хроническим калькулезным холециститом на основе данных о генетических полиморфизмах (IL-1А -889Т>С, IL-4 -584С>Т, IL-6 -174G>C), а именно у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа прогнозирования характера поражения желчного пузыря при ХКХ у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России, в зависимости от полиморфизмов генов интерлейкинов.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки характера поражения желчного пузыря у женщин, больных ХКХ, русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России в зависимости от наличия генетических вариантов полиморфных маркеров IL-1A -889Т>C, IL-4 -584С>Т и IL-6 -174G>C.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования характера поражения желчного пузыря у женщин, больных хроническим калькулезным холециститом, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной эстракции;

- генотипирование образцов ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров;

- прогнозирование у женщин с ХКХ крупного диаметра камня в случае выявления сочетания генотипов -889ТТ и -889СТ IL-1A либо генотипа -174СС IL-6, а в случае выявления генотипа -584СС IL-4 - увеличение толщины стенки желчного пузыря более 4 мм.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогнозирования характера поражения желчного пузыря у женщин, больных хроническим калькулезным холециститом, по наличию генетических вариантов полиморфных маркеров IL-1A -889Т>C, IL-4 -584С>Т и IL-6 -174G>C.

Изобретение охарактеризовано на следующих фигурах:

На фиг. 1 представлена дискриминация аллелей по локусу IL-1А -889 Т>С (rs 1800587), где 2, 3, 4 - -889ТТ IL-1А; 5, 6, 10 - -889СС IL-1А; 1, 7-9, 11-14 - -889СТ IL-1А.

На фиг. 2 представлена дискриминация аллелей по локусу IL-4 -584С>Т (rs 2243250), где - -584СС IL-4, - -584ТТ IL-4, - -584СТ IL-4, - отрицательный контроль.

На фиг. 3 представлена дискриминация аллелей по локусу IL-6 -174G>C (rs 1800795), где - гомозиготы по аллелю -174C, - гомозиготы по аллелю -174G, - гетерозиготы --174GC, - отрицательный контроль.

На фиг. 4 представлена связь генетических вариантов локуса IL-1А -889Т>С с диаметром камня у больных ХКХ женского пола.

На фиг. 5 представлены ассоциации генетических вариантов локуса IL-6 -174G>С с диаметром камня у больных ХКХ женского пола.

На фиг. 6 представлена связь генетических вариантов локуса IL-4 -584С>Т с толщиной стенки желчного пузыря у больных ХКХ женского пола.

На фигурах 2 и 3 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием уровня относительной флуоресценции (далее УОФ) для одного флуорофора на оси x, относительно УОФ для другого флуорофора на оси y на диаграмме дискриминации аллелей. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелям Т и G, зонд с красителем FAM - аллелю С.

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (-584СТ, -174GC).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелям -584Т, -174G (УОФ аллелей Т и G отложены по оси y).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелям -584С, -174С (УОФ аллеля С отложены по оси x).

• Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно: в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль.

Способ осуществляют следующим образом:

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.

Анализ всех генетических полиморфизмов интерлейкинов проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. Для ПЦР используют: ДНК-полимераза Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М», олигонуклеотидные праймеры и зонды, синтезированные фирмой «Синтол». Полимеразную цепную реакцию выполняют на амплификаторах «Терцик-МС4» (ДНК-технология) и IQ5 (Bio-Rad).

Генотипирование ДНК-маркеров производят следующими методами:

1. Метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (локус IL-1А -889Т>С). Генотипирование производят с помощью соответствующих эндонуклеаз. Реакция протекала в присутствии буферов и при температурных условиях, рекомендованных производителями эндонуклеаз - ООО «Сибэнзим» (Новосибирск). Продукты рестрикции фракционируют с помощью электрофореза в агарозных гелях различной концентрации и окрашивают в этидиум бромиде (фиг. 1).

2. Метод дискриминации аллелей согласно значениям величин уровня относительной флуоресценции (УОФ) каждого зонда проводят на амплификаторе «СFХ96» (локусы IL-4 -584С>T, IL-6 -174G>C) (фиг. 2, 3).

Возможность использования предложенного способа для оценки характера поражения желчного пузыря у больных хроническим калькулезным холециститом подтверждает анализ результатов наблюдений 249 больных хроническим калькулезным холециститом и 294 человек популяционного контроля. Общий объем исследуемой выборки составил 543 человека. Среди больных ХКХ 16,80% составили мужчины (41 человек), 83,20% - женщины (208 человек). В контрольной выборке (n=294) процентное соотношение было аналогичным: мужчины - 17,00% (50 человек), женщины - 83,00% (244 человек) (p>0,05).

В выборке больных и контроля включались индивидуумы русской национальности Центрального Черноземья России, не связанные между собой родственными связями. Пациентов относили к соответствующей группе больных ХКХ после подтверждения установленного диагноза с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования, в соответствии с обязательными диагностическими стандартами. Контрольная группа была сформирована при экспедиционном обследовании населения областей Центрально-Черноземного региона России: Красненского и Прохоровского районов Белгородской области, Репьевского района Воронежской области и Черемисиновского района Курской области.

Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществляли в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляли с использованием программы «STATISTICA 6.0».

Для оценки морфологических показателей желчного пузыря у больных ХКХ использовали результаты трансабдоминального ультразвукового сканирования. Признаки проявления хронического калькулезного холецистита при ультразвуковом исследовании определяются степенью воспалительных, пролиферативных, дегенеративных и склеротических процессов в стенке желчного пузыря [Руководство по ультразвуковой диагностике: пер. с англ. /Всемир. организация здравоохранения (Женева); ред. П. Е. С. Пальмер. - Женева: ВОЗ, 2000. - 334 с.].

Были проанализированы следующие морфологические характеристики желчного пузыря: продольный и поперечный размер, толщина стенки, диаметр холедоха, а также средний диаметр камней.

Изучение анализируемых количественных признаков показало, что их распределение в исследуемой группе больных не соответствует закону нормального распределения: значения критерия Шапиро-Уилка составили W=0,63-0,99; c уровнем их статистической значимости p<0,001. Для описания рассматриваемых количественных показателей, применялась медиана (М_е) и интерквартильный размах (Q25-Q75), а при сравнении пациентов с разными генотипами по анализируемым показателям использовался непараметрический метод - критерий Манна-Уитни [Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA /О. Ю. Реброва. - [3-е изд.]. - Москва: Медиа Сфера, 2006. - 305 с.].

Установлена связь генотипов -889ТТ и -889СТ гена IL-1А с большим диаметром камня (М_е=15 мм, Q25-Q75=10-20 мм). У пациенток с генотипом -889СС по этому локусу данный показатель составил М_е=12 мм, Q25-Q75=9-18 мм, р=0,009 (фиг. 4). Также с наибольшим диаметром камня ассоциирован и генотип -174СС IL-6 (М_е=16 мм, Q25-Q75=10-20 мм). У женщин с генотипами -174GG и -174GC IL-6 диаметр камня был достоверно (р=0,03) меньше (М_е=15 мм, Q25-Q75=10-20 мм) (фиг. 5). Выявлено, что генетический полиморфизм IL-4 -584С>Т связан с толщиной стенки желчного пузыря. У пациенток с генотипом -584СС толщина стенки желчного пузыря была наибольшая (М_е=4 мм, Q25-Q75=3-4,5 мм) по сравнению с женщинами с генотипами -584СС и -584СТ (М_е=3,5 мм, Q25-Q75=3-4 мм, р=0,03) (фиг. 6).

Таким образом, полученные данные указывают на важную роль полиморфных маркеров IL-1A -889Т>C, IL-4 -584С>Т и IL-6 -174G>C в формировании характера поражения желчного пузыря у женщин, больных ХКХ. Генотипы -889ТТ, -889СТ IL-1A и -174СС IL-6 определяют более крупный диаметр камня, а генотип -584СС гена IL-4 обуславливает увеличение толщины стенки желчного пузыря более 4 мм.

Примеры, подтверждающие осуществимость предложенного изобретения.

1. Генотипы -889ТТ и -889СТ IL-1А были выявлены у пациентки Г. При ультразвуковом исследовании у данной пациентки в желчном пузыре обнаружены конкременты крупного диаметра - 27 мм.

2. Генотип -174СС IL-6 был выявлен у пациентки К. При ультразвуковом исследовании у данной пациентки в желчном пузыре обнаружены конкременты крупного диаметра - 30 мм.

3. У пациентки Б. был выявлен генотип -584СС IL-4, при ультразвуковом исследовании у нее было обнаружено утолщение стенки желчного пузыря - 5 мм.

Использование данного способа позволяет прогнозировать характер поражения желчного пузыря у женщин, больных хроническим калькулезным холециститом, русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России, что будет способствовать реализации эффективных лечебных мероприятий у пациенток с более выраженным характером поражения желчного пузыря.