СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ БОЛИГОЛОВА ПЯТНИСТОГО (Conium maculatum L)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений, и может быть использовано в медицине для получения сырья, содержащего биологически активные вещества, а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за выделения ядовитых соединений в питательную среду.

Болиголов пятнистый (Conium maculatum) - растение, токсичные свойства которого определяют алкалоиды кониин, метилкониин, конгидрин, псевдоконгидрин, коницеин. Содержит также жирное масло, в состав которого входят глицериды петрозелиновой и петрозелидиновой кислот. Растение обладает болеутоляющим, успокаивающим, противосудорожным, противовоспалительным и очень сильным иммуностимулирующим действием, благодаря чему включено в большинство сборов трав для лечения практически всех заболеваний, и особенно онкологических. В 1990-е и 2000-е годы специалистами Северного государственного медицинского университета были запатентованы методы применения препаратов из болиголова при лечении саркомы и других опухолей (Патент РФ 2099068, опубл. 20.12.1997, МПК A61K 35/32, A61K 35/28).

Известен способ культивирования каллусной ткани Centaurea scabiosa 1 (Патент РФ 2458121, опубл. 10.08.2012, МПК C12N 5/04), включающий в себя получение каллусной культуры из эксплантов интактных растений путем выращивания эксплантов на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5-1 мг/л НУК (α-нафтилуксусной кислоты) и 0,2-0,5 мг/л БАП (6-бензиламинопурин). И выращивание полученной каллусной культуры в пластиковых чашках Петри со средой Мурасиге-Скуга без изменения ее состава на синем свету (380-560 нм).

Недостатком известного способа является то, что он был использован для культивирования только Centaurea scabiosa L, относящейся к семейству Asteraceae или Compositae (Астровые или Сложноцветные), в то время как Conium maculatum L относится к семейству Apiaceae (Зонтичные). Каллусную культуру выращивают в пластиковой чашке Петри на синем свету (380-560 нм), что требует дополнительного оборудования.

Известен также способ получения каллусной культуры Carum carvi L. (статья Iva Smykalova, Prokop Smirous Jr, Michaela Kubosiova, Nikol Gasmanova, Miroslav Griga. Doubled haploid production via anther culture in annual, winter type of caraway (Carum carvi L.) // ActaPhysiol Plant - 2009 - Vol. 31, pp 21-31). Каллусную культуру Carum carvi L получали из пыльников интактных растений, прошедших предварительную яровизацию в течение 3х недель при температуре 6°С и выращенных из семян в сосудах Митчерлиха с почвенной смесью при температуре 5-30°С с фотопериодом 16/8. Бутоны поверхностно стерилизовали, извлекали пыльники и помещали на агаризованную среду В5 или MS с добавлением 500 mg l-1 L-глутамина и 100 mg l-1 L-серина, а также различных концентраций и комбинаций стимуляторов роста (НУК, 2,4 - D, БАП) и источников углерода (один или в комбинации): 20, 60 и 100 г л^-1 сахарозы, 20 и 60 г л^-1 мальтозы.

Недостатком данного способа является то, что в качестве эксплантов для индукции каллусообразования используются пыльники, размеры которых у растений семейства Зонтичные невелики, что технически затрудняет получение объекта для каллусной культуры при масштабировании технологии для опытно-промышленного производства в достаточных количествах. Дополнительно в среду добавляют L-глутамин и L-серин, что усложняет приготовление питательной среды и увеличивает ее стоимость.

В литературных источниках способов получения каллусной ткани Conium maculatum L не было найдено.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа культивирования каллусной ткани болиголова пятнистого, перспективной в качестве возможного источника алкалоидов лекарственного действия, с целью оптимизации условий культивирования.

Поставленная задача решается тем, что культивирование каллусной ткани болиголова пятнистого включает в себя посадку семян в стерильный грунт, выращивание интактных растений в течение 1-2 месяцев с интенсивностью освещения 150 мкМ квантов/м²с, отбор эксплантов 3-4 недельного возраста, стерилизацию последовательно в 70% спирте 30 с и в 0,1% сулеме 4 мин, помещение кусочков стебля длиной 1,5-2 см на агаризованную среду Мурасиге-Скуга без добавления гормонов на 7-10 дней для контроля стерильности, выделение каллуса и посадку в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста НУК и 6-БАП в условиях ламинарного бокса, при этом каллус высаживают в возрасте 30 суток, а культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности 70% в темноте, после чего проростки переносят на 6 недель на агаризованную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1,5-2,5 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3-0,8 мг/л БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса.

Для проращивания семян болиголова используют готовый грунт (TERRA VITA), который увлажняют в железной емкости и ставят в стерилизационный шкаф на 30 мин. Остывший грунт выкладывают в посадочные контейнеры и производят засев нестерильными семенами болиголова. Посадочные контейнеры помещают на стеллажи. Растения выращивают при интенсивности освещения 150 мкМ квантов/м²с (люминесцентные лампы фирмы «Philips» - Нидерланды) и температуре 22-25°С в течение месяца. Берут нестерильные растения (с 3х недельного возраста), отсекают корень и листья, оставляя кусочек стебля длиной 1,5-2 см. В условиях ламинарного бокса растения последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 4 мин и помещают в пробирки на агаризованную среду MS, без добавления гормонов на 1 неделю для контроля стерильности.

Питательная среда Мурасиге-Скуга содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.

По истечении срока проростки переносят в пробирки на агаризованную среду MS с добавлением гормонов 2, 4 - D и 6-БАП для получения каллуса. По прошествии 6 недель происходит утолщение стебля и образование каллуса. В условиях ламинарного бокса производят выделение каллуса и посадку в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста - НУК (α-нафтилуксусная кислота) и 6-БАП.

Каллус высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С влажности - 70% в темноте.

Технический результат - получение каллусной культуры Conium maculatum L.

Примеры осуществления изобретения приведены ниже.

Пример 1

Для проращивания семян болиголова используют готовый грунт (TERRA VITA), который увлажняют в железной емкости и ставят в стерилизационный шкаф на 30 мин. Остывший грунт выкладывают в посадочные контейнеры и производят засев нестерильными семенами болиголова. Посадочные контейнеры помещают на стеллажи. Растения выращивают при интенсивности освещения 150 мкМ квантов/м²с (люминесцентные лампы фирмы «Philips» - Нидерланды) и температуре 22-25°С в течение месяца.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄×7H₂O 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводят до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄×4H₂O - 32,3 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 8,6 мг/л, Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO₄×5H₂O - 0,025 мг/л, CoCl₂×6H₂O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄×7H₂O - 37,3 мг/л, Na₂EDTA×2H₂O - 27,8 мг/л), CaCl₂×2H₂O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl₂×2H₂O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса размещают по культуральным сосудам.

Берут нестерильные растения (с 3-4х недельного возраста), отсекают корень и листья, оставляя кусочек стебля длиной 1,5-2 см. В условиях ламинарного бокса растения последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 4 мин и помещают в пробирки на агаризованную среду MS, без добавления гормонов на 7-10 дней для контроля стерильности.

В условиях ламинарного бокса в стерильную питательную среду добавляют 2, 4 - D (1,5 мг/л) и 6-БАП (0,3 мг/л) и размещают ее по культуральным сосудам. Проростки переносят в пробирки на агаризованную среду MS с добавлением гормонов для получения каллуса. По прошествии 6 недель происходит утолщение стебля и образование каллуса. В условиях ламинарного бокса производят выделение каллуса и посадку в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста - 2-НУК и 6-БАП.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.

Пример 2

Для проращивания семян болиголова используют готовый грунт (TERRA VITA), который увлажняют в железной емкости и ставят в стерилизационный шкаф на 30 мин. Остывший грунт выкладывают в посадочные контейнеры и производят засев нестерильными семенами болиголова. Посадочные контейнеры помещают на стеллажи. Растения выращивают при интенсивности освещения 150 мкМ квантов/м²с (люминесцентные лампы фирмы «Philips» - Нидерланды) и температуре 22-25°С в течение месяца.

Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO₃ - 1900 мг/л, NH₄NO₃ - 1650 мг/л, MgSO₄×7H₂O 370 мг/л, KH₂PO₄ - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводят до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л, MnSO₄×4H₂O - 32,3 мг/л, ZnSO₄×7H₂O - 8,6 мг/л, Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO₄×5H₂O - 0,025 мг/л, CoCl₂×6H₂O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO₄×7H₂O - 37,3 мг/л, Na₂EDTA×2H₂O - 27,8 мг/л), CaCl₂×2H₂O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl₂×2H₂O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса размещают по культуральным сосудам.

Берут нестерильные растения (с 3-4х недельного возраста), отсекают корень и листья, оставляя кусочек стебля длиной 1,5-2 см. В условиях ламинарного бокса растения последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 4 мин и помещают в пробирки на агаризованную среду MS, без добавления гормонов на 7-10 дней для контроля стерильности.

В условиях ламинарного бокса в стерильную питательную среду добавляют 2, 4 - D (2,5 мг/л) и 6-БАП (0,8 мг/л) и размещают ее по культуральным сосудам. Проростки переносят в пробирки на агаризованную среду MS с добавлением гормонов для получения каллуса. По прошествии 6 недель происходит утолщение стебля и образование каллуса. В условиях ламинарного бокса производят выделение каллуса и посадку в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста - 2-НУК и 6-БАП.

Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.