Результат интеллектуальной деятельности: НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ-ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ F ГЕНА ВИРУСОВ БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА КЛАССА I

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в диагностических целях идентификации вируса болезни Ньюкасла в вирусологии и ветеринарии, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению данного вируса.

Болезнь Ньюкасла является одним из серьезнейших заболеваний птиц, способным вызывать крупные падежи, причиняя огромный вред сельскому хозяйству и нанося серьезный экономический ущерб. Болезнь Ньюкасла это вирусное заболевание, которое вызывается вирусом болезни Ньюкасла (ВБН). Вспышки болезни Ньюкасла регулярно регистрируются по всему миру. В настоящее время систематический мониторинг ВБН на территории РФ отсутствует. Считается, что для защиты от этого инфекционного возбудителя вполне достаточно вакцинации птиц на птицефабриках и крупных птицефермах. В небольших частных хозяйствах птицы, зачастую, не вакцинируются совсем, что повышает опасность возникновения эпизоотий, при передаче вирулентного штамма от диких птиц домашним.

В связи с вышеперечисленным очевидно, что необходимо совершенствование диагностики, исследование циркуляции ВБН на территории РФ и близлежащих государств, а также комплексный анализ циркулирующих штаммов.

Эффективная диагностика вируса требует комбинирования различных методов, таких как анализ клинических симптомов (в том числе и гистологический анализ), выделение и наработка вирусного материала и серологический анализ. Детекция ВБН может быть осуществлена с помощью in situ гибридизации. Также весьма широко распространенным методом детекции ВБН является реакция торможения гемагглютинации (РТГА). И, хотя эти тесты относительно дешевы и методика их достаточно проста, они отнимают много времени и обладают относительно невысокой чувствительностью. Кроме того, при использовании РТГА, полученные результаты далеко не всегда могут быть однозначно интерпретированы и воспроизведены в другой лаборатории, вследствие отсутствия идентичной панели диагностических сывороток.

Также для анализа применяется иммуноферментный анализ (ИФА), который является более специфичным и более чувствительным, чем РТГА (Schelling et al., 1999) [1]. Первоначально в качестве антигена использовался сам вирус, но в этом случае невозможно было отличить естественно инфицированных птиц от искусственно зараженных. Применение моноклональных антител позволило преодолеть это затруднение. С появлением этого метода стало возможным отличать птиц, вакцинированных осповакциной, содержащей HN-комплекс ВБН, от птиц, зараженных ВБН. В качестве поверхностного антигена использовался NP-белок, синтезированный с помощью вектора на основе бакуловирусов.

Результат серологического анализа зависит от иммунного статуса животного. Большое количество вакцин на основе различных штаммов может сделать интерпретацию полученных результатов затруднительной. Новый, недавно появившийся штамм может не быть обнаружен имеющейся панелью антител. Подобные тесты могут демонстрировать невысокую воспроизводимость, что затрудняет их использование в диагностических целях (King & Seal, 1998) [2]. Тем не менее, эти методы детекции ВБН весьма широко распространены.

В настоящее время установлено, что целесообразно внедрение молекулярных методов анализа. Это позволяет более эффективно проводить диагностику ВБН и определение патотипов. Для проведения комплексного анализа использовалась гибридизация со специфическими зондами и специфические антитела, связывающиеся с патотип-специфичными сайтами ВБН (Aldous & Alexander, 2001) [3].

Добавление к ПЦР ступени обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) используется для наработки и последующего анализа F-гена различных штаммов ВБН. Метод ОТ-ПЦР применяется для детекции вирусной инфекции, с его помощью удается получить точные данные о присутствии РНК вируса в анализируемом образце, причем достаточно быстро (Gohm et al., 2000) [4].

Было установлено, что патогенность ВБН зависит от последовательности сайта расщепления белка слияния (F-белка) (Brown et al., 1999) [5]. Для мезогенного и велогенного патотипов сайт расщепления белка слияния состоит из двух пар двухосновных остатков аминокислот, разделенных глутамином: 111-Gly-Arg-Arg-Gln-Arg/Lys-Arg-116 и Phe в 117 положении, в то время как при лептогенном патотипе сайт расщепления содержит меньше остатков основных аминокислот, так как имеются замены в положениях 112 и 115 111-Gly/Glu-Gly-Lys/Arg-Gln-Gly/Glu-Arg-116, а в 117 положении находится Leu. Было показано, что разные сайты расщепления взаимодействуют с разными протеазами, и способность взаимодействовать с протеазами клетки хозяина, и обуславливает патогенность. Но, патотип, определенный по последовательности сайта расщепления белка слияния, зачастую не совпадает с результатами тестов патогенности, принятых в вирусологии. Это объяснятся наличием других факторов патогенности, например, активностью гемагглютинин-нейроминедазного комплекса, функциональным состоянием V-белка [5].

Альтернативой рестрикционному анализу стало секвенирование геномных фрагментов ВБН, что позволило исследовать аминокислотные замены в сайте расщепления белка слияния. Были также разработаны системы с применением вырожденных праймеров, что позволило провести ОТ-ПЦР в одной пробирке с последующим секвенированием и филогенетическим анализом штаммов. Этот метод с успехом был применен для контроля над велогенными штаммами. Точно таким же образом удалось определить различия между ВБН и пневмовирусом птиц (Kim et al., 2007) [6].

Методы со стадией секвенирования требуют дорогостоящего оборудования и специально обученного персонала. По этим причинам они не являются повсеместно распространенными, особенно в развивающихся странах, в которых ВБН представляет весьма серьезную угрозу. В настоящее время в таких странах, как Малайзия, для детекции ВБН в крупных масштабах используются тест-системы на основе ОТ-ПЦР в одной пробирке с последующим применением ПЦР с флуоресцентными зондами.

За рубежом для получения первичных последовательностей генов используется метод ОТ-ПЦР с ген-специфицными праймерами. Впоследствии, полученные в ходе данной реакции продукты используются в сиквенсовой реакции с использованием уже новых ген-специфических праймеров.

Данный метод не только трудоемок, но и, в связи с тем, что используемые в данном случае праймеры разработаны с учетом генетическом особенностей американской линии, неприменим для получения первичных последовательностей вирусов евразийской линии.

Молекулярно-биологический и филогенетический анализ гена белка слияния (F гена) используется для идентификации различных генетических вариантов (линий) вируса при проведении исследований в области молекулярной эпидемиологии. Фрагмент нуклеотидной последовательности F гена между 47 и 435 используется при проведении филогенетического анализа и построении дендрограмм. Кроме того, фрагмент, расположенный между М и F генами длиной в 695 п.н., используется как маркер патогености. Аминокислотные последовательности 112R-R-Q/R-K-R116 на С-конце белка F2 и фенилаланин в позиции 117 на N-конце белка F2 являются известными маркерами, обуславливающими вирулентность (King & Seal, 1998) [2].

Три олигонуклеотида-праймера использовались ранее для анализа белка слияния штаммов вируса NDV во время вспышки заболевания в Египте в 2006:

Однако недостатком является использование при их дизайне всего двух старых штаммов 1948 и 1986 годов - Beaudette С (GenBank Х04719) и Texas GB (GenBank GU978777).

При исследовании корейских патогенных ВБН был использован фрагмент 695 нуклеотидов. Праймеры для этого были разработаны в научных целях с использованием известных последовательностей ВБН, выделенных в Корее с 1949 по 2002 гг. (Lee, et al., 2004) [7].

При диагностике и анализе ВБН во время вспышек болезни в Пакистане были использованы олигонуклеотиды-праймеры для детекции М и F генов, разработанные до 2004 гг. (Munir et al., 2012) [8].

Для амплификации и секвенирования F гена ВБН во время эпизоотий в Швеции, использовались праймеры, модифицированные с учетом известных до 2010 года последовательностей ВБН в Европе (Munir et al., 2011) [9].

Недостатком вышеперечисленных разработок при работе с российскими вариантами ВБН, является использование при их дизайне устаревших последовательностей ВБН, вследствие чего их использование для идентификации современных вариантов вируса является затруднительным. К недостаткам также можно отнести отсутствие в выборке последовательностей российских вариантов ВБН при дизайне.

Таким образом, в настоящее время существует необходимость разработки адекватных праймеров для получения первичной структуры F гена вирусов болезни Ньюкасла первого класса с целью проведения филогенетического, аминокислотного анализа, диагностики и определения маркеров патогенного потенциала.

Задачей настоящего изобретения является создание более специфичного набора олигонуклеотидных праймеров, позволяющих получать первичные последовательности F гена вирусов болезни Ньюкасла первого класса и полную информацию о F генах вирусов болезни Ньюкасла, их принадлежности к той или иной генетической линии вируса, наличии нуклеотидных/аминокислотных замен в геноме патогена для дальнейшего проведения филогенетического, аминокислотного анализа, диагностики и определения маркеров патогенного потенциала.

Указанная задача по разработке синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения первичной структуры F гена вирусов болезни Ньюкасла класса I решена тем, что данный набор состоит из трех пар праймеров, имеющих следующую структуру (5′→3′): Fgene 1F , Fgene 560R , Fgene 471F , Fgene 1008R , Fgene 898F , Fgene 1663R и полностью покрывающих длину F гена и перекрывающихся между собой, что позволяет добиться получения полноразмерного ампликона гена F.

Техническим результатом является увеличение специфичности разработанных праймеров с учетом генетических особенностей современных штаммов ВБН, циркулирующих на территории Евразии. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют ограничивать манипуляции одноступенчатой процедурой проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработанные праймеры позволяют получить полную информацию о F генах вирусов болезни Ньюкасла, их принадлежности к той или иной генетической линии вируса, наличии нуклеотидных/аминокислотных замен в геноме патогена.

Разработанный набор праймеров позволяет получить полноразмерный участок F гена ВБН, а структура праймеров разработана с учетом генетических особенностей штаммов ВБН, циркулирующих в настоящий момент на территории Евразии.

Праймеры отличаются от ранее разработанных прототипов измененной последовательностью нуклеотидных остатков благодаря включению в процесс их дизайна последовательностей ВБН, выделенных вплоть до июня 2014 г. и опубликованных в международной базе данных GenBank, позволяющих, в отличие от прототипов, достигнуть специфичности к большему числу современных циркулирующих вариантов ВБН при получении первичной структуры F гена вирусов болезни Ньюкасла класса I.

Предлагаемое изобретение позволит не только проводить диагностику, но и получать данные о маркерах патогенности ВБН. Подобные разработки отсутствуют на отечественном рынке. Ранее при исследовании продуктов ОТ-ПЦР части М- и F-генов (продукт F-гена содержал сайт расщепления) рестрикционным анализом удалось разделить различные патотипы ВБН.

Методика конструирования заявляемых олигонуклеотидных праймеров

Дизайн структуры олигонуклеотидов осуществлялся путем сравнения первичных последовательностей гена F, кодирующего фьюжн-белок, различных штаммов ВБН, выделенных на территории Евразии и депонированных в международной базе данных GenBank. Для этого из базы данных GenBank было использовано свыше 100 последовательностей штаммов ВБН, а именно гена F. Последовательности были выровнены с помощью программного обеспечения Clustal W (Mega v5). Выбор участков для праймеров осуществлялся с учетом наибольшей консервативности районов гена. Анализ структуры праймера проводился с использованием программного обеспечения OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator.

Апробация праймеров была осуществлена с использованием 10 изолятов ВБН, выделенных от различных видов диких птиц на территории России. Было показано, что применение данных праймеров для получения первичных структур гена F ВБН обеспечивает синтез фрагментов ДНК рассчитанного размера в условиях ПЦР и сиквенсовой реакции. Специфичность продукта амплификации была подтверждена методом прямого секвенирования. На рисунке 1 приведена электрофореграмма с результатами ПЦР, проведенной с использованием разработанных олигонуклеотидов, где 1 - Fgene 898F/Fgene 1663R; 2 - Fgene 471F/Fgene 1008R; 3 - Fgene 1F/Fgene 569R; M - маркеры.

Характеристика набора праймеров и участков амплифицируемой геномной РНК

Праймеры фланкируют участки гена F класса I ВБН, кДНК которого не имеет полиндромных повторов нуклеотидов и не образует выраженных вторичных структур, не имеет протяженных G-C участков. Для пар праймеров расчетная температура плавления была близкой и составила Tm=610°C. Специфичность образующегося фрагмента кДНК устанавливали прямым секвенированием полученного фрагмента, что и было выполнено для десяти штаммов и изолятов ВБН, выделенных в Новосибирской, Омской области и Алтайском крае. Структура праймеров приведена в таблице 1.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Апробация набора разработанных олигонуклеотидов

Для оценки эффективности использования данного изобретения было использовано 10 заведомо положительных образцов на ВБН I класса. Сравнение изобретения проводили с широко используемой парой диагностических олигонуклеотидов на L ген 8487F и 8979R . О наличии в исследуемом материале ВБН судили на основании результатов метода ПЦР и последующего проведения электрофореза в агарозном геле.

Выделение РНК ВБН из вируссодержащей аллантоисной жидкости куриных эмбрионов производили с использованием коммерческого набора Promega SV Total RNA Isolation Kit согласно инструкции производителя. Постановка реакции обратной транскрипции производилась коммерческим набором Termo Scientific RevertAid Reverse Transcriptase согласно инструкции производителя и с использованием Random Hexamer праймера. Постановка ПЦР проводилась с использованием коммерческого набора Biolabs Quick-Load® Taq 2Х Master Mix согласно инструкции производителя. Наличие фрагмента ДНК определяли путем гель-электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле.

В результате проведенного эксперимента, все 10 образцов были положительны на ВБН при использовании разработанного набора олигонуклеотидов. При использовании ранее опубликованных олигонуклеотидов на L ген ВБН (Paldurai et al., 2014) [10], положительными оказались 9 образцов.

Пример 2. Диагностика вируса болезни Ньюкасла с использованием набора разработанных олигонуклеотидов в образцах от диких птиц

Для оценки эффективности использования данного изобретения в диагностических целях было исследовано 35 образцов (клоакальных смывов) от диких птиц. О наличии в исследуемом материале ВБН судили на основании результатов метода ПЦР и последующего проведения электрофореза в агарозном геле.

Выделение РНК ВБН из вируссодержащей аллантоисной жидкости куриных эмбрионов производили с использованием коммерческого набора Promega SV Total RNA Isolation Kit согласно инструкции производителя. Постановка реакции обратной транскрипции производилась коммерческим набором Termo Scientific RevertAid Reverse Transcriptase согласно инструкции производителя и с использованием Random Hexamer праймера. Постановка ПЦР проводилась с использованием коммерческого набора Biolabs Quick-Load® Taq 2Х Master Mix согласно инструкции производителя. Наличие фрагмента ДНК определяли путем гель-электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле.

В результате проведенного эксперимента, 2 образца оказались положительны на ВБН при использовании разработанного набора олигонуклеотидов. Образцы, положительные на ВБН, были использованы для дальнейшего молекулярно-биологического исследования (пример 3).

Пример 3. Получение первичной последовательности F гена изолятов ВБН с использованием набора разработанных олигонуклеотидов

Два изолята, диагностированные как ВБН, были использованы для получения первичной последовательности F гена изолятов ВБН с использованием набора разработанных олигонуклеотидов.

Выделение РНК ВБН из вируссодержащей аллантоисной жидкости куриных эмбрионов производили с использованием коммерческого набора Promega SV Total RNA Isolation Kit согласно инструкции производителя. Постановка реакции обратной транскрипции производилась коммерческим набором Termo Scientific RevertAid Reverse Transcriptase согласно инструкции производителя и с использованием Random Hexamer праймера. Постановка ПЦР проводилась с использованием коммерческого набора Biolabs Quick-Load® Taq 2Х Master Mix согласно инструкции производителя. Наличие фрагмента ДНК определяли путем гель-электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле. Выделение фрагментов ДНК осуществлялось коммерческим набором Qiagen Gel Purification Kit согласно инструкции производителя.

Определение нуклеотидной последовательности выделенного ПЦР фрагмента проводили на генетическом анализаторе Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130x1 согласно инструкции производителя с использованием разработанных праймеров. Чистка секвенирующей реакции производилась коммерческим набором Applied Biosystems BigDye X Terminator Kit согласно инструкции производителя. Нуклеотидные последовательности были анализированы с использованием программы Invitrogene ContigExpress и базы данных GenBank NCBI.

В результате с помощью разработанного набора олигонуклеотидов-праймеров были получены нуклеотидные последовательности F-белка двух изолятов ВБН (таблица 2).

Таким образом, предлагаемое изобретение позволит не только проводить диагностику, но и получать данные о маркерах патогенности ВБН. Подобные разработки отсутствуют на отечественном рынке.

Разработанные праймеры позволяют получить полную информацию о F генах вирусов болезни Ньюкасла, их принадлежности к той или иной генетической линии вируса, наличии нуклеотидных/аминокислотных замен в геноме патогена. Разработка заявленного набора праймеров позволила получить данные о некоторых генетических характеристиках ВБН, циркулирующих на территории Евразии среди диких птиц.

Использованные источники информации

1. Gohm D, Schelling Е, Audigé L, Thür В. Newcastle disease-seroepidemiologic study of a highly contagious epizootic in poultry and in wild birds in Switzerland. Schweiz Arch Tierheilkd. 1999; 141(12):549-58.

2. King DJ, Seal BS. Biological and molecular characterization of Newcastle disease virus (NDV) field isolates with comparisons to reference NDV strains. Avian Dis. 1998 Jul-Sep; 42(3):507-16.

3. Aldous EW, Alexander DJ. Detection and differentiation of Newcastle disease virus (avian paramyxovirus type 1). Avian Pathol. 2001 Apr; 30(2):117-28.

4. Gohm, D.S., B. Thur, and M.A. Hofmann. Detection of Newcastle disease virus in organs and faeces of experimentally infected chickens using RT-PCR. Avian Pathol. 2000. 29:143-152.

5. Brown, С.C, D.J. King, and B.S. Seal.. Comparison of pathology-based techniques for detection of viscerotropic velogenic Newcastle disease virus in chickens. J Comp Pathol. 1999. 120:383-389.

6. Kim, L.M., D.J. King, D.L. Suarez, C.W. Wong, and C.L. Afonso. Characterization of class I Newcastle disease virus isolates from Hong Kong live bird markets and detection using real-time reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol. 2007. 45:1310-1314.

7. Lee, Y.J., H.W. Sung, J.G. Choi, J.H. Kim, and C.S. Song. Molecular epidemiology of Newcastle disease viruses isolated in South Korea using sequencing of the fusion protein cleavage site region and phylogenetic relationships. Avian Pathol. 2004. 33:482-491.

8. Munir, M., M. Cortey, M. Abbas, Z.U. Qureshi, F. Afzal, M.Z. Shabbir, M.T. Khan, S. Ahmed, S. Ahmad, C. Baule, K. Stahl, S. Zohari, and M. Berg. Biological characterization and phylogenetic analysis of a novel genetic group of Newcastle disease virus isolated from outbreaks in commercial poultry and from backyard poultry flocks in Pakistan. Infect Genet Evol. 2012. 12:1010-1019.

9. Munir, M., A.M. Linde, S. Zohari, K. Stahl, C. Baule, B. Engstrom, M.R. LH, and M. Berg. Whole genome sequencing and characterization of a virulent Newcastle disease virus isolated from an outbreak in Sweden. Virus Genes. 2011. 43:261-271.

10. Paldurai A, Kim SH, Nayak B, Xiao S, Shive H, Collins PL, Samal SK. Evaluation of the contributions of individual viral genes to newcastle disease virus virulence and pathogenesis. J Virol. 2014 Aug; 88(15):8579-96. doi: 10.1128/JVI.00666-14.