Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ R(5mC)GY В ЗАДАННОМ ПОЛОЖЕНИИ ПРОТЯЖЕННОЙ ДНК

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной генетике и касается способа определения нуклеотидной последовательности (сайта) 5'-R(5mC)GY-373'-YG(5mC)R-5' (здесь и далее 5mC - 5-метилцитозин, R - А или G, Y - Т или С) в заданном положении протяженной ДНК.

Основным эпигенетическим механизмом, обеспечивающим регуляцию генной активности, служит метилирование ДНК, широко распространенное в живых организмах. У высших эукариот модификация ДНК происходит преимущественно в CG-динуклеотидах путем добавления метальных групп к цитозиновым остаткам в положении С5 пиримидинового кольца, что приводит к образованию 5-метилцитозиновых остатков (5mC) в составе ДНК. Метилирование ДНК играет важную роль в таких биологических процессах, как дифференцировка клеток и тканей, геномный импринтинг, инактивация мобильных элементов генома и других [Sontag LB, Lorincz МС, Georg Luebeck Ε. Dynamics, stability and inheritance of somatic DNA methylation imprints. J Theor Biol. 2006; 242(4):890-899.]. Аномальное de novo метилирование сайтов PuCGPy (с образованием последовательности Pu(5mC)GPy, где Pu=R-А или G, Py=Y-С или Т) осуществляется ДНК-метилтрансферазами человека DNMT3a и DNMT3b в регуляторных участках генов и повторяющихся элементов генома наблюдается в клетках пораженных тканей при ряде заболеваний, в частности при онкопатологиях. Определение степени модификации тех или иных участков генома в норме и патологии позволяет выявлять нарушения в регуляции экспрессии генов и имеет большой диагностический потенциал [de Caseres I.I., Cairus P. Methylated DNA sequences for early cancer detection, molecular classification and chemotherapy response prediction // Clin. Transi. Oncol. - 2007. - Vol. 9. - Р. 429-437]. Изучение метилирования ДНК также важно для понимания молекулярных механизмов онтогенеза, старения, приспосабливаемости организмов к изменениям среды обитания.

Известен способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК, включающий предварительный гидролиз исследуемой ДНК метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой Glal и последующую амплификацию в реальном времени с ПЦР-хелперами [Rand KN, Young GP, Но Τ, Molloy PL. Sensitive and selective amplification of methylated DNA sequences using helper-dependent chain reaction in combination with a methylation-dependent restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 2013 January; 41(1): e15.]. Использование хелперов, представляющих собой сложные олигонуклеотидные структуры, 3' половина которых комплементарна исследуемой ДНК до места предполагаемого гидролиза, а 5' конец кодирует последовательность для праймера, позволяет точно отметить место гидролиза GlaI, таким образом, наличие ПНР сигнала однозначно говорит о наличии последовательности Pu(5mC)GPy.

Недостатками известного способа являются длительность, дороговизна и ограниченные функциональные возможности. Так, каждый раунд амплификации содержит две стадии отжига и элонгации: на первой гибридизуется хелпер и затем с него достраивается последовательность ДНК, являющаяся комплементарной к праймеру, а далее, после денатурации, гибридизуется праймер и происходит дальнейшая наработка ампликона. Так как хелпер и праймер имеют схожие структуры, то между ними происходит сильная конкуренция, для уменьшения которой необходимо тщательно подбирать соотношение праймер/хелпер и использовать в структуре хелпера единичные замены нуклеотидов на инозин. Кроме того, подобная система отличается низкой эффективностью ПНР, длительностью времени реакции (для получения данных необходимо провести до 85 раундов ПЦР), высокой вероятностью преждевременного разложения компонентов реакционной смеси и необходимостью синтеза уникального хелпера для каждой исследуемой последовательности.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемому техническому решению является способ определения последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК, включающий получение образцов высокоочищенной ДНК; предварительную фрагментацию выделенной ДНК эндонуклеазой рестрикции, не имеющей сайта узнавания в амплифицируемом районе, в частности TaqI; гидролиз фрагментированной ДНК метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI; лигирование универсального олигонуклеотидного адаптера к гидролизованной ДНК с последующей амплификацией в реальном времени с использованием геномного праймера и зонда, комплементарных исследуемой ДНК и гибридного праймера, 5' конец которого комплементарен 3' концу ДНК у исследуемого места гидролиза GlaI, а оставшаяся часть комплементарна адаптерной последовательности; и составление заключения по появлению флуоресцентного сигнала в случае наличия последовательности R(5mC)GY [Патент РФ №2525710, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.08.2014 г.].

Недостатками известного способа являются длительность анализа, наличие нескольких разобщенных стадий и ограниченные функциональные возможности. Так, три независимых реакции, а следовательно, три акта пипетирования увеличивают риск кросс-контаминации исследуемых образцов и повышают вероятность ошибок, связанных с человеческим фактором. Подобная схема анализа плохо поддается автоматизации, что негативно сказывается на возможности применения метода для одновременного исследования большого количества образцов. Кроме того, для пометки мест гидролиза последовательности R(5mC)GY используется универсальный адаптер, структура которого подразумевает появление условий для правильного отжига гибридного праймера, в лучшем случае, на второй цикл реакции ПЦР, что приводит к существенному снижению эффективности анализа некоторых участков ДНК. Соотношение длин цепей универсального адаптера также не оптимально: длинная верхняя цепь (21 нуклеотид) обладает праймерными свойствами, что приводит к активному протеканию неспецифических реакций и ускоренному расходованию компонентов реакционной смеси.

Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение способа определения нуклеотидной последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК, расширение его функциональных возможностей и сокращение времени анализа.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК, включающем гидролиз высокоочищенной геномной ДНК метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI, лигирование универсального олигонуклеотидного адаптера с последующей амплификацией в реальном времени с использованием геномного праймера и зонда, комплементарных исследуемой ДНК и гибридного праймера, 3' конец которого комплементарен 3' концу ДНК от заданного места гидролиза GlaI, а оставшаяся часть комплементарна адаптерной последовательности, и составление заключения о наличии последовательности R(5mC)GY (где 5mC-5-метилцитозин, R-А или G, Y-Τ или С) по появлению флуоресцентного сигнала, согласно изобретению в качестве адаптерной последовательности используют универсальный олигонуклеотидный адаптер 5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5', а реакции гидролиза высокоочищенной геномной ДНК, лигирования универсального олигонуклеотидного адаптера и амплификации фрагментов геномной ДНК в реальном времени с использованием праймеров и зонда проводят в единой реакционной смеси с добавлением состава компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп.

Состав компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп, содержит β-меркаптоэтанол в концентрации 5-7 мМ, бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации (100-200) нг/мкл и бетаин в концентрации 0,4-0,6 М.

Для получения единой реакционной смеси берут не менее 0,3 нг исследуемой высокоочищенной геномной ДНК; состав компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп: β-меркаптоэтанол в концентрации 5-7 мМ, бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации (100-200) нг/мкл и бетаин в концентрации 0,4-0,6 М; реакционный буфер с рН 9.0: 50 мМ Tris-SO₄, 30 мМ КСl, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% Tween-20, (3-5) мМ MgCl₂, 0,5 мМ АТФ; 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов; (400-800) нМ универсального адаптера; смесь геномного и гибридного праймеров и зонда по 0,8 мкМ каждого; (1-3) е.а. метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы GlaI; (500-1000) е.а. высокоактивной Т4 ДНК-лигазы; (0,04-0,1) е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы.

Предлагаемый способ позволяет анализировать наличие метилцитозина в образцах, содержащих не менее 0,3 нг ДНК человека, что обусловлено ограничениями реакции ПЦР.

Концентрации биологических агентов, восстанавливающих S-S связи в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп, подобраны экспериментально и отражают диапазоны оптимумов для данной реакции, а именно: β-меркаптоэтанол в концентрации 5-7 мМ, бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации 100-200 нг/мкл и бетаин в концентрации 0,4-0,6 М.

Бетаин является важным продуктом, который выступает «донором» метальных групп и принимает участие в реакциях переметилирования. К группе бетаинов относятся различные подобные соединения, однако под названием «бетаин» обычно подразумевают триметилглицин (триметиламиноуксусная кислота) - триметильное производное глицина (http://vesvnorme.net/preparaty/betain.html); (http://finzim.ru/chto-takoe-betafin/betafin-donor-metilnyh-labilnvh-grupp/).

Существенными преимуществами предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:

1. Отсутствие предварительной фрагментации ДНК эндонуклеазой рестрикции TaqI или другой, не имеющей сайта узнавания в изучаемом регионе;

2. Гидролиз метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI, лигирование адаптера и реакция ПЦР происходят в одной реакционной смеси (в одной пробирке) за счет введения в указанную смесь состава компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп, что позволяет упростить способ и расширить его функциональные возможности: уменьшается время проведения анализа, снижается риск кросс-контаминации образцов, сокращается количество манипуляций со стороны исследователя, что позволяет одновременно анализировать большое количество образцов и, при необходимости, полностью автоматизировать процесс.

3. Использование адаптера 5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5', в котором в нижней цепи присутствуют фосфаты на 3'- и 5'-конце, позволяет создать условия для правильной гибридизации (правильному отжигу) гибридного праймера уже в первом раунде ПЦР, а также исключает возможность праймирования ПЦР непрореагировавшими молекулами верхней цепи адаптера (избавление от неспецифической амплификации) за счет использования адаптера с укороченной до 15 нуклеотидов верхней цепью.

Способ определения нуклеотидной последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК осуществляют следующим образом. Анализ наличия метилированной последовательности R(5mC)GY в заданном положении исследуемой ДНК проводят в единой реакционной смеси в объеме 20 мкл, для чего берут:

- не менее 0,3 нг исследуемой высокоочищенной геномной ДНК;

- состав компонентов, обеспечивающих восстанавление S-S связей в белках, стабилизирующих ферменты и являющихся донором метальных групп: β-меркаптоэтанол в концентрации 5-7 мМ, бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрации (100-200) нг/мкл и бетаин в концентрации 0,4-0,6 М;

- реакционный буфер с рН 9.0: 50 мМ Tris-SO₄, 30 мМ КСl, 10 мМ сульфата аммония, 0,01% Tween-20, (3-5) мМ MgCl₂, 0,5 мМ АТФ;

- 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов;

- (400-800) нМ универсального адаптера (5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5');

- смесь геномного и гибридного праймеров и зонда по 0,8 мкМ каждого;

- (1-3) е.а. метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы GlaI;

- (500-1000) е.а. высокоактивной Т4 ДНК-лигазы;

- (0,04-0,1) е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы.

Реакцию проводят в детектирующем амплификаторе по следующей программе: 25°С - 60 минут, 95°С - 5 минут, далее 5 циклов без детекции: 95°С - 10 сек, 61°С - 25 сек, 72°С - 5 сек; затем 40 циклов с детекцией (канал FAM) на стадии отжига: 95°С - 10 сек, 61°С - 25 сек, 72°С - 5 сек.

Появление флуоресцентного сигнала в ходе ПНР однозначно говорит о наличии последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК.

На фиг. 1 показаны кривые накопления продукта с метилированных ДНК с течением времени при определении последовательности R(5mC)GY в первом экзоне гена-онкосупрессора RARB. На фиг. 2 показаны кривые накопления продукта с метилированных ДНК с течением времени при определении последовательности R(5mC)GY в первом экзоне гена-онкосупрессора NEYROG1.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Определение последовательности R(5mC)GY в первом экзоне гена-онкосупрессора RARB.

Для анализа наличия последовательности R(5mC)GY была выбрана ДНК из клеток Raji (лимфома Беркитта), в которой гиперметилирована исследуемая область гена RARB, в качестве отрицательного контроля неспецифической ДНК была выбрана ДНК мыши линии А/Не.

Реакцию проводили в 20 мкл реакционной смеси, следующего состава: 15 нг исследуемой ДНК, 50 мМ Tris-SO₄, рН 9.0, 30 мМ КСl, 10 мМ сульфата аммония, 100 нг/мкл BSA, 0,01% Tween-20, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ АТФ, 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 400 нМ универсального адаптера (5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5'), смесь праймеров и зонда по 0,8 мкМ каждого, 1 е.а. метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы GlaI, 500 е.а. высокоактивной Т4 ДНК-лигазы и 0,1 е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы. Структура праймеров и зонда следующая: геномный - 5'-TTCAGAGGCAGGAGGGTCTATTC-3', гибридный - 5'-CCTGCTCTTTCATCGGTTC-3' (подчеркнута часть праймера, комплементарная исследуемой ДНК), зонд - 5'-FAM-TCCCAGTCCTCAAACAGCTCGCATGG-BHQ1-3'. Программа амплификации (для термоциклера CFX96 (Bio-Rad, США)): 25°С - 60 минут, 95°С - 5 минут, далее 5 циклов без детекции: 95°С - 10 сек, 61°С - 25 сек, 72°С - 5 сек; затем 40 циклов с детекцией (канал FAM) на стадии отжига: 95°С - 10 сек, 61°С - 25 сек, 72°С - 5 сек.

Параллельно с этим проводился анализ наличия последовательности R(5mC)GY в тех же ДНК согласно протоколу прототипа [1]. Праймеры и зонд использовались те же.

На фиг. 1 показаны кривые накопления продукта с метилированных ДНК с течением времени. Полученные данные говорят об одинаковой эффективности анализа наличия метилированных последовательностей R(5mC)GY в первом экзоне гена RARB при использовании предлагаемого метода и прототипа. Однако для проведения анализа по протоколу прототипа затраты времени составили ~6 часов, тогда как при использовании протокола изобретения результат был получен за 3 часа.

Пример 2. Определение последовательности R(5mC)GY в первом экзоне гена-онкосупрессора NEYROG1.

Для анализа наличия последовательности R(5mC)GY была выбрана ДНК из клеток Raji (лимфома Беркитта), в которой исследуемый район гена NEYROG1 гиперметилирован, в качестве неметилированного отрицательного контроля ДНК мыши линии А/Не.

Анализ ДНК проводили аналогично примеру 1, но использовали другие концентрации некоторых компонентов смеси. А именно: β-меркаптоэтанола 7 мМ, MgCl₂ 3мМ, универсального адаптера (5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5') 800 нМ, смесь праймеров и зонда по 0,4 мкМ каждого, 2 е.а. метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы GlaI, 1000 е.а. высокоактивной Т4 ДНК-лигазы и 0,04 е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы. Структура праймеров и зонда следующая: геномный - 5'-GCCTCGGCCGCTAATCGC-3', гибридный - 5'-CCTGCTCTTTCATCGGTCT-3' (подчеркнута часть праймера, комплементарная исследуемой ДНК), зонд - 5'-FAM-CGACCCCGCCTCTGTTTCACTGCC-BHQ1-3'. Амплификацию проводили по программе из примера 1.

Параллельно с этим проводился анализ наличия последовательности R(5mC)GY в тех же ДНК согласно протоколу прототипа [1]. Праймеры и зонд использовались те же.

На фиг. 2 показаны кривые накопления продукта с метилированных ДНК с течением времени. Сравнение пороговых циклов кривых (C_{t Raji (изобретение)}=24,27; C_{t Raji (прототип)}=26,07) показало, что в результате использования предлагаемого способа удалось проанализировать в ~3,5 раза больше последовательностей R(5mC)GY в изучаемой ДНК.

Таким образом, заявляемый способ более простой в реализации, позволяет расширить функциональные возможности, позволяя анализировать ДНК с большей эффективностью, и сокращает время анализа.